Name: 利用体外荧光共振能量转移研究毫秒时间尺度蛋白质配合物的动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 了解利用荧光共振能量转移和停流技术研究蛋白质复合物毫秒级动力学的方法。该技术可实时监测蛋白质复合物的形成与解离，定量分析结合动力学参数。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢加州理工学院的 Shu-Ou Shan 对 FRET 实验开发的深入讨论。M.G.、Y.Z. 和 X.L. 的研究得到了普渡大学为 Y.Z. 和 X.L. 提供的启动资金支持。本工作部分由普渡大学植物生物学中心的种子基金资助。

1. 设计FRET实验。
<ol>
	<li>从蛋白质数据库（PDB）下载Cul1•Cand1复合物的结构文件（文件编号1U6G）。</li>
	<li>在PyMOL中查看Cul1•Cand1复合物的结构。</li>
	<li>使用PyMOL中Wizard菜单下的Measurement功能，估算Cand1的第一个氨基酸与Cul1的最后一个氨基酸之间的距离（图1）。</li>
	<li>加载在线光谱查看器（见材料表），同时查看7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）和FlAsH的激发光谱和发射光谱（图2）。请注意，AMC为FRET供体，FlAsH为FRET受体。</li>
</ol>
<img alt="显示N端与C端测量及折叠模式的蛋白质结构示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59038/59038fig1.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图1"> 
图1：Cul1•Cand1的晶体结构及潜在标记位点间距离的测量。 晶体结构文件从蛋白质数据库（PDB文件1U6G）下载，并在PyMOL中查看。所选原子之间的距离测量由PyMOL完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59038/59038fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="AMC 和 FlAsH 的光谱发射图，显示在不同波长下的荧光强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59038/59038fig2.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于 FRET 的荧光染料的激发和发射光谱。 显示了 AMC（7-氨基-4-甲基香豆素）和 FlAsH 的光谱。虚线表示激发光谱，实线表示发射光谱。该图像最初由荧光光谱查看器生成，并经过修改以提高清晰度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59038/59038fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
2. FRET 供体蛋白 Cul1AMC•Rbx1 的制备
<ol>
	<li>构建用于表达人源Cul1的质粒sortase•Rbx1 在 大肠杆菌 细胞。请注意，这两种质粒共同表达人源 Cul1•Rbx1 E. coli 细胞的详细描述见先前的报告20.
	<ol>
		<li>添加编码“LPETGGHHHHHH”（分选酶-His）的DNA序列6 通过标准的PCR和克隆方法将标签（tag）连接至Cul1编码序列的3’端21,22.</li>
		<li>对新质粒进行测序，以确认基因插入片段准确无误。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共表达 Cul1sortase•Rbx1 在 E. coli 细胞。该方法源自先前的一项报道20.
	<ol>
		<li>将各100 ng的两种质粒与BL21 (DE3) 感受态细胞混合，采用热激法进行共转化23在含有100 µg/mL氨苄青霉素和34 µg/mL氯霉素的LB琼脂平板中，37 °C过夜培养细胞。</li>
		<li>接种50 mL LB培养基至新转化的菌落中，于37 °C、250 rpm振荡培养过夜，获得种子培养物。</li>
		<li>接种6个锥形瓶，每个锥形瓶中加入1 L LB培养基，每瓶接种5 mL启动培养物，在37 °C、250 rpm振荡条件下培养，直至OD600 约为1.0。将培养物冷却至16 °C，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.4 mM。在16 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
		<li>收获 E. coli 通过5,000 x g离心分离细胞 g 15 分钟后收集细胞沉淀至 50 mL 锥形管中。 
		注意：细胞沉淀可用于蛋白质纯化，或在进行蛋白质纯化步骤前于 -80 °C 冻存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cul1 的纯化sortase•Rbx1 复合物。该方法源自先前的报道20.
	<ol>
		<li>向沉淀中加入50 mL裂解缓冲液（30 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，5 mM DTT，10%甘油，1片蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.6） E. coli 表达 Cul1 的细胞sortase•Rbx1</li>
		<li>在冰上使用超声处理裂解细胞，超声功率为50%。超声程序设置为开启1秒、关闭1秒，交替运行3分钟。</li>
		<li>重复步骤 2.3.2 两到三次。</li>
		<li>将细胞裂解液转移至50 mL离心管中，通过在25,000 x g下离心去除细胞碎片 g 45 分钟。</li>
		<li>将澄清的细胞裂解液与5 mL谷胱甘肽珠在4 °C孵育2小时。</li>
		<li>将珠子-裂解液混合物在1,500 x g下离心 g 4 °C下离心2分钟。弃去上清液。</li>
		<li>用5 mL裂解缓冲液（不含蛋白酶抑制剂）洗涤磁珠，1,500 x g离心后弃去上清液 g 4 °C下持续2分钟。</li>
		<li>重复步骤 2.3.7 两次。</li>
		<li>向洗涤后的磁珠中加入 3 mL 裂解缓冲液，并将磁珠悬液转移至空柱中。</li>
		<li>加入5 mL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，10 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0）至柱中。孵育10分钟，收集洗脱液。</li>
		<li>重复步骤 2.3.10 三到四次。</li>
		<li>加入200 µL 5 mg/mL凝血酶（见 材料表将）加入谷胱甘肽珠的洗脱液中，4 °C 下孵育过夜。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
		<li>用缓冲液A（25 mM HEPES，1 mM DTT，5%甘油，pH 6.5）将蛋白样品稀释三倍。</li>
		<li>平衡阳离子交换层析柱（参见 材料表在FPLC系统中使用缓冲液A进行。</li>
		<li>以0.5 mL/min的流速将蛋白质样品上样至已平衡的阳离子交换层析柱中。</li>
		<li>以每分钟1 mL的流速，通过混合缓冲液A与0至50%的缓冲液B（25 mM HEPES，1 M NaCl，1 mM DTT，5%甘油，pH 6.5），在40 mL体积中进行NaCl梯度洗脱蛋白。</li>
		<li>使用 SDS-PAGE 检测不同组分中洗脱的蛋白质24. 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
		<li>合并含有 Cul1 的洗脱组分sortase•Rbx1</li>
		<li>浓缩合并的Cul1sortase•通过超滤膜（截留分子量30 kDa）将Rbx1样品浓缩至2.5 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过分选酶介导的转肽作用将AMC添加到Cul1的C末端21,22.
	<ol>
		<li>更换Cul1的缓冲液分选酶•将Rbx1样品加入分选酶缓冲液（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂）中2，pH 7.5）使用脱盐柱（见 材料表).
		<ol>
			<li>用 25 mL 分离酶缓冲液平衡脱盐柱。</li>
			<li>加入 2.5 mL Cul1sortase•将Rbx1样品加入柱中。弃去穿流液。</li>
			<li>用 3.5 mL 分选酶缓冲液洗脱样品，收集流出液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在900 µL的Cul1中sortase•在分选酶缓冲液中的Rbx1溶液，加入100 µL浓度为600 µM的纯化分选酶A溶液和10 µL浓度为25 mM的GGGGAMC 肽。将反应混合物在30 °C避光孵育过夜。注意，此步骤将生成Cul1AMC•Rbx1 
		注意：荧光染料对光敏感，因此在蛋白质和样品制备过程中应尽量避免暴露于环境光线下。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
		<li>加入50 µL Ni-NTA琼脂糖珠至反应混合物中，室温孵育30分钟。</li>
		<li>通过5,000 x g离心沉淀Ni-NTA琼脂糖珠 g 孵育2分钟，收集上清液。</li>
		<li>平衡尺寸排阻色谱柱（参见 材料表) 用缓冲液（30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% 甘油）在FPLC系统上进行。</li>
		<li>加载所有的 Cul1AMC•Rbx1 样品上样至尺寸排阻层析柱，用 1.5 倍柱体积的缓冲液进行洗脱。</li>
		<li>通过SDS-PAGE检测洗脱组分24.</li>
		<li>合并含有 Cul1 的洗脱组分AMC•Rbx1</li>
		<li>使用分光光度计在280 nm处测定蛋白质浓度。</li>
		<li>分装蛋白质溶液，并于 -80 °C 保存。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 准备FlAsHCand1，即FRET受体蛋白
注意：本部分的大多数步骤与步骤 2 相同。不同的条件将在下文详细描述。
<ol>
	<li>构建用于表达人源蛋白的质粒 TetraCysCand1在 E. coli 细胞
	<ol>
		<li>在第15个密码子前添加编码“CCPGCCGSG”（四半胱氨酸/TetraCys标签）的DNA序列th 通过常规PCR扩增Cand1的氨基酸25 （引物序列：TGCTGTCCGGGCTGCTGCGGCAGCGGCATGACATCCAGCGACAAGGACTTTAG；CTAACTAGTGTCCATTGATTCCAAG）</li>
		<li>将PCR产物插入pGEX-4T-2载体中。对质粒进行测序，以确认基因插入片段准确且阅读框正确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表达 TetraCysCand1in E. coli 与步骤2.2相同的方式处理细胞，但将质粒转化至Rosetta感受态细胞中。</li>
	<li>纯化 TetraCysCand1 来自 E. coli 细胞
	<ol>
		<li>裂解 E. coli 细胞沉淀与提取物 TetraCys使用谷胱甘肽磁珠进行Cand1实验。这些步骤与步骤2.3.1–2.3.12相同。</li>
		<li>用缓冲液 C（50 mM Tris-HCl，1 mM DTT，5% 甘油，pH 7.5）将谷胱甘肽磁珠洗脱的蛋白溶液稀释三倍。平衡阴离子交换层析柱（见 材料表在FPLC系统中使用缓冲液C，并以0.5 mL/min的流速上样稀释后的蛋白质样品。</li>
		<li>以40 mL NaCl梯度洗脱蛋白，通过混合缓冲液C与0至50%的缓冲液D（50 mM Tris-HCl，1 M NaCl，1 mM DTT，5%甘油，pH 7.5），流速为1 mL/min。使用SDS-PAGE检测不同洗脱组分中的蛋白。24，并合并含有 TetraCysCand1。请注意 TetraCysCand1 的保留体积大于游离的 GST。</li>
		<li>浓缩合并的样本 TetraCys使用超滤膜（截留分子量30 kDa）将缓冲液通过，对Cand1样品进行处理。</li>
		<li>使用FPLC系统用标记缓冲液（20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM TCEP, 1 mM EDTA, 5% glycerol）平衡尺寸排阻色谱柱。上样 TetraCys每次取样Cand1样品500 µL，通过SDS-PAGE检测洗脱组分24.</li>
		<li>合并所有含有 TetraCys将蛋白溶液通过超滤膜（30 kDa截留分子量）浓缩至约40 µM。通过测定其在280 nm处的吸光度估算蛋白浓度。将蛋白分装为50 µL的等份，于-80 °C保存。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备 FlAsHCand1
	<ol>
		<li>加入1 µL FlAsH溶液（参见 材料表) 至 50 µL TetraCysCand1 溶液</li>
		<li>充分混匀，于室温避光孵育1-2小时，以获得 FlAsHCand1 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. FRET 追踪蛋白 Cand1 的制备
注意：蛋白质制备步骤与步骤3类似，但需进行以下修改。
<ol>
	<li>将全长Cand1的编码序列插入pGEX-4T-2载体中。</li>
	<li>将3.3.5步骤中使用的缓冲液更换为含有30 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1 mM DTT和10%甘油的缓冲液。</li>
	<li>省略步骤3.3.7和3.3.8。</li>
</ol>
5. 测试并验证FRET实验
<ol>
	<li>配制含有 30 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、0.5 mM DTT、1 mg/mL 卵清蛋白、pH 7.6 的 FRET 缓冲液，并于室温下使用。</li>
	<li>在荧光分光光度计上检测 Cul1AMC•Rbx1 与 FlAsHCand1 之间的荧光共振能量转移（FRET）。
	<ol>
		<li>在 300 µL FRET 缓冲液中加入 Cul1AMC•Rbx1（FRET 供体），使其终浓度为 70 nM。将溶液转移至比色皿中。</li>
		<li>将比色皿放入荧光分光光度计的样品槽中，用 350 nm 激发光激发样品，并以 1 nm 为步长扫描 400 nm 至 600 nm 范围内的发射信号。</li>
		<li>重复步骤 5.2.1，但将 Cul1AMC•Rbx1 替换为 FlAsHCand1（FRET 受体）。使用与步骤 5.2.2 相同的方法扫描 FlAsHCand1 样品。</li>
		<li>（可选）用 510 nm 激发光激发 FlAsHCand1，并扫描 500 nm 至 650 nm 范围内的发射信号。</li>
		<li>在 300 µL FRET 缓冲液中同时加入 Cul1AMC•Rbx1 和 FlAsHCand1，使其终浓度均为 70 nM。以与步骤 5.2.2 相同的方式分析样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过加入竞争蛋白（未标记的 Cand1）来验证 Cul1AMC•Rbx1 与 FlAsHCand1 之间的 FRET（图 3C）。
	<ol>
		<li>在 300 µL FRET 缓冲液中加入 70 nM Cul1AMC•Rbx1 和 700 nM Cand1。按照步骤 5.2.2 的方法扫描样品的发射光谱。</li>
		<li>在 300 µL FRET 缓冲液中加入 70 nM FlAsHCand1 和 700 nM Cand1。按照步骤 5.2.2 的方法扫描样品的发射光谱。</li>
		<li>在 300 µL FRET 缓冲液中加入 70 nM Cul1AMC•Rbx1 和 70 nM FlAsHCand1，室温孵育 5 分钟。然后加入 700 nM Cand1，加样后立即按照步骤 5.2.2 的方法扫描样品发射光谱。注意，此步骤与步骤 5.2.5 类似。</li>
		<li>在 300 µL FRET 缓冲液中依次加入 70 nM Cul1AMC•Rbx1、700 nM Cand1 和 70 nM FlAsHCand1。室温孵育 5 分钟后，按照步骤 5.2.2 的方法扫描样品发射光谱。注意，此为竞争对照样品（图 3C 中的绿色曲线）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 测定 Cul1•Cand1 的结合速率常数（kon）
注意：停流荧光仪的操作细节已在先前的报告中描述26。
<ol>
	<li>准备停流荧光仪以进行测量。
	<ol>
		<li>根据制造商的说明打开停流荧光仪。</li>
		<li>将激发光设置为 350 nm，并使用带通滤光片，允许 450 nm 发射光通过，同时阻断 500–650 nm 的发射光。</li>
		<li>保持样品阀处于 FILL 位置，并连接一个装有水的 3 mL 注射器。通过多次上下移动样品注射器驱动装置，用水清洗两个样品注射器（A 和 B）。弃去此步骤中使用的所有水。</li>
		<li>保持样品阀处于 FILL 位置，并连接一个装有 FRET 缓冲液的 3 mL 注射器。通过多次上下移动样品注射器驱动装置，用 FRET 缓冲液清洗两个样品注射器。弃去此步骤中使用的所有 FRET 缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行对照测量（图 4C）。
	<ol>
		<li>连接一个 3 mL 注射器，并将注射器 A 装载含 100 nM Cul1AMC•Rbx1 的 FRET 缓冲液。将样品阀转至 DRIVE 位置。</li>
		<li>连接一个 3 mL 注射器，并将注射器 B 装载 FRET 缓冲液。将样品阀转至 DRIVE 位置。</li>
		<li>在软件的 Acquire 下的 Control Panel 中操作，在停流荧光仪上进行五次进样（等体积混合注射器 A 和注射器 B 的样品），不记录结果。</li>
		<li>打开软件中 Acquire 下的 Control Panel，设置程序以记录 Cul1AMC 的发射信号，持续 60 秒，然后进行一次进样。</li>
		<li>重复步骤 6.2.4 两次。</li>
		<li>将样品阀转至 FILL 位置。排空注射器 B 并用 FRET 缓冲液清洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量 Cul1•Cand1 的表观结合速率常数（kobs）（图 4B）。
	<ol>
		<li>保持注射器 A 中的样品与步骤 6.2.1 相同。</li>
		<li>连接一个 3 mL 注射器，并将注射器 B 装载含 100 nM FlAsHCand1 的 FRET 缓冲液。将样品阀转至 DRIVE 位置。</li>
		<li>在软件的 Acquire 下的 Control Panel 中操作，在停流荧光仪上进行五次进样，不记录结果。</li>
		<li>打开软件中 Acquire 下的 Control Panel，设置程序以记录 Cul1AMC 的发射信号，持续 60 秒，然后进行一次进样。</li>
		<li>重复步骤 6.3.4 两次。</li>
		<li>排空注射器 B 并用 FRET 缓冲液清洗。</li>
		<li>重复步骤 6.3.1–6.3.6 多次，每次逐步提高 FRET 缓冲液中 FlAsHCand1 的浓度。</li>
		<li>将每次进样测得的荧光信号随时间的变化（下降）拟合为单指数衰减曲线。由此可得到每次测量的 kobs 值，单位为 s-1。请注意，该计算方法的基础已在先前的报告中充分讨论27。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算每种使用的 FlAsHCand1 浓度下 kobs 的平均值和标准差。将平均 kobs 对 Cand1 浓度作图（图 4D），所得直线的斜率即为 Cul1•Cand1 的 kon，单位为 M-1 s-1。</li>
</ol>
7. 测定在 Skp1•F-box 蛋白存在条件下 Cul1•Cand1 的解离速率常数（koff）。
注意：此步骤与步骤6类似，但需进行以下修改。
<ol>
	<li>在注射器 A 中，置于填充位置，加入含有 100 nM Cul1AMC•Rbx1 和 100 nM FlAsHCand1 的 FRET 缓冲液溶液。将样品阀转至“驱动”位置。</li>
	<li>在注射器 B 中，置于填充位置，加入 Skp1•Skp2 溶液（按先前报道的方法制备20）。将样品阀转至“驱动”位置。</li>
	<li>在软件中，打开采集下的控制面板，设置程序以记录 Cul1AMC 的发射信号，持续 30 秒。然后进行单次采集。混合注射器 A 和注射器 B 中的溶液后，荧光信号随时间逐渐增强（图 5）。</li>
</ol>

<ol><li>Stumpf, M. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Kuzmanov, U., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+networks%3A+probing+disease+mechanisms+using+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems.</a> Genome Medicine. 5 (4), 37(2013).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).</li>
<li>Lapetina, S., Gil-Henn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple%2C+direct%2C+and+quantitative+in+vitro+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays.</a> Journal of Biological Methods. 4 (1), 62(2017).</li>
<li>Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+kinetic+studies+of+biological+interactions%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).</li>
<li>Pierce, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cand1+promotes+assembly+of+new+SCF+complexes+through+dynamic+exchange+of+F+box+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins.</a> Cell. 153 (1), 206-215 (2013).</li>
<li>Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cand1-Mediated+Adaptive+Exchange+Mechanism+Enables+Variation+in+F-Box+Protein+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression.</a> Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).</li>
<li>Zheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Cul1-Rbx1-Skp1-F+boxSkp2+SCF+ubiquitin+ligase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex.</a> Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).</li>
<li>Kleiger, G., Deshaies, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tag+Team+Ubiquitin+Ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tag Team Ubiquitin Ligases.</a> Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAND1+binds+to+unneddylated+CUL1+and+regulates+the+formation+of+SCF+ubiquitin+E3+ligase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex.</a> Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).</li>
<li>Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP120A+associates+with+unneddylated+cullin+1+and+regulates+its+neddylation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation.</a> FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).</li>
<li>Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP120A+associates+with+cullins+and+modulates+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).</li>
<li>Goldenberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Cand1-Cul1-Roc1+complex+reveals+regulatory+mechanisms+for+the+assembly+of+the+multisubunit+cullin-dependent+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases.</a> Cell. 119 (4), 517-528 (2004).</li>
<li>Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ETA2%2C+an+apparent+ortholog+of+the+human+cullin-interacting+protein+CAND1%2C+is+required+for+auxin+responses+mediated+by+the+SCF%28TIR1%29+ubiquitin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase.</a> Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+CAND1%2C+an+Unmodified+CUL1-Interacting+Protein%2C+Is+Involved+in+Multiple+Developmental+Pathways+Controlled+by+Ubiquitin%2FProteasome-Mediated+Protein+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22the+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation.</a> the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).</li>
<li>Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtCAND1%2C+a+HEAT-repeat+protein+that+participates+in+auxin+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).</li>
<li>Lo, S. -C., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAND1-Mediated+Substrate+Adaptor+Recycling+Is+Required+for+Efficient+Repression+of+Nrf2+by+Keap1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).</li>
<li>Okamoto, K., Sako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+FRET+for+the+study+of+protein+interactions+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).</li>
<li>Hussain, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint%22%5BJournal%5D)">An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET).</a> arXiv preprint. , (2009).</li>
<li>Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+and+purification+of+recombinant+SCF+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases.</a> Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).</li>
<li>Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortagging%3A+A+versatile+method+for+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sortagging: A versatile method for protein labeling.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).</li>
<li>Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Protein+Labeling+via+Sortase-Mediated+Transpeptidation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-PAGE+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">SDS-PAGE of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+E2-E3+Assembly+and+Disassembly+Enable+Processive+Ubiquitylation+of+Cullin-RING+Ubiquitin+Ligase+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates.</a> Cell. 139 (5), 957-968 (2009).</li>
<li>Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Stopped-flow+Kinetics+Methods+to+Investigate+the+Mechanism+of+Action+of+a+DNA+Repair+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).</li>
<li>Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Stopped-Flow+Fluorescence+and+Labeled+Nucleotides+to+Analyze+the+ATP+Turnover+Cycle+of+Kinesins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).</li>
<li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li>
<li>Lin, C. T., Rorabacher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+approach+for+stopped-flow+kinetics+of+fast+second-order+reactions+involving+inhomogeneity+in+the+reaction+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell.</a> Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).</li>
<li>Toseland, C. P., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Reaction+Kinetic+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Fluorescent+Methods+for+Molecular+Motors%22%5BJournal%5D)">Rapid Reaction Kinetic Techniques.</a> Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Lin, C. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase-catalyzed+site-specific+conjugation+of+small-molecule+probes+to+proteins+in+vitro+and+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+short+peptide+tag+for+versatile+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).</li>
<li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiaspro%2C+A+%22Handbook+Of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook Of Biological Confocal Microscopy</a>. , 690-702 (2006).</li>
<li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo%3A+Basis+of+biosensor+construction%2C+live+imaging%2C+and+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).</li>
<li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+GTPase+movement+on+an+RNA+scaffold+drives+co-translational+protein+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting.</a> Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).</li>
<li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

FRET 是一种在研究和理解生物系统方面具有重要意义的物理现象19。本文提供了一种用于检测并利用 FRET 研究两种相互作用蛋白结合动力学的实验方案。在设计 FRET 实验时，我们考虑了三个主要因素：供体发射光谱与受体激发光谱之间的光谱重叠程度、两个荧光基团之间的距离，以及荧光基团的偶极取向28。为了选择适用于 FRET 的荧光基团，我们叠加了各荧光基团的激发和发射光谱，并寻找那些发射峰分离良好，同时供体的发射光谱与受体的激发光谱有显著重叠的荧光基团组合（图2）。为了优化荧光基团之间的距离和取向，我们借助了晶体结构进行分析，优先考虑将荧光基团连接至蛋白质的末端，主要是因为这样对蛋白质结构和活性的干扰风险较低。由于 Cand1 的 N 末端（Cand1NTD）与 Cul1 的 C 末端（Cul1CTD）之间的距离，比 Cand1 的 C 末端与 Cul1 的 N 末端之间的距离更短（图1</stron...

生物学功能最终由蛋白质执行，其中大多数蛋白质需要与其他蛋白质相互作用才能发挥正常的生物学功能。通过计算方法估计，人类体内的蛋白质-蛋白质相互作用总数约为 650,000 个1，而这些相互作用的破坏通常会导致疾病2。由于蛋白质-蛋白质相互作用在调控细胞和有机体过程中的关键作用，目前已开发出多种研究方法，例如酵母双杂交、双分子荧光互补、分裂荧光素酶互补以及共免疫沉淀实验3。尽管这些方法在发现和验证蛋白质-蛋白质相互作用方面效果良好，但通常缺乏定量能力，因此难以提供有关相互作用蛋白对之间亲和力的详细信息。定量 pull-down 实验可用于测定结合亲和力（例如解离常数 Kd），但无法测量结合动力学，且当 Kd 值极低时，由于信噪比不足，该方法也不适用4。表面等离子共振（SPR）光谱技术可定量测定结合动力学，但需要将其中一种反应物固定在特定表面上，这一过程可能改变反应物的结合特性5。此外，SPR 难以准确测量快速的结合与解离速率5，也不适用于表征蛋白质复合物中蛋白亚基的交换过程。本文介绍一种可在毫秒时间尺度上测量蛋白质复合物组装与解离速率的方法。该方法对于确定Cullin-associated-Nedd8-dissociated protein 1（Cand1）作为 F-box 蛋白交换因子的作用至关重要6,7。
Cand1 调控 Skp1•Cul1•F-box 蛋白（SCF）E3 连接酶的动态，这类酶属于 Cullin-RING 泛素连接酶这一大蛋白家族。SCF 复合物由骨架蛋白 Cul1 组成，Cul1 结合含有 RING 结构域的蛋白 Rbx1，同时通过适配蛋白 Skp1 结合并招募可更换的 F-box 蛋白，后者负责识别底物8。作为 E3 连接酶，SCF 催化泛素与其底物的共价连接，当 F-box 蛋白招募底物且 Cul1 被类泛素蛋白 Nedd8 修饰时，SCF 被激活9。Cand1 结合未修饰的 Cul1，其结合会破坏 Skp1•F-box 蛋白与 Cul1 的相互作用，同时抑制 Nedd8 与 Cul1 的共价连接10,11,12,13。因此，在体外实验中 Cand1 似乎抑制 SCF 活性；然而，在生物体内缺失 Cand1 却导致功能缺陷，提示 Cand1 在体内对 SCF 活性具有正向调控作用14,15,16,17。这一矛盾最终通过一项定量研究得以阐明，该研究揭示了 Cul1、Cand1 与 Skp1•F-box 蛋白之间动态的相互作用关系。研究人员利用荧光共振能量转移（FRET）检测技术，分别测量了 SCF 复合物和 Cul1•Cand1 复合物形成的结合与解离速率常数（分别为 kon 和 koff）。结果表明，Cand1 与 Skp1•F-box 蛋白均能与 Cul1 形成极为稳定的复合物，但 Cand1 显著提高 SCF 复合物的 koff，而 Skp1•F-box 蛋白则显著提高 Cul1•Cand1 复合物的 koff6,7。这些结果为将 Cand1 定义为一种蛋白交换因子提供了最初的也是关键的证据，即 Cand1 通过将 Cul1 从旧的 SCF 复合物中回收，促进新的 SCF 复合物的形成。
本文介绍了开发和使用FRET检测方法研究Cul1•Cand1复合物动态过程的实验步骤7，该原理同样适用于研究多种生物分子的动态行为。当供体被适当波长的光激发，且在10–100 Å距离内存在激发光谱与供体发射光谱重叠的受体时，即发生荧光共振能量转移（FRET）。此时激发态能量转移至受体，导致供体荧光强度降低，同时受体荧光强度增强18。FRET效率（E）取决于弗斯特半径（R0）以及供体与受体荧光团之间的距离（r），其定义为：E = R06/(R06 + r6)。弗斯特半径（R0）受多种因素影响，包括偶极子角度取向、供体-受体对的光谱重叠程度以及所用溶液的性质19。为了在停流荧光仪上应用FRET检测技术——该仪器可实时监测供体发射光的变化，并实现对快速结合速率（kon）和解离速率（koff）的测量——必须建立高效的FRET效应，从而显著降低供体发射信号。因此，选择合适的荧光染料组合以及在目标蛋白上选择适当的染料标记位点，以设计高效的FRET体系，是本实验方案中的关键环节，将在下文详细讨论。

<table><tbody><tr><td>阴离子交换层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17505301</td><td>HiTrap Q FF 阴离子交换层析柱</td></tr><tr><td>台式冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>2231000511</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 感受态细胞</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C78-500</td><td></td></tr><tr><td>阳离子交换层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17505401</td><td>HiTrap SP Sepharose FF</td></tr><tr><td>脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>落地式离心机（高速）</td><td>Beckman Coulter</td><td>J2-MC</td><td></td></tr><tr><td>落地式离心机（低速）</td><td>Beckman Coulter</td><td>J6-MI</td><td></td></tr><tr><td>荧光光谱查看器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr><tr><td>FluoroMax 荧光分光光度计</td><td>HORIBA</td><td>FluoroMax-3</td><td></td></tr><tr><td>FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>GGGG&lt;sup&gt;AMC&lt;/sup&gt; 肽</td><td>New England Peptide</td><td>定制合成</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽琼脂糖微珠</td><td>GE Healthcare</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-529-019</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>卵清蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>A2512</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-4T-2 载体</td><td>GE Healthcare</td><td>28954550</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>MilliporeSigma</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>还原型谷胱甘肽</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25211</td><td></td></tr><tr><td>冷冻摇床</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 感受态细胞</td><td>MilliporeSigma</td><td>70953-3</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 10/300 GL 柱</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>停流荧光分光光度计</td><td>Hi-Tech Scientific</td><td>SF-61 DX2</td><td></td></tr><tr><td>TCEP&amp;middot;HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI20490</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>超滤膜</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC903008</td><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置，Ultra-15，30,000 NMWL</td></tr></tbody></table>

利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

蛋白质是生物系统的主要执行者，通常通过与其他大分子或小分子相互作用来实现其生物学功能。这些相互作用往往具有高度动态性，即相互作用的亚基以特定速率持续地结合与解离。虽然利用定量免疫共沉淀等技术测定结合亲和力可揭示相互作用的强度，但研究结合动力学则能进一步阐明相互作用发生的快慢以及每个复合物可存续的时间。此外，在存在其他因子（如蛋白质交换因子或药物）的情况下测定相互作用的动力学，有助于揭示该因子对相互作用的调控机制，从而为生物与医学研究的进展提供重要信息。本文介绍了一种用于测定蛋白质复合物结合动力学的实验方案，该复合物具有较高的内在结合速率，并可被另一种蛋白质快速解离。该方法利用荧光共振能量转移（FRET）在体外报告蛋白质复合物的形成，并可在停流荧光光度计上实时监测复合物快速的结合与解离过程。通过该检测方法，可定量获得该蛋白质复合物的结合与解离速率常数。

为了检测 Cul1AMC 与 FlAsHCand1 之间的荧光共振能量转移（FRET），我们首先分别测定了 70 nM Cul1AMC（供体）和 70 nM FlAsHCand1（受体）的发射强度（图 3A-C，蓝色线条）。在每次分析中仅出现一个发射峰，且 FlAsHCand1（受体）的发射信号较弱。当将 70 nM Cul1AMC 和 70 nM FlAsHCand1 混合以产生 FRET 时，发射光谱中出现两个发射峰，Cul1AMC 的峰强度降低，而 FlAsHCand1 的峰强度升高（图 3A-C，红色线条）。当使用全长 Cand1 进行 FRET 实验时，供体峰强度降低了 10%（<s...

蛋白质-蛋白质相互作用对生物系统至关重要，对结合动力学的研究有助于揭示蛋白质复合物的动态特性与功能。本文介绍一种利用荧光共振能量转移和停流技术来定量测定蛋白质复合物动力学参数的方法。&#160;

蛋白质是生物系统的主要执行者，通常通过与其他大分子或小分子相互作用来实现其生物学功能……

我们的方法有助于研究蛋白质复合物形成的动力学过程。该方法可描述蛋白质复合物结合的紧密程度，并判断其他蛋白质是否干扰了该复合物的形成。本技术利用荧光作为报告信号，以定量方式研究蛋白质-蛋白质相互作用，我们的检测方法能够实时监测蛋白质复合物的结合与解离过程。首先，从蛋白质数据库中获取 COL1 CAND1 复合物的数据，开始设计 FRET 实验。在 PyMOL 中加载该结构，然后进入向导菜单，使用测量功能估算 CAND1 的第一个氨基酸与 COL1 的最后一个氨基酸之间的距离。接着，打开在线光谱查看器，同时查看 7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin）和 FlASH 的激发光谱和发射光谱。AMC 是 FRET 供体，FlASH 是 FRET 受体。请按照随附的文字版实验方案制备含有 FRET 供体蛋白的细胞。随后，通过向表达 COL1 分选酶 RBX1 复合物的大肠杆菌细胞沉淀中加入 50 毫升裂解缓冲液，来纯化 COL1 分选酶 RBX1 复合物。将细胞置于冰上进行超声处理，超声功率为50%。交替开启和关闭超声，每次各持续1秒，交替处理3分钟，以防止样品过热。将得到的细胞裂解液转移至50毫升离心管中，于25,000 × g离心45分钟，以去除细胞碎片。然后，将上清液加入到5 mL谷胱甘肽琼脂糖珠中，在4°C孵育以清除细胞裂解液。孵育后，在4°C下以1,500 × g离心珠子与裂解液的混合物2分钟。随后，弃去上清液。接下来，用5毫升不含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液洗涤磁珠。离心溶液后，弃去上清液。然后，向洗涤后的磁珠中加入3毫升裂解缓冲液，并将磁珠悬液转移至一个空柱中。向新柱中加入5 mL洗脱缓冲液，孵育10分钟后收集洗脱液。接着，向谷胱甘肽珠洗脱液中加入200 µL浓度为5 mg/mL的凝血酶。在4°C过夜孵育后，用缓冲液A将蛋白质样品稀释三倍。以0.5 mL/min的流速将蛋白质样品上样至经缓冲液A平衡的阳离子交换层析柱。然后，将缓冲液A中的缓冲液B以0%至50%的梯度加入，以每分钟1毫升的流速洗脱蛋白质。接下来，收集含有FRET供体蛋白的洗脱组分，并使用截留分子量为30千道尔顿的超滤膜将其浓缩至2.5毫升。现在，通过分步置换法使用脱盐柱将FRET供体蛋白样品的缓冲液置换为分选酶缓冲液，随后通过分选酶介导的转肽反应将7-氨基-4-甲基香豆素添加到COL1的C末端。为此，首先用 25 毫升分选酶缓冲液平衡脱盐柱。然后，将 2.5 毫升 FRET 供体蛋白溶液上样至柱中，并弃去穿流液。接着，用 3.5 毫升分选酶缓冲液洗脱样品，并收集穿流液。在900微升洗脱液中，加入100微升600微摩尔的纯化分选酶A溶液和10微升25毫摩尔的GGGG-AMC肽。将反应混合物在30°C避光条件下孵育过夜，以生成COL1-AMC-RBX1。随后，将全部样品上样至尺寸排阻色谱柱，并用1.5倍柱体积的缓冲液进行洗脱。最后，合并含有 COL1-AMC-RBX1 的洗脱组分。按照文本方案中的步骤制备 FRET 受体蛋白。许多步骤与 FRET 供体蛋白的制备相似。完成后，准备 FlASH CAND1 溶液。首先，将 1 µL FlASH 溶液加入 50 µL 新配制的四-半胱氨酸-CAND1 溶液中。充分混匀混合液，并在室温避光条件下孵育 1 至 2 小时，以形成 FlASH CAND1 溶液。在 300 微升 FRET 缓冲液中，加入 COL1-AMC-RBX1 至终浓度为 70 纳摩尔，并将溶液转移至比色皿中。将比色皿放入荧光分光光度计的样品室。用 350 纳米激发光激发样品，并以 1 纳米为增量，扫描 400 至 600 纳米范围内的发射信号。然后，在300微升FRET缓冲液中，加入COL1-AMC-RBX1和FlASH-CAND1，使其终浓度均为70纳摩尔。用350纳米的激发光激发样品，并以1纳米为增量，扫描400至600纳米范围内的发射信号。将激发光设定为350纳米，使用带通滤光片，允许450纳米的发射光通过，同时阻断500至650纳米的发射光。将样品阀置于填充位置，连接一支装有3 mL水的注射器。然后，通过多次上下移动样品注射器驱动装置，用水清洗两支样品注射器，完成后弃去水。接着，连接一支装有FRET缓冲液的3 mL注射器。用FRET缓冲液清洗两个样品注射器，通过多次上下移动样品注射器驱动器进行清洗，完成后弃去废液。现在，连接一个三毫升注射器，将第一个样品注射器（注射器A）中加入100纳摩尔的COL1-AMC-RBX1溶于FRET缓冲液中。然后将样品阀转至驱动位置。同时，将另一个三毫升注射器连接至注射器B，并在注射器B中加入100纳摩尔的FlASH CAND1溶于FRET缓冲液中，然后将其阀门转至驱动位置。在软件的“采集”下打开控制面板，记录 COL1-AMC 在 60 秒内的发射信号。然后，进行单次拍摄。将每次拍摄中随时间测得的荧光信号下降拟合为单指数曲线。按照之前所示方法清洗系统，然后将含有100 纳摩尔 COL1-AMC-RBX1 和100 纳摩尔 FlASH CAND1 的FRET缓冲液加入至注射器A中。将注射器A连接至系统，并保持其处于填充位置。加载注射器A，然后将样品阀转至驱动位置。接着，将Skp1-Skp2溶液加入至注射器B中。将注射器B连接至系统，并保持其处于填充位置。加载注射器B，然后将样品阀转至驱动位置。在软件中，进入采集并打开控制面板。设置程序以记录 COL1-AMC 在 30 秒内的发射信号，然后进行单次拍摄。将注射器A和注射器B中的溶液混合后，荧光信号随时间逐渐增强。当分别含有70纳米浓度的COL1-AMC和FlASH CAND1的溶液混合以产生FRET时，发射光谱中出现两个发射峰，其中COL1-AMC的峰高降低，而FlASH CAND1的峰高升高。当使用全长CAND1进行FRET实验时，供体峰的强度降低了10%。然而，当使用其第一个螺旋被截短的CAND1时，供体荧光峰强度的降低增加至30%，表明FRET效率更高。为了证实信号变化来源于COL1-AMC与FlASH标记的CAND1之间的FRET，将供体FRET与过量未标记的CAND1（即“Chase”）混合，以竞争结合受体。结果发现，供体荧光峰完全恢复，而受体荧光峰则下降。此处显示的是通过线性回归分析得到的平均观测K值随CAND1浓度变化的曲线图。为了测定该复合物的结合速率常数，使用了50 纳摩尔的COL1-AMC，并通过将50 纳摩尔的COL1-AMC与逐渐增加浓度的FlASH CAND1混合，测量了一系列观测到的解离速率常数。与结合速率常数的测定类似，通过在停流荧光仪上监测供体信号随时间的恢复情况，得到COL1与CAND1的观测解离速率常数。在此实验中，供体信号迅速增强，测得的观测K值为每秒0.4。相比之下，当缓冲液加入预先组装的复合物时，未观察到信号增加，表明COL1 CAND1的快速解离是由Skp1 Skp2触发的。务必尽量减少供体和受体蛋白暴露于光照的量。应尽可能将荧光基团保存在避光环境中。

using-vitro-fluorescence-resonance-energy-transfer-to-study-dynamics

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

利用体外荧光共振能量转移研究毫秒时间尺度蛋白质配合物的动力学

本方案描述了如何利用基于FRET的邻近检测技术对蛋白质-蛋白质相互作用进行成像。...

蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

本视频展示了利用荧光涨落光谱技术检测细胞间接触处细胞表面蛋白相互作用的方法。通过表达带有荧光蛋白标记的跨膜黏附受体，并混合携带两种光谱可区分荧光标记的不同细胞群体，可评估相邻细胞间不同颜色荧光标记受体之间的跨膜相互作用。 通过...

利用荧光涨落光谱研究细胞接触处的蛋白质相互作用

蛋白质功能的关键步骤，特别是主链构象变化和质子转移反应，通常发生在微秒到毫秒的时间尺度上。这些动力学过程可以通过时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱技术进行研究，尤其适用于其功能由光触发的蛋白质。...

利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱研究光敏蛋白中的质子转移与蛋白质构象动力学

本方案描述了一种基于荧光共振能量转移和荧光寿命成像显微技术，用于定量可视化SNARE蛋白复合物形成的新方法。...

利用荧光寿命成像显微镜观察细胞内SNARE的运输

本文介绍了一种获取三色单分子FRET数据并利用三维系综隐马尔可夫模型进行分析的实验方案。通过该方法，科研人员可以从复杂的蛋白质系统中提取动力学信息，包括协同效应或相关联的相互作用。...

利用三色单分子FRET研究蛋白质相互作用的相关性

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

两种荧光分子之间的弗ör斯特共振能量转移（FRET）可用于研究活细胞中的蛋白质相互作用。本文提供了一种通过共聚焦激光扫描显微镜检测受体的敏化发射以及供体分子的淬灭来测量活细胞中FRET的实验方案。...

利用FRET敏化发射在活细胞中评估蛋白质相互作用

时间分辨单分子蛋白质诱导荧光增强是一种有用的荧光光谱邻近传感器，可灵敏检测蛋白质局部结构变化。本文展示了该方法可用于揭示α-突触核蛋白中稳定的局部构象，而使用长程FRET标尺测量时，该蛋白通常被认为呈球状无序且不稳定。...

利用时间分辨的蛋白质诱导荧光增强技术逐个识别单个α-突触核蛋白单体的稳定局部构象

单分子荧光能量转移是一种用于追踪核糖体蛋白质合成过程中tRNA动态变化的方法。通过追踪单个核糖体，可以识别出非均质的群体，从而揭示其作用机制。该方法也可广泛用于追踪生物分子的构象变化，以阐明多种复杂生物系统中动态特性与功能之间的关系。单分子方法能够观测到传统系综方法因平均效应而无法捕捉的非限速步骤以及低丰度的关键中间态。...

单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成

我们介绍了一种实验方案和数据分析流程，用于在活细胞中结合现代荧光标记技术，开展活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与荧光共振能量转移（FRET）联用研究膜受体动力学。...

双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

了解利用荧光共振能量转移和停流技术研究蛋白质复合物毫秒级动力学的方法。该技术可实时监测蛋白质复合物的形成与解离，定量分析结合动力学参数。

利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

探索更多视频