Name: Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Lernen Sie die Expansion von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Stammzellen mittels ankerunabhängiger Kulturtechnik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Metformin-Effekten auf Tumorsphären und Sauerstoffverbrauch.

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Die vorliegende Studie wurde unterstützt durch einen ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233460), dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7 / 2007-2013) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr 256974 (EPC-TM-NET) und keine 602.783 (CAM-Pac ), der Subdirección General de Fomento y Evaluación de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 &amp; PI12 / 02.643) und die Programa Nacional de internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien). E. Lonardo wurde von Roche Fellowship unterstützt. M. Cioffi wurde von der La Caixa Predoctoral Stipendienprogramm unterstützt.

Menschen PDAC Tumoren wurden mit schriftlicher Einwilligung (Comunidad de Madrid, Spanien (CP CNIO-CTC-11 erhalten. - CI 11/103-E) Implantation menschlicher Pankreastumoren in immundefizienten Mäusen bedarf der Zustimmung des Institutional Review Board sowie Institutional . Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Die Verfahren von Xenotransplantat Pankreastumor Mausmodelle müssen in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen gesetzlichen Bestimmungen durchgeführt werden (, Madrid in Spanien, hier Ethikkommission des Instituto de Salud Carlos III Protocol PA 34_2012). 1. Kultur Medien <ol><li> Bereiten Komplettmedium. <ol><li> Ergänzen RPMI-Medium mit 10% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin. Für 500 ml RPMI dazu 55 ml hitzeinaktiviertem FBS und 6 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml, 100 x). </li><li> Lagern Sie das Komplettmedium bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten CSCs Medium. <ol><li> Ergänzen Sie die Serum-freien DMEM / F12 medium mit 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM Glutamin. </li><li> Bewahren Sie die CSC Medium bei 4 ° C. B27 (1:50) und 20 ng / ml bFGF wird frisch auf dem Medium vor jedem Versuch zugesetzt. HINWEIS: Die Zugabe von B27 wurde gezeigt, dass Tumorkugelbildung zu erhöhen und die mehreren Passagen der Kugel 32 Kulturen aufrechtzuerhalten. Die Zusammensetzung des Mediums ist ein entscheidender Schritt und muß für jeden Zelltyp in Kultur getestet werden. Wir empfehlen Tests Selbsterneuerung und Differenzierung Kapazität von Kugeln und die Expression von CSC Marker mittels Durchflusszytometrie analysiert (dh CD133 + und CD44 +). </li></ol></li><li> Bereiten Extracellular Flux Assay-Medium. <ol><li> Diese spezielle Medium ist basal DMEM 5030 enthält Vitamine, Aminosäuren und andere Ergänzungen, aber ohne Glutamin, Glukose, Pyruvat und Hydrogencarbonat. </li><li> Für das laufende Test, ergänzen das Medium mit 2 mM Glutamin, 8 mM Glucose und 2 mM Natriumpyruvat zu einer vollständigen mitochondrialen Stoffwechselaktivität. HINWEIS: Die Abwesenheit von Natriumbicarbonat ist wichtig, um die genaue Messung der extrazellulären Ansäuerung der Zellen in Kultur zu wachsen, da reguläre Medium, enthaltend Bicarbonat wird pH-Schwankungen während der Assay-Puffer. Darüber hinaus ist die Verwendung eines Grundmedium ermöglicht eine genaue Kontrolle der Konzentration von L-Glutamin (L-alanyl-Glutamin) Glucose oder Natriumpyruvat für unterschiedliche Testbedingungen und / oder von Anwendungen notwendig. </li></ol></li></ol> 2. Sphere Forming Assay und Analyse HINWEIS: Alle Gewebekulturprotokolle und Manipulationen müssen mit sterilen Techniken mit großer Aufmerksamkeit die sauberen, Reinigungsmittelfreie, sterile Gläser durchgeführt werden. Vor der Verwendung vorge warmen alle mittleren und Lösung in einem 37 ° C Wasserbad (alternativ können Sie Medium und Lösungen auf RT vorgewärmt verwenden). Erhalten Menschliche PDAC Tumoren wie vorher beschrieben 21. <ol><li> Isolierung von CSCs von Menschen PDAC (Abbildung1) <ol><li> In einer sterilen biologischen Sicherheitswerk Übertragung der menschlichen PDAC Gewebes auf ein 60 x 15 mm-Kulturschale, die 1 ml steriles 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Hackfleisch, den Tumor in kleine Stücke (1-5 mm) mit einer sterilen Skalpell und Pinzette. </li><li> 1 ml sterile 1X PBS in die Kulturschale und wiederholen den Verreiben Schritt, bis das Gewebe vollständig dissoziiert, regelmäßig das erfordert 3-4 Runden. Übertragung der Gewebesuspension (oben bis zu einem Endvolumen von 5 ml mit 1X PBS) in ein steriles Röhrchen und mechanisch homogenisieren mit Dissociator wie gentleMACS. </li><li> Inkubieren des homogenisierten Gewebes mit Kollagenase (Verwendung 2,5 mg / ml Kollagenase in 1X PBS) für 60 min bei 37 ° C und anschließend für 5 min bei 900 x g zentrifugieren. Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 10 ml vollständigem Medium. Filtern der Zellsuspension durch ein 40 um-Sieb und Zentrifuge für 5 Minuten bei 900 x g. </li><li> Dekantieren Sie den Überstand und resuspendierenPellet mit 5 ml roter Blutzellen Lysepuffer (Ammoniumchlorid-Kalium, ACK), und Inkubation der </li><li> Das Pellet in CSCs Medium Platte auf mit Gelatine beschichtete Schale, und bei 37 ° C für 1 Stunde. Dieser Schritt wird die meisten der Fibroblastenzellen, die sich schnell an der Platte zu befestigen entfernen. </li><li> Die Platte aus dem Inkubator und vorsichtig erholen Zellsuspension und Quantifizierung der Zahl der lebensfähigen (Trypanblau-negative) Zellen mit einer Zählkammer. Zu diesem Zweck mischt vorsichtig der Suspension und einer Pipette 20 ul der Suspension in ein Eppendorf-Röhrchen. In 20 ul (1: 1-Verhältnis) von Trypanblau auf die Zellen in der Mikrozentrifugenröhrchen und gut mischen. Pipette ca. 10 &amp; mgr; l der Mischung auf die Zählkammer. </li><li> Zählen Sie alle klar Zellen innerhalb der vier Quadranten der Ecke der Zählkammer für Lebendzellzahl. Hinweis: Die Überlebensfähigkeit und Ausbeute der Zellen können sich zwischen Tumorproben variieren. Für PDAC Proben Lebensfähigkeit reicht regelmäßig between 45-70% und Gewebestücke von makroskopischer Tumorprobe mit einem Durchmesser von 3-5 mm sollte auf etwa 5x10 6 lebensfähigen Zellen zu erhalten. </li></ol></li><li> Sphere Formation Assay und Metformin-Behandlung <ol><li> Nehmen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen und fügen Sie den entsprechenden Volumen von CSCs Medium, um eine Zellkonzentration von 2.000 Zellen / ml herzustellen. Die Zellsuspension nicht halten auf dem Eis nicht länger als 1 Stunde und gut gemischt vor dem Beschichten. </li><li> Fügen Sie 500 ul 1X PBS, um die erste und die letzte Zeile einer 24-Well-Platte für die Befeuchtung, um zu helfen mittlere Verdunstung zu minimieren. Saatgut der Zellen in Ultra-Low Befestigungs Zellen Platten mit einer Dichte von 2.000 Zellen pro Vertiefung in 1 ml Tumor Sphäre Medium (2.000 Zellen / ml). HINWEIS: Die Anzahl von Zellen für Tumorkugelbildung Assays verwendet werden, können zwischen Tumortypen variieren. </li><li> Behandlung von mindestens 4 Vertiefungen mit Vehikel (negative Kontrolle) und 4 Vertiefungen mit jeder zugewiesenen Behandlung, z. B. 3 mM von Metformin. PlAss der Zellen im Brutschrank auf 37 ° C eingestellt und versorgen die Zellen mit 5% CO 2 für eine Woche. ANMERKUNG: Das Medium sollte nicht um die ungestörte Bildung von Tumor Kugeln erlauben geändert werden, jedoch können mit Wachstumsfaktoren täglich nachgefüllt werden, wie sie in einem Kulturmedium nicht stabil sind. </li><li> Jeden zweiten Tag hinzuzufügen Behandlung, z. B. 3 mM von Metformin oder ein Fahrzeug zu jeder der Vertiefungen. Beurteilung der Zahl der gebildeten Kugeln Tumor nach 5 und / oder 7 Tage unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler, der zum Zählen der größeren Strukturen (Figur 2) ermöglicht. ANMERKUNG: Nur Tumor Kugeln mit mindestens 40 &amp; mgr; m in Betracht gezogen werden und können so klein kategorisieren (40-80 um) oder groß (80 bis 120 &amp; mgr; m) sind. Die Ergebnisse können als Prozentsatz der Tumor Kugeln geteilt durch die Anfangszahl der Zellen beimpft (zB 2.000 Zellen) dargestellt werden. </li></ol></li><li> Serielle Passagierung von First Generation Tumor Spheres <ol&gt; <li> Nach 7 Tagen Inkubation Ernte der Tumor Kugeln wurde mit einem 40 &amp; mgr; m Zellsieb und zentrifugieren für 5 min bei 900 · g bei RT. </li><li> Distanzieren des Pellets von Tumorsphären auf einzelne Zellen unter Verwendung von Trypsin, und erweitern Sie dann die erhaltenen Einzelzellsuspension Zellen wieder für weitere 7 Tage, wie oben beschrieben (siehe 2.2). </li></ol></li></ol> 3. Stoffwechselanalyse (ROS Produktion und Sauerstoffverbrauch) <ol><li> ROS-Produktion <ol><li> In diesem Protokoll haben wir Carboxy-DCFDA als Beispiel verwendet, um ROS-Produktion zu messen, da es sich um eine kostengünstige, schnelle und weit verbreitete Sonde für ROS-Erkennung. Es gibt jedoch mehrere andere Sonden und Methoden, die für diesen Assay verwendet werden kann. </li><li> Behandlung von Tumor-Kugeln mit Metformin als in 2.2 für die zugeteilte Menge an Zeit beschrieben. Am Ende der Behandlung, Ernte Tumor Kugeln wurde mit einem 40 &amp; mgr; m Zellsieb Zentrifugation der Zellen bei 900 g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 1 ml trypsin. Inkubieren 20 min bei 37 ° C. </li><li> Sobald Zellen vereinzelt, Zentrifuge bei 900 xg und Resuspendieren der Zellen in HBSS, die 2,5 &amp; mgr; M Carboxy-DCFDA. Die Zellen für 20 min bei 37 ° C im Dunkeln. </li><li> Vor der Zytometrie Analyse fließen schützen gefärbten Zellen von Licht als Carboxy-DCFDA können Foto-oxidiert was falsch positive Ergebnisse sein. Zeigen Röhrchen auf Eis bis zur Analyse. HINWEIS: carboxy-DCFDA fluoreszierend ist nach Reaktion mit einer Vielzahl von reaktiven Sauerstoff und Stickstoffspezies, die in FL1 detektiert (Ex 488 nm, Em 520 nm..). </li></ol></li><li> Sauerstoffverbrauchsmessung <ol><li> Für dieses Protokoll, werden wir die extrazelluläre Flux Analyzer System vom Seahorse Biosciences verwendet, als Beispiel. Beschichtung der gewünschten Zellkultur-Platte mit einer Lösung von 22,4 &amp; mgr; g / ml von Zell- und Gewebekleber für 20 min bei RT. Mit Wasser spülen die Brunnen 2 - 3-mal vor der Aussaat der Zellen. </li><li> Am Ende der Behandlung mit der Ernte Tumorsphären einen 40 &amp; mgr; m Zellsieb Zentrifugation der Zellen bei 900 g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 1 ml Trypsin. Inkubieren für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Platte vereinzelnden Zellen in der Zellkulturplatte in einer Dichte von 30.000 Zellen / Well für eine Platte mit 96 Vertiefungen (Endvolumen 150 ul). Resuspendieren der Zellen in Sauerstoffverbrauch Assaymedium, enthaltend 8 mM Glucose und 2 mM Natriumpyruvat enthielt. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen an den Boden des Bohrlochs durch Spin-Zentrifugation der Brunnen bis 100 · g erreicht ist und lassen Sie dann die Zentrifuge Stopp mit Bremse ab. Kehren Sie die Ausrichtung der Platte und wiederholen Sie den Vorgang. Übertragen der Platte an einem 37 ° C Inkubator ohne Zugabe von CO 2 für 30 min. </li><li> In der Zwischenzeit, bereiten die Patrone für den Assay. Jede Vertiefung hat 4 verschiedene Einspritzventile zu laden (25 ul / Hafen): <ol><li> Port A: Metformin. Um eine Endkonzentration von 3 mM in den Brunnen zu erhalten, bereiten Sie einen 8x-Lösung (24 mM) als letzte Band wird 175 seinul nach Injektion von Anschluss A </li><li> Port B: Metformin. Bis 3 mm hinzuzufügen und erhalten eine Endkonzentration von 6 mM in den Brunnen, bereiten eine 9x-Lösung (27 mM) als das Endvolumen 200 ul wird nach der Injektion von Port B sein </li><li> Port C: Metformin. Bis 3 mm hinzuzufügen und zu erhalten, eine endgültige Konzentration von 9 mm in den Brunnen, bereiten ein 10-fach-Lösung (30 mM) als letzte Band wird 225 &amp; mgr; l nach der Injektion von Port C. sein </li><li> Port D: Rotenon 11 uM bis 1 uM als Endkonzentration in der Vertiefung (11x) zu erhalten. Hinweis: Rotenon Rest mitochondriale Aktivität vollständig inhibiert. </li></ol></li><li> Kalibrieren Sie die Patrone und laden Sie die Zellkulturplatte. Führen Sie den Test mit dem Standardprotokoll von Misch- und Messung. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der Inhibierung der Gesamt mitochondriale Atmung von Metformin als der Prozentsatz der Hemmung mit Rotenon (als 100%) erhalten erreicht. </li></ol></li></ol> 4.Xenograft Modell für menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebs bei immungeschwächten Mäusen HINWEIS: Bestellen Sie eine ausreichende Zahl von weiblichen athymischen Nackt oder andere, immungeschwächten Mausmodellen wie NOD-SCID, SCID-Beige oder NSG für die Versuche 33. Autoklaven alle chirurgischen Instrumente vor dem Experiment und es ihnen ermöglichen, auf RT vor dem Gebrauch abkühlen. Zur subkutanen Tumoren wir ein Minimum von 4 Mäusen pro Bedingung mit einem Tumor pro Flanke für insgesamt 8 Tumoren. <ol><li> Xenograft Transplantation <ol><li> Bereiten Tumorstücke aus menschlichen Pankreaskrebs Gewebeproben. Übertragen des Tumors in eine Petrischale und sezieren das Gewebe in kleine Stücke (2 mm im Durchmesser, ca. 8 mm 3) mit einem Skalpell und Pinzette, um das Gewebe zu halten. Tauchen Sie die erhaltenen Stücke in gallertartigen Proteingemisch-Lösung auf Eis gehalten. </li><li> Betäuben Mäusen mit 1-3% Isofluran oder andere inhalative oder injizierbaren Anästhetika. HINWEIS: Vor Beginn der chirurgischen procEDURE, sicherzustellen, dass die Mäuse vollständig Bewusstsein durch die Stimulierung der Bauchhaut verloren geht oder schleppt mit einem Paar von Splitterzangen. Bewerben Augensalbe zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Sobald die Betäubung wirksam geworden ist, wischen Sie die Rückseite der Mäuse mit ethanolhaltigen Haut antiseptisch. Verwalten Buprenorphin (0,05 mg / kg KG) vor der Operation, um postoperative Analgesie zu gewährleisten. </li><li> Heben Sie die Rückseite der Haut mit einer Pinzette, einen 0,7 bis 1,0 cm langen Schnitt mit steriler Mikroscheren und dann unverblümt bereiten einen kleinen subkutanen Tasche, in der ein Stück des Patienten stammenden Bauchspeicheldrüsenkrebs Gewebe eingelegt (~ 8 mm 3). </li><li> Schließen Sie die Wunde mit 1-2 Hautklammern. Entfernen Sie sie nach 7 Tagen. Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige und halten sie auf einem Heizkissen oder unter einer Wärmelampe, bis sie wieder voll aktiv. </li><li> Nach der Tumorimplantation, überwachen die Mäuse mindestens zweimal wöchentlich für das Tumorwachstum und die allgemeine Anzeichen entstehenden Morbidität wie gekräuselte Fell, hunched Haltung und Unbeweglichkeit. </li><li> Sobald Tumoren eine durchschnittliche Größe von 200 mm 3 erreicht hat, werden die Mäuse mit jeweiligen Behandlungen randomisiert. Verwalten Fahrzeug oder Metformin täglich via ip Injektionen (150 mg / kg KG) oder über das Trinkwasser (150 mg / kg KG) bei vergleichbaren Behandlungseffekte. </li><li> Überwachen Tumorlast mit einer Schieblehre und berechnen Tumorvolumen einmal pro Woche (Messung der Tumorvolumen = 1/2 Länge × Atem x Breite). </li><li> Opfern die Mäuse einmal Tumoren 1 cm Durchmesser erreicht oder Mäusen beginnen Anzeichen von Schmerzen oder Krankheit wie oben angegeben. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offen zu legen.

Mit dem Aufkommen und anschließende Validierung des CSC-Konzept für viele Tumoren hat sich auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung neue Impulse für die Entwicklung von effizienteren Krebstherapien und in der Folge die Reduzierung von Risiken für Rezidiv gewonnen, mit dem Potenzial. Allerdings ist der Bereich CSC noch in einem frühen Zustand und es muss mehr in Bezug auf das Verständnis CSC Ursprung und Ausbreitung, und ihre Rolle bei der Gestaltung der Tumorarchitektur und die Förderung der Metastasen erreicht werden. In diesem Zusammenhang ist die Verwendung von reproduzierbaren und sinn CSC Assays sowie die informierte Interpretation der erhaltenen Daten ist ein entscheidender Bestandteil für unser Verständnis von CSC Biologie. Von vielen biologischen Perspektiven hat Sphäre Bildung als äußerst wertvoll Test hervorgegangen; dennoch Benutzer sollten sich bewusst sein, seine Grenzen, um ihre experimentellen Ergebnisse richtig zu interpretieren. Ein wichtiger Aspekt, sogar vor der Bewertung der Kugel forma betrachtention Daten ist der Ursprung der untersuchten Probe, da die aus frischen Patienten stammende Proben erhaltenen Ergebnisse wesentlich verschieden von denen von etablierten Tumorzelllinien erhalten werden. Klassischen Kugelbildung Assays beinhalten Impfen Zellen bei klonaler Dichte in ultraniedriger Befestigungsplatten und Auswerten Kugelbildung in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und / oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF) angereichertes, aber serumfreien Medium 21, 34. Die Zusammensetzung des Kulturmediums ist ebenfalls ein wichtiges Thema, das zu berücksichtigen. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass das DMEM / F12 mit B27, bFGF und Glutamin in Abwesenheit von Serum ergänzt war ein optimales Medium in undifferenzierten Bedingungen wachsen, erweitern und Aufrechterhaltung der CSC. Wir haben festgestellt, dass in diesem Kulturbedingung (mittel und Suspension) exprimieren die Zellen hohe Mengen an Krebsstammzellmarker (einschließlich CD133 +, CD44 + und CD24 +) und nicht zum Ausdruck bringen Differenzierung assoziierten Proteinen (CK-20 Und CK-19). Eine der grundlegenden Annahmen für diese Tests ist, dass jede Kugel ist klonalen, dh führt eine Kugel aus der Erweiterung eines einzelnen Stammzelle. Allerdings sind Kugeln eigen dynamische Strukturen, die anfällig für selbst bei geringen Aussaatdichte 35 zu verschmelzen sind. Plating-Zellen ist ein wichtiger Schritt in der Protokoll und die Dichte einer Zelle / Vertiefung kann sicherlich die Aggregation Problem zu umgehen. Aber auch für prospektiv sortiert Vorläuferzellen, diese regelmäßig zu sehr niedrigen Bildungssphäre durch geringe Eigensphäre Bildungsaktivität und kann auch beschränkt auf autokrine Stimulation durch Verdünnungseffekte zurückzuführen. Nach unserer Erfahrung haben wir beobachtet, dass nur 30% der Zellen ausplattiert können Kugeln bilden. Wir empfehlen, mindestens 100 Zellen / Vertiefung, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Andere Kulturmethoden, um das Wachstum CSC auf festen oder halbfesten 3D-Kulturen (zB auf der Basis, basierend auf mAtrigel, Kollagen oder Methylcellulose). Diese Methoden wurden verwendet, um Zellmobilität und anschließende Zellaggregation 36 zu begrenzen. Jedoch trägt jeder dieser Matrizen ihre eigenen Grenzen. So ist zum Beispiel Matrigel ein lösliches Basalmembran aus Engelbreth-Holm-Swan (EHS) isoliert Tumor und obwohl der Extrakt ähnelt dem komplexen extrazellulären Tumorumgebung in vielen Geweben gefunden wird, enthält es mehrere mehr oder weniger definierten Wachstumsfaktoren, die oft macht mechanistische Studien für spezifische regulatorische Elemente sehr schwierig. Ein weiterer Punkt der Überlegung ist, dass Kugel bildenden Kapazitäten und Stammzellfunktionen sind nicht austauschbar 34 Begriffe. Während bestimmte Stamm- und Vorläuferzellen wurde gezeigt, dass Kügelchenbildungsfähigkeit 37, das Versagen der Kugeln in vitro zu erzeugen in vivo nicht Stammzellen / Vorläuferfunktion auszuschließen aufweisen. Beispielsweise ruhenden Stammzellen kann einfach nicht auf die extrazelluläre Signale durch das zur Verfügung gestellt zu reagierenIn-vitro-Kulturbedingungen ausgewählt. Somit langfristig in vitro als auch in vivo Selbsterneuerungskapazität gereinigte Zellpopulationen, bevorzugt während serielle Passagierung sollte, um zu beweisen oder zu widerlegen Stammzellenfunktion beurteilt werden. In diesem Zusammenhang ist die Fähigkeit, unterschiedliche Populationen von Stammzellen und Vorläuferzellen prospektiv und gleichzeitig ausbreiten ein entscheidender Aspekt der Kügelchenbildungsassay und macht diesen Test für den Bereich CSC sehr wertvoll; solange seine Grenzen sind im Kopf für die Interpretation der gewonnenen Daten gehalten. Sphere bildenden Tests sind weit verbreitet, um rückwirkend identifizieren Stammzellen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung auf Einzelzellebene in vitro. Die Entdeckung von Markern, die die prospektiven Isolierung von Stammzellen und deren Nachkommenschaft, die aus ihrer in vivo Nische ermöglichen können die funktionellen Eigenschaften der gereinigten Populationen zu definieren. Die combination der Sphäre Bildungstest und der FACS ist eine erfolgreiche Strategie, um Zellen aus festem Gewebe zu isolieren oder anzureichern spezifische Subpopulationen von PDAC in Kultur. Zum Beispiel die gleichzeitige Expression von EpCAM, CD24 und CD44 definiert eine Subpopulation von CSCs in der Lage sein: Selbsterneuerung, zu differenzieren und zu initiieren einen Tumor, was die Heterogenität des ursprünglichen Tumors. Hermann et al. zeigte, dass CD133 + Zellen besaß Augmented proliferative Kapazität und CSC verfügt über 15. Andere Marker zur Charakterisierung des CSCS verwendet: ALDH- 1 (Aldehyd-Dehydrogenase-1) Expression mit hoch tumorigenen Zellen im Pankreaskarzinom 38 zugeordnet ist; Zellen in der Lage, die DNA-Farbstoff Hoechst 33342 ausschließen, benannt Seitenpopulation (SP) Zellen, haben die Fähigkeit, Tumoren geprüftes 39 zu initiieren. Kürzlich haben wir gezeigt, dass eine subzelluläre Autofluoreszenz Fach kennzeichnet einen deutlichen Population von menschlichen Zellen mit exklusiven CSC Züge in verschiedenen Tumorarten40. Obwohl keines dieser Marker scheint selektiv charakterisieren eine reine Population KSZ, mehr und mehr komplexe Kombinationen von Markierungen müssen mit FACS verwendet werden, zu reinigen verfeinerten Zellpopulationen. Viele Fragen bleiben über die genaue Rolle von CSCs in der Herkunft, der Progression und Arzneimittelresistenz von Tumoren. Zum Beispiel besteht ein Weg, um die Frage der klonalen Evolution Adresse zu definieren, ob und wie eine einzelne CSC initiiert einen Tumor, könnte es sein, die Patientenproben bei verschiedenen Stadien der Erkrankung zu analysieren, und zwar folgendermaßen die Zahlen des CSCS während und nach der Behandlung. Durch die Beantwortung dieser Fragen, können wir sinnvolle Fortschritt unserer Kenntnis von CSCs in soliden Tumoren zu machen und zu entwickeln, Drogen-Therapien, um letztlich zu verhindern Tumorprogression und Rückfall.

Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ist eine der aggressivsten soliden Tumoren. Es ist derzeit die 4. häufigste Krebs-Todesfälle in der westlichen Gesellschaft und wird voraussichtlich auf der 2. häufigste Ursache innerhalb des nächsten Jahrzehnts steigen (~ 400.000 Todesfällen pro Jahr weltweit) 3 .Am Zeitpunkt der Diagnose 90% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung, die eine 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 5% aufweist. Diese Überlebensrate enttäuschend trotz immer intensivere Forschungsaktivitäten 4 unverändert in den letzten 50 Jahren. Von den verbleibenden 10% der Patienten, die potenziell &quot;heilbar&quot; Krankheit durch chirurgische Resektion haben, werden 80% von Rezidiv innerhalb von 5 Jahren zu sterben. Seit vielen Jahren die Standardtherapie bei fortgeschrittener Erkrankung ist Gemcitabin-Monotherapie, aber dies nur verleiht eine marginale Überlebensvorteil 5. Kleine Verbesserungen in kurzfristige Überleben wurden durch die Zugabe erreicht wurdevon Erlotinib 6 oder 7 Capecitabin jedoch die Überlebensvorteil in der Größenordnung von Wochen mit der mediane Gesamtüberleben noch ~ 6 Monate. In jüngster Zeit haben mehrere ermutigende Ergebnisse für Gemcitabin / nab -paclitaxel 8 und die FOLFIRINOX Kombination Regime 9,10 entstanden. Diese Therapien verbessert mediane Überlebenszeit von bescheidenen 2 und 4 Monate sind, aber sind sehr giftig und Langzeitüberlebenden immer noch eine seltene Ausnahme. Obwohl die Behandlung bietet das Potenzial für Verbesserungen, diese sind giftig Regime, auf die viele Patienten nicht reagieren oder nur zeigen, schrittweise Verbesserung des Gesamtüberlebens. In der Folge gibt es eine dringende Notwendigkeit, die derzeitigen Therapien ergänzen und sich auf neue, wahrscheinlich multimodale Therapieansätze zu entwickeln. Tumor Heterogenität Es wird immer deutlicher, dass Krebs Heterogenität ist nicht nur auf unterschiedliche evolutionäre Subklone withi beschränktn jeden Tumor 11, sondern auch durch phänotypische und funktionelle Heterogenität und Plastizität in jedem Subklon 12 angetrieben. So genannte Krebsstammzellen (CSCs) oder tumorfördernde Zellen sind für intraklonale Heterogenität 13-16 verantwortlich. Insbesondere CSCs stellen eine Untergruppe der Krebszelle, für die wir und andere haben schlüssige Nachweise erbracht hat, bis in die einzelne Zelle, die sie vertreten die Wurzel der Krankheit durch, die zu allen differenzierten Nachkommen in jedem Subklon 17 Krebs. Noch wichtiger ist, sind diese Zellen die für metastatische Verhalten und auch eine wichtige Quelle für Rezidiv nach der Behandlung, auch bei relativ wirksame Medikamente zur Induktion anfänglichen Tumorrückbildung (zB nab -paclitaxel) 15,18-20. Es ist wichtig zu beachten, dass KSZ stellen nicht notwendigerweise bona fide Stammzellen, noch haben sie aus Gewebestammzellen entstehen in vielen Fällen, sondern sie haben acquired bestimmte Merkmale von Stammzellen. Die meisten davon sind funktional definiert, beispielsweise CSCs sind mit unbegrenzter Selbsterneuerungskapazität macht sie resistent gegen herkömmliche Chemotherapie ausgestattet und zeigen eine erhöhte Invasivität, die metastatische Aktivität fördert. Funktionelle Krebsstammzellen Phänotypen Die funktionelle Phänotyp KSZ beruht auf ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung, die in vitro unter Verwendung serieller Formation Kugel und Koloniebildungstests jeweils getestet werden kann, nach. Noch wichtiger ist, CSCs in der Lage sich selbst zu erneuern Bär in vivo Tumorbildung, die durch Grenzverdünnung in vivo-Tests als die ultimative Funktionsanzeige, vorzugsweise während serielle Transplantation Hinweis auf ausschließliche langfristige Tumorbildung getestet werden können. Darüber hinaus gibt es die Heterogenität innerhalb des CSC Raum, mit einem deutlichen Subpopulation von CSCs mit dem exklusiven Fähigkeit, Anlass zu Metastasen zu geben, die nicht nur einedirekte Konsequenz aus der exklusiven in vivo Tumorbildung. Tatsächlich metastastitic CSCs erwerben die Fähigkeit, den Primärtumor zu umgehen, zu überleben und schließlich anoikis translozieren und Samen sekundären Standorten. Diese erweiterten funktionalen Fähigkeiten können in vitro unter Verwendung von modifizierten Invasion Assays und in vivo mit Metastasen Assays getestet werden. Targeting Cancer Stem Cells Wir und andere haben überzeugende Beweise, dass Behandlungen, die sich auf die Großtumor differenzierter PDAC-Zellen, auch in Kombination mit Stroma-Targeting-Mittel zur Verfügung gestellt, die nicht über einen großen Einfluss auf die Tumorprogression und anschließende Ergebnis, es sei denn mit einem CSC-Targeting Strategie 21 kombiniert, 22. Somit, bezogen auf die wesentlichen Funktionen des CSCS in den Krankheitsverlauf und Therapieresistenz Diese Zellen sollten ein wesentlicher Bestandteil für jede neue Behandlungsansatz 18,20 bedeuten, aber ein viel besseres Verständnis o erfordernf Regulierungsapparat CSCs. Obwohl CSCs und deren differenzierter Nachkommen tragen identische genetische Grundzustände in Bezug auf genetische Veränderungen, CSCs zeigen deutliche und damit epigenetisch bestimmten Genexpressionsprofilen, die Aktie Module mit pluripotenten Stammzellen. Die meisten der in Erzeugungs induzierte pluripotente Stammzellen (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) beteiligten Gene nicht nur im Zusammenhang mit Krebs, aber ihr Ausdruck ist vor allem auf die CSCs Raum beschränkt. Darüber hinaus haben die funktionelle Relevanz von CSCs loss-of-function-Experimente unter Verwendung genetischer Werkzeuge für die Ausrichtung CSCs jetzt fest etabliert die CSC-Konzept für mehrere Krebsarten 23-25. Während die meisten dieser Ansätze beruhen auf Mausmodelle basieren und sind daher nicht leicht übertragbar in der Klinik bieten sie proof-of-concept für die potentielle klinische Bedeutung Targeting KSZ in Kombination mit Massentumorzellen. Studieren Cancer Stem Cells In Vitro ihre Achillesferse Identifizieren Um neue und klinisch anwendbare Möglichkeiten für die Ausrichtung CSCs zu identifizieren, werden ihre Funktionen regelmäßig in vitro untersucht und Kugelbildung ist weit verbreitet in diesem Zusammenhang verwendet. Ursprünglich für das Studium normalen Stammzellbiologie, einschließlich Selbsterneuerung und Differenzierung Kapazität entwickelt, wurde dieser Test später angepasst CSCs in vitro zu studieren und hat für die Untersuchung von CSCs von PDAC 20 getrennt verwendet. Wir haben festgestellt, dass Tumor-Kugeln aus primären humanen PDAC Zellen gebildet tragen alle unterschiedliche Merkmale von CSCs daher anzeigt, dass sie nach Treu und Glauben Bauchspeicheldrüsen CSCs 21 enthalten. Somit wird der Tumor Sphäre Assay stellt ein leistungsfähiges Tool, um Bildschirm für effektivere Therapien in vitro, aber die Ergebnisse müssen weiter in strenger in vivo-Tests bewertet werden. Tatsächlich sollte Daten mit diesem in-vitro-Test erzeugt mit großer Vorsicht behandelt werden, wie the-Test kann mit erheblichen Irrtum. Hoch standardisierte Protokolle, darunter automatisierte Zählung der gebildeten Kugeln, eingerichtet werden, um reproduzierbare und Vorhersagedaten zu gewährleisten. In diesem Zusammenhang haben wir kürzlich dieses Assays Bauchspeicheldrüsenkrebsstammzellen aus einem unterschiedlichen Satz von primären humanen PDACs abgeleitet screenen und zeigte, dass diese Zellen höchst anfällig für metabolische Umprogrammieren antidiabetische Verbindung Metformin. Zuvor war nachgewiesen worden Metformin zur Krebszellexpansion durch indirekten Aktivierung von AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) Signal- und anschließender Inhibierung von mTOR 26, was zu einer reduzierten Proteinsynthese und die Zellproliferation hemmen 27. Zusätzlich zu diesen Wirkungen auf die Schütttumorpopulation haben wir und andere herausgefunden, dass Metformin imstande zum Ziel und tatsächlich keine CSCS Subpopulation in einer Reihe von festen Tumoren, wie Brustkrebs, Speiseröhrenkrebs, Glioblastom und Bauchspeicheldrüsenkrebs 28-31 &lt;/ Sup&gt;. Somit stellt Metformin eine vielversprechende und sichere neue therapeutische Strategie für verschiedene Krebsarten mit derzeit nicht gedeckten medizinischen Bedarf. Darüber hinaus mit Kugelbildung als eine Möglichkeit, für CSCs zu bereichern, haben wir gezeigt, dass die primäre Wirkung von Metformin über Bauchspeicheldrüsen CSCs war der AMPK-Aktivierung unabhängig und vor allem auf seine bescheidene mitochondriale Toxizität verlassen (über eine Hemmung der Komplex I), die offenbar war tödlich für die Teilmenge von CSCs nur. Für letztere konnten wir ihre zellulären Sauerstoffverbrauch und mitochondriale ROS-Produktion als Indikatoren für Toxizität des Medikaments auf zellulärer Ebene zu bewerten. Anschließend könnten diese in vitro-Daten in präklinischen Mausmodellen validiert werden, und in der Tat zu einer signifikant verlängerten Überlebenszeit 31. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die schnelle Erzeugung von Medikamentenempfindlichkeitsprofile für CSCs, einschließlich Studien über ihre Auswirkungen auf die CSC-Stoffwechsel. Wir haben jetzt erweitert experimentelle Einzelheiten über die verwendeten com liefernergänzende in vitro und in vivo-Verfahren.

<table><tbody><tr><td>Zählkammer/Hämozytometer&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>CASY Zellzähler und Analysator für die Proliferations- und Viehabilitätsmessung</td><td>Roche Innovatis</td><td>AG CASY Modell TTC 45,60,150 &mu; m</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Dissoziator&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Röhren&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten mit extrem niedrigem Aufsatz&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>100-mm-Gewebekulturschalen&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>Zellensieb&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Tube aus Polypropylen&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>konische Tube aus Polypropylen 50 ml&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml sterile Tuben&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petrischale, 10 cm Schale&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>26 G Nadeln&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>100 ul Hamilton Spritze&nbsp;</td><td>Hamilton Syringe Co</td><td>81075</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV&nbsp;</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin-Lösung, 100X&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Metformin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D150959-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 200 mM, 100X&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>100mM Natriumpyruvat-Lösung&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Seepferdchen Assay-Medium&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Cell-TAK Zell- und Gewebeklebstoff</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Lösung, 0,05%&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>B27 Beilage 50x&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium/F12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>steril 1x Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blau&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Carboxy-DCFDA(5-(und-6)-Carboxy-2',7'-DichlorfluoresceinDiacetat)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>C-369</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70% (vol/vol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td>IsoVet, Braun</td><td>571105.8</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35620</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Applikator mit Wattespitze</td><td> Puritan medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF96e FluxPak mit Zellplatten, Kalibrant und Kartuschen</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>XF96e Extrazellulärer Flux-Analysator</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mit CO2 Eingang&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Splitterzange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bremssattel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studieren bauchspeicheldrüsenkrebs stammzelleigenschaften für die entwicklung neuer behandlungsstrategien

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) enthält eine Teilmenge ausschließlich tumorigenen Krebsstammzellen (CSCs), die gezeigt haben, um Tumor-Initiation, Metastasierung und Beständigkeit gegenüber Radio- und Chemotherapie zu fahren. Hier beschreiben wir eine spezifische Methode zur Kultivierung von primären humanen Pankreas-CSCs als Tumorsphären in verankerungsunabhängigen Bedingungen. Die Zellen werden in serumfreiem, nicht haftenden Bedingungen, um für CSCs zu bereichern, während ihre differenzierter Nachkommen nicht überleben und vermehren sich in der Anfangsphase nach der Aussaat von Einzelzellen gezüchtet. Dieser Assay kann verwendet werden, um den Prozentsatz der in einer Population von Tumorzellen vorhanden KSZ abzuschätzen. Sowohl Größe (die von 35 bis 250 Mikrometer liegen kann) und die Anzahl der Tumor Kugeln gebildet stellt CSC-Aktivität entweder in bulk Populationen von kultivierten Krebszellen oder frisch geerntet und aufgeschlossen Tumoren 1,2 barg. Unter Verwendung dieses Tests haben wir vor kurzem festgestellt, dass Metformin selektiv abträgt pancreatic CSCs; ein Befund, der anschließend weiter durch den Nachweis verminderte Expression von Pluripotenz-assoziierten Gene / Oberflächenmarker untermauert und in vivo Tumorbildung von Metformin behandelten Zellen reduziert wurde. Als letzter Schritt für die präklinische Entwicklung, die wir behandelten Mäusen mit etablierten Tumoren mit Metformin und Ergebnis signifikant verlängert das Überleben. Klinische Studien testet den Einsatz von Metformin bei Patienten mit PDAC sind derzeit im Gange (zB NCT01210911, NCT01167738 und NCT01488552). Mechanistisch, fanden wir, dass Metformin führt zu einem tödlichen Energiekrise in CSCs durch Verbesserung reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Produktion und die Verringerung der mitochondrialen Transmembranpotentials. Im Gegensatz dazu wurden nicht-CSCs nicht durch Metformin Behandlung beseitigt, sondern unterzog reversible Zellzyklusarrest. Daher dient unserer Studie als gelungenes Beispiel für das Potenzial der in vitro Kugel Bildung als Screening-Instrument, um Verbindungen, die möglicherweise gezielt CSC identifizierens, aber diese Technik weitere in vitro- und in vivo-Validierung erforderlich, falsche Entdeckung zu vermeiden.

Metformin selektiv auf Bauchspeicheldrüsen CSCs Wir untersuchten zuerst die funktionalen Wirkungen von Metformin auf die in vitro Selbsterneuerungskapazität des CSCS. Zu diesem Zweck führten wir Kugel Bildungstests unter Verwendung von primären humanen Pankreaskrebszellen aus PDAC Gewebe während der Operation reseziert isoliert. Wir beobachteten, dass Metformin stark vermindert die Größe der gebildeten Kugeln (1A). Dies war durch die Hemmung der Ausdehnung der Nachkommen des CSC, die noch stellen den Großteil der Zellen in Bereichen gefunden, wie sie nur für KSZ angereichert am wahrscheinlichsten. Tatsächlich sind die mehr Kugeln ohne Passagieren des umfassen den Ausbau der differenzierteren Nachkommen werden kultiviert. So fanden wir, Metformin, um die Anzahl von Kugeln tatsächlich unabhängig von ihrer Größe ausgebildet signifikant zu verringern, in einer Dosis-abhängigen Weise hindeutet starke Hemmung der Selbsterneuerungskapazität C auftretendenVZ (Daten nicht gezeigt). Wir fanden, dass Metformin bei 3 mm die Anzahl der Kugeln gebildet (Abbildung 1B) deutlich gesunken. Um die langfristigen Wirkungen von Metformin auf die Selbsterneuerungskapazität von CSCs strenger zu studieren, später agiert wir die gebildeten primären Sphären in sekundären und tertiären Bereich. Obwohl nur primäre Kugeln wurden mit Metformin behandelt wurde die Bildung der Kugeln in den zweiten und dritten Durchgänge drastisch und zunehmend reduziert, Metformin verwickelt war die Mehrheit der KSZ (1C) tatsächlich irreversibel eliminiert. So zeigten unsere Daten signifikante Behandlungseffekte für Metformin über die Selbsterneuerungskapazität von primären Pankreas CSCs und so hat uns ermutigt, weitere mechanistische als auch in vivo-Studien durchzuführen. Metformin Hemmt Mitochondriale Sauerstoffverbrauch und induziert ROS Produktion Seit metformin Es wurde gezeigt, wie ein Mitochondriengift durch teilweise Hemmung der Komplex I-Aktivität handeln, neben untersuchten wir die akuten Wirkungen von Metformin auf die zelluläre Sauerstoffverbrauch in der Sphäre stammenden Zellen. Zu diesem Zweck wählten wir Zellen von zwei repräsentativen primären PDAC Tumoren abgeleitet und maß den Sauerstoffverbrauch über der Zeit folgende sequentielle Injektion von 3 mM Metformin (drei Injektionen) und 1 uM Rotenon (eine Injektion). Wie in 2A gezeigt, Metformin Injektion induziert eine schnelle und dosisabhängige Abnahme des Sauerstoffverbrauchs, was erhebliche zwischen den verschiedenen Tumoren variiert. Berechneten wir die Rest mitochondriale Aktivität auf Metformin Behandlung durch Injektion von Rotenon, einem potenten komplexen I-Inhibitor, der in der Lage ist vollständig Hemmung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch ist. Empfindlichkeit gegenüber Metformin in Bezug auf die mitochondriale Sauerstoffverbrauch mit seiner Kapazität korreliert, um ROS-Produktion definiert als eine Verschiebung des Mittelwerts der popu induzierennung nach der Metformin-Behandlung (2B, links), die leicht quantifiziert werden kann (2B, rechts). Wie erwartet, zeigten die primären Zellen, die am empfindlichsten auf die Hemmung der Sauerstoffaufnahme wurden auch die stärkste Zunahme der ROS-Produktion von Metformin Behandlung. Somit sind diese metabolischen in vitro Versuche zeigen, dass Metformin zielt KSZ durch Hemmung ihrer Abhängigkeit von der mitochondrialen Funktion, was zu einer späteren Erhöhung mitochondrialen ROS und eventuell die Induktion von Apoptose. Metformin Stalls PDAC Progression In Vivo Wir untersuchten schließlich die Auswirkungen von Metformin in vivo unter Verwendung von Gewebe Xenotransplantate von verschiedenen Patienten mit PDAC abgeleitet. Wir beobachteten eine signifikante Verringerung bei der Tumorprogression zu Metformin behandelten Mäuse im Vergleich zu der Kontrollgruppe, aber die Tumoren reagieren nie vollständig disappeared (Abbildung 3). Anschließend während Langzeit-Follow-up aller Tumoren schließlich rückfällig darauf hindeutet, Metformin Widerstand der Zellen das Überleben der Frühphase der Behandlung. Dennoch Metformin-Behandlung, auch wenn als Monotherapie angewendet wird, signifikant in allen Mäusen verlängert das Überleben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Abbildung 1. Metformin selektiv auf die CSCs. (A) Metformin verringert die Größe der Kugeln. Repräsentative Bilder von Kugeln nach der Behandlung mit den angegebenen Dosen von Metformin für 7 Tage (rechts) erhalten. Die Quantifizierung der Kugelgröße (n≥6) (links), die angegebenen Zahlen in Abszisse stellen einzelne Tumor. (B) Sphere Bildungsvermögen in Gegenwart oder Abwesenheit von Metformin für 7 Tage (n≥6), wobei die angegebenen Nummern in AbszissenAchse stellen einzelne Tumor. (C) Vertreter Graph von CSC Selbsterneuerungskapazität in sekundären und tertiären Bereichen des primären Bauchspeicheldrüsenkrebs Zellen. Die Kugeln wurden nur während der ersten Generation Kugelbildung für insgesamt 7 Tage behandelt (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Abbildung 2. Metformin-Behandlung hemmt Sauerstoffverbrauch und induziert ROS-Produktion. (A) Metformin zusätzlich hemmt den Sauerstoffverbrauch (OCR) des Kugel-abgeleiteten Zellen. Zwei verschiedene PDAC Sekundärkugeln wurden mit Metformin behandelt und OCR Veränderungen wurden durch extrazelluläre Flussanalyse gemessen. Rotenon Injektion wurde als Kontrolle für die Gesamt-mitochondrialen OCR Verzehr verwendet.X-Achse stellt die Sauerstoffverbrauchsrate in pmol von Sauerstoff / h durch den Proteingehalt in jeder Vertiefung normalisiert. (B) PDAC Kugeln in A verwendet wurden für 8 h mit Metformin und ROS-Produktion wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung carboxy-DCFDA beurteilt. Links, Vertreter Durchflusszytometrie Parzellen. Right, Zusammenfassung der Daten aus drei unabhängigen Experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Abbildung 3. Metformin Stalls PDAC Progression in vivo. Zwei verschiedene PDAC Xenotransplantat-Gewebe wurden in immungeschwächten Mäusen implantiert und Behandlung zugeteilt nach anfänglichen Tumor take verifiziert wurde. Mäuse wurden mit Metformin (Met) zu der behandelten Trinkwasser (150 mg / kg Körper weight; basierend auf 5 ml Wasserverbrauch pro Tag). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Pankreaskrebs-Stammzellen (CSCs) können in vitro mit der Verankerungsunabhängigen Kugelkulturtechnik vermehrt werden, die ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der CSC-Biologie darstellt und als erster Schritt zur Entwicklung neuartiger CSC-Targeting-Therapien dienen kann. Hier wird die Methodik für die Erweiterung, Analyse und das Targeting von Pankreas-CSCs bereitgestellt.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, Krebsstammzellen in vitro mithilfe einer anhaftungsunabhängigen Kulturmethode zu vermehren und anschließend die metabolischen Wirkungen neuartiger Therapien zu untersuchen, die gezielt auf Krebsstammzellen abzielen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine humane Gewebeprobe eines Pankreasadenokarzinoms in eine Einzelzell-Suspension dissoziiert wird. Im zweiten Schritt wird das Tumorgewebe weiterhin enzymatisch verdaut und anschließend auf eine Gelatineplatte ausgesät. Um die Population der Fibroblasten zu entfernen, werden die isolierten Krebszellen danach in einer ultraniedrig bindenden Multiwellplatte ausgesät und mit dem Substanzmittel der Wahl behandelt, um die metabolische Aktivität und die Bildung von Tumorsphäroiden zu bewerten.Schließlich kann das untersuchte Medikament an immungeschwächten Mäusen mit patientenderivierten Xenotransplantaten eingesetzt werden, um die Wirkung des Medikaments in vivo zu validieren. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erforschung der Biologie von Krebsstammzellen und stellt einen ersten Schritt bei der Entwicklung neuer Therapien zur gezielten Bekämpfung von Krebsstammzellen dar. Die Demonstration des Verfahrens werde ich selbst durchführen, eine wissenschaftliche Nachwuchskraft am Zentrum für Stammzellen in Krebs und Alterung am Brustkrebsinstitut, sowie Tini Cruz, eine Doktorandin aus meinem Labor, um Krebsstammzellen aus einem Pankreas-ductalen Adenokarzinom in einem sterilen Biosicherheitswerkbank zu isolieren.Verwenden Sie ein steriles Skalpell und eine Pinzette, um den menschlichen Tumor in einer 60 mal 15 Millimeter großen Kulturschale, die ein Milliliter sterile PBS enthält, zu zerkleinern; fügen Sie nach Bedarf weitere drei bis vier Milliliter PBS hinzu, bis das Gewebe vollständig dissoziiert ist. Überführen Sie die Gewebesuspension in ein steriles kegelförmiges Reagenzglas und ergänzen Sie PBS auf ein Endvolumen von fünf Millilitern. Anschließend homogenisieren Sie die Probe mechanisch mit einer Dissoziationszentrifuge und verdauen das homogenisierte Gewebe mit Kollagenase bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 10 Milliliter komplettes Medium einarbeiten. Filtern Sie die Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Filter und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Dieses Mal resuspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter eines CK. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur entfernen Sie den Erythrozyten-Lysepuffer durch Zentrifugation und resuspendieren das Pellet in Stammzellmedium für Krebszellen.Anschließend die Zellen eine Stunde lang auf einer mit Gelatine beschichteten Schale bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die schnell anheftenden Fibroblasten weitgehend zu entfernen. Danach das Überstandmedium gewinnen und die Anzahl der vitalen Pankreaskrebszellen quantifizieren, um die Tumorsphärenbildung für die Anreicherung von Krebsstammzellen zu ermöglichen. Die Zellen in dem geeigneten Volumen an Krebsstammzellmedium auf eine Endkonzentration von zweimal 10³ Zellen pro Milliliter verdünnen und einige Minuten lang auf Eis abkühlen.Danach 500 Mikroliter PBS zu den ersten und letzten Reihen einer 24er Ultra-Low-Attachment-Zellkulturplatte hinzufügen, die Zellen durch Pipettieren resuspendieren und je ein Milliliter Zellsuspension pro Vertiefung in die leeren Vertiefungen der Platte ausplattieren. Vier Vertiefungen mit den Zellen mit dem gewünschten Wirkstoff und mindestens vier Vertiefungen als Negativkontrolle mit dem Lösungsmittel behandeln. Anschließend die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.Jeden zweiten Tag frische Behandlungslösung zu jedem der Wells hinzufügen. Am Tag fünf oder sieben die Anzahl der gebildeten Tumorsphären mit einem automatisierten Zellzähler bewerten, der die Identifizierung größerer Strukturen für die serielle Verpackung der Tumorsphären ermöglicht. Am Tag sieben die Sphären mittels eines 40-Mikrometer-Zellsiebs gewinnen.Als Nächstes zentrifugieren Sie die Sphäroide und inkubieren sie 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Milliliter Trypsin, um das Pellet in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren. Danach vermehren Sie die Zellen weitere sieben Tage lang, wie gerade gezeigt, um die Sphäroide auf die Messung ihrer reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS-Produktion vorzubereiten. Nach der Dissoziation, wie eben gezeigt, zentrifugieren Sie die Sphäroide und resuspendieren das Pellet in HBSS, das die geeignete Sonde enthält. Nach einer 20-minütigen Inkubation im Dunkeln bei 37 Grad Celsius stellen Sie die Zellen bis zur Analyse per Durchflusszytometrie auf Eis, um die Sphäroide auf die Messung ihres Sauerstoffverbrauchs vorzubereiten.Beschichten Sie zunächst eine 96-Well-Zellkulturplatte mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Zell- und Gewebehaftmittel. Danach lösen Sie die Sphäroide mit Trypsin wie gezeigt auf. Anschließend waschen Sie die Platte zwei bis drei Mal mit Wasser, um überschüssiges Haftmittel zu entfernen, und geben die Einzelzellen mit je drei mal 10 hoch 5 Zellen pro Well auf die Platte. In 150 Mikroliter Sauerstoffverbrauchs-Assay-Medium, das Glukose und Natriumpyruvat enthält, die Zellen durch Zentrifugation an den Boden der Vertiefungen anheften, bis 100 × g erreicht sind. Die Zentrifuge ohne Bremse auslaufen lassen. Dann die Plattenorientierung umkehren und den Vorgang der Zentrifugation wiederholen.Incubieren Sie die Zellen nun 30 Minuten bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. In der Zwischenzeit laden Sie die Assay-Kartuschenimporte A, B und C. Geben Sie jeweils 25 Mikroliter einer drei, sechs bzw. neun Millimolar-Konzentration des interessierenden Wirkstoffs zu und fügen Sie D mit 25 Mikrolitern einer ein Mikromolar-Konzentration des mitochondrialen Inhibitors Rone hinzu.Wenn die Zellen bereit sind, kalibrieren Sie die Kartusche und laden Sie die Zellkulturplatte auf. Führen Sie schließlich den Assay gemäß dem Standardprotokoll für Mischen und Messen durch. In diesen repräsentativen Experimenten führte die Behandlung von pankreatischen Krebsstammzellen mit Metformin zu einer starken Abnahme der Größe und Anzahl der Tumorsphären. Diese Reduktionen zeigten sich zudem in sekundären und tertiären Sphärenkulturen.Auch wenn nur die Kultur der primären Sphären mit Metformin behandelt wurde, wirkt Metformin laut Angaben als mitochondrialer Inhibitor. Tatsächlich wurde in diesem Experiment beobachtet, dass der Wirkstoff eine schnelle und dosisabhängige Abnahme des Sauerstoffverbrauchs in den Tumorzellen hervorruft, die mit seiner Fähigkeit zur Induktion der ROS-Produktion korreliert. Wichtig ist, dass Mäuse, die mit Metformin behandelt wurden, im Vergleich zu Kontrolltieren eine kurzfristige, aber signifikante Verringerung der Progression von Pankreasadenokarzinomen aufweisen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man frische menschliche Tumore dissoziiert, primäre Krebszellen isoliert, eine Kultur zur Sphärenbildung etabliert und die metabolische Aktivität von pankreatischen Krebsstammzellen bewertet.

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Krebsstammzellen (CSCS) haben in einer Reihe von Tumoren identifiziert worden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine durchflusszytometrische Methode unter Verwendung Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität und CD44 und CD24-Expression auf CSCs aus menschlichen Pankreaskarzinom Xenotransplantate isolieren. Diese entwicklungsfähigen Zellen können dann in funktionelle und analytische Untersuchungen verwendet werden.

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Lernen Sie die Expansion von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Stammzellen mittels ankerunabhängiger Kulturtechnik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Metformin-Effekten auf Tumorsphären und Sauerstoffverbrauch.

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