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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

DOI:
10.3791/59038-v

•

10:50 min

•

March 14, 2019

•

, ,
1Department of Biochemistry,Purdue University, 2Department of Botany and Plant Pathology,Purdue University, 3Center for Plant Biology,Purdue University

Kapitel

  • 00:04Titel
  • 00:33Designing the FRET Assay
  • 01:12Preparation of Cul1AMC•Rbx1, the FRET Donor Protein
  • 04:42Preparation of FlAsHCand1, the FRET Acceptor Protein
  • 05:18Testing and Confirmation of the FRET Assay
  • 06:08Measuring the Association Rate Constant
  • 07:37Measuring the Dissociation Rate Constant of Cul1•Cand1 in the Presence of Skp•F-box Protein
  • 08:33Results: Dynamics Of Protein Complexes
  • 10:30Conclusion

Summary

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Interações da proteína-proteína são essenciais para sistemas biológicos, e estudos sobre a cinética de ligação fornecem insights sobre a dinâmica e a função dos complexos da proteína. Nós descrevemos um método que quantifica os parâmetros cinéticos de uma proteína complexa usando transferência de energia de ressonância de fluorescência e a técnica de fluxo parou.

Tags

FRETProtein ComplexKineticsAssociationDissociationCOL1CAND17-amino-4-methylcoumarinFlASHCell LysisSonicationCentrifugationGlutathione BeadsElutionThrombinBuffer A

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