Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, Krebsstammzellen in vitro mit einer unabhängigen Anchorage-Kulturtechnik zu vermehren und dann die metabolischen Wirkungen neuartiger Krebsstammzell-Targeting-Therapien zu testen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine humane Pankreas-Adenokarzinom-Gewebeprobe in eine Einzelzellsuspension dissoziiert wird. Im zweiten Schritt wird das Tumorgewebe mit Enzymen weiter verdaut und dann auf eine Gelatineplatte ausgesät. Um die Fibroblastenzellpopulation zu entfernen, werden die isolierten Krebszellen dann in eine Multiwell-Platte mit extrem geringer Bindung ausgesät und mit dem interessierenden Medikament behandelt, um die metabolische Aktivität und Bildung der Tumorkugeln zu beurteilen.

Letztendlich kann das Medikament von Interesse bei immungeschwächten Mäusen mit patienteneigenen Xenotransplantaten eingesetzt werden, um die Wirkung des Medikaments in vivo zu validieren. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erforschung der Krebsstammzellbiologie und dient als erster Schritt für die Entwicklung neuer Therapien, die auf Krebsstammzellen abzielen. Ich selbst, ein Nachwuchsforscher am Center for Stem Cells in Cancer and Aging am Breast Cancer Institute, und Tini Cruz, eine Doktorandin aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Um Krebsstammzellen aus einem duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse in einer sterilen Biosicherheitswerkbank zu isolieren.

Verwenden Sie ein steriles Skalpell und eine Pinzette, um den menschlichen Tumor in einer 60 x 15 Millimeter großen Kulturschale zu zerkleinern, die einen Milliliter steriles PBS enthält, und fügen Sie bei Bedarf weitere drei bis vier Milliliter PBS hinzu, bis das Gewebe vollständig dissoziiert ist. Die Gewebesuspension wird in ein steriles konisches Röhrchen überführt und PBS bis zu einem Endvolumen von fünf Millilitern zugegeben. Anschließend wird die Probe mit einer Dissoziationszentrifuge mechanisch homogenisiert und das homogenisierte Gewebe mit Kollagenase bei 37 Grad Celsius verdaut.

Nach einer Stunde Zentrifugation reanimieren die Zellen und suspendieren das Pellet in 10 Millilitern vollständigem Medium. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb und schleudern Sie die Zellen wieder herunter. Diesmal Wiederbelebung des Pellets in fünf Millilitern eines CK Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur entfernen Sie den Lysepuffer der roten Blutkörperchen durch Zentrifugation und resuspendieren das Pellet in Krebsstammzellmedium.

Dann inkubieren Sie die Zellen auf einer mit Gelatine überzogenen Schale bei 37 Grad Celsius, um die meisten der sich schnell anheftenden Fibroblastenzellen zu entfernen. Nach einer Stunde wird der Überstand geborgen und die Anzahl lebensfähiger Bauchspeicheldrüsenkrebszellen quantifiziert, um die Bildung der Tumorkugel bei Krebs zu erleichtern. Bei der Anreicherung der Stammzellen werden die Zellen in dem entsprechenden Volumen des Krebsstammzellmediums auf eine Endkonzentration von zwei mal 10 bis drei Zellen pro Milliliter verdünnt und einige Minuten lang auf Eis gekühlt.

Nachdem Sie 500 Mikroliter PBS in die erste und letzte Reihe einer 24 Zellplatten mit extrem niedriger Bindung gegeben haben, suspendieren Sie die Zellen erneut durch Pipette und säen Sie einen Milliliter Zellen pro Vertiefung in die leeren Vertiefungen der Platte. Behandeln Sie vier Zellvertiefungen mit dem interessierenden Arzneimittel und mindestens vier Negativkontrollvertiefungen mit Vehikel. Dann inkubieren Sie die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.

Fügen Sie jeden zweiten Tag unserem Fahrzeug zu jedem der Brunnen eine frische Behandlung hinzu. Bestimmen Sie am fünften oder siebten Tag die Anzahl der gebildeten Tumorkugeln mit einem automatisierten Zellzähler, der die Identifizierung größerer Strukturen für die serielle Verpackung der Tumorkugeln ermöglicht. Verwenden Sie am siebten Tag ein 40-Mikrometer-Zellensieb, um die Kugeln zu ernten.

Als nächstes drehen Sie die Kugeln herunter und inkubieren sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Milliliter Trypsin, um das Pellet in eine einzellige Suspension zu dissoziieren. Expandieren Sie dann die Zellen für weitere sieben Tage, wie gerade gezeigt, um die Kugeln für die Messung ihrer reaktiven Sauerstoffspezies oder der ROS-Produktion nach der Dissoziation vorzubereiten, wie gerade gezeigt, drehen Sie die Kugeln herunter und resuspendieren Sie das Pellet in HBSS mit der entsprechenden Sonde. Nach einer 20-minütigen Inkubation im Dunkeln bei 37 Grad Celsius legen Sie die Zellen bis zur Analyse durch Durchflusszytometrie auf Eis, um die Kugeln für die Messung ihres Sauerstoffverbrauchs vorzubereiten.

Beschichten Sie zunächst eine 96-Well-Zellkulturplatte mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Zell- und Gewebekleber. Als nächstes dissoziieren Sie die Kugeln und das Trypsin wie gezeigt. Waschen Sie dann die Platte zwei- bis dreimal mit Wasser, um die überschüssige Klebeplatte zu entfernen, die einzelnen Zellen dreimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung.

In 150 Mikrolitern Sauerstoffverbrauchs-Assay-Medium, das Glukose und Natriumpyruvat enthält, kleben die Zellen durch Zentrifugation am Boden der Vertiefungen, bis das 100-fache G erreicht ist. Lassen Sie die Zentrifuge mit dem Abbruch stoppen. Kehren Sie dann die Ausrichtung der Platte um und wiederholen Sie die Drehung.

Inkubieren Sie die Zellen nun für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. Laden Sie in der Zwischenzeit die Importe der Assay-Patronen. A, B und C. Injizieren Sie 25 Mikroliter einer Konzentration von drei, sechs bzw. neun Millimolaren des Arzneimittels von Interesse und importieren Sie D bei 25 Mikrolitern einer mikromolaren Konzentration des mitochondrialen Inhibitors rone.

Wenn die Zellen fertig sind, kalibrieren Sie die Kartusche und laden Sie die Zellkulturplatte. Führen Sie schließlich den Assay mit dem Standardprotokoll des Mischens und Messens durch In diesen repräsentativen Experimenten verringerte die Behandlung von Stammzellen des Bauchspeicheldrüsenkrebses mit Metformin die Größe und Anzahl der Tumorkugeln stark. Darüber hinaus wurden diese Reduktionen von Kulturen der sekundären und tertiären Sphäre gezeigt.

Selbst wenn nur die primäre Sphärenkultur mit Metformin behandelt wurde, wirkt Metformin Berichten zufolge als mitochondrialer Inhibitor. In diesem Experiment wurde beobachtet, dass das Medikament eine schnelle und dosisabhängige Abnahme des Sauerstoffverbrauchs in den Tumorzellen induziert, die mit seiner Fähigkeit zur Induktion der ROS-Produktion korreliert. Wichtig ist, dass mit Metformin behandelte Mäuse im Vergleich zu Kontrolltieren eine kurzfristige, aber signifikante Verringerung des Fortschreitens des Pankreas-Adenokarzinoms aufweisen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man frische menschliche Tumore dissoziiert. Isolierung von primären Krebszellen, die als Kugelbildungskultur eingerichtet werden, und Bewertung der metabolischen Aktivität von Stammzellen des Bauchspeicheldrüsenkrebses.