利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

我们的方法有助于研究蛋白质复合物形成的动力学过程。该方法可描述蛋白质复合物结合的紧密程度，并判断其他蛋白质是否干扰了该复合物的形成。本技术利用荧光作为报告信号，以定量方式研究蛋白质-蛋白质相互作用，我们的检测方法能够实时监测蛋白质复合物的结合与解离过程。

首先，从蛋白质数据库中获取 COL1 CAND1 复合物的数据，开始设计 FRET 实验。在 PyMOL 中加载该结构，然后进入向导菜单，使用测量功能估算 CAND1 的第一个氨基酸与 COL1 的最后一个氨基酸之间的距离。接着，打开在线光谱查看器，同时查看 7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin）和 FlASH 的激发光谱和发射光谱。

AMC 是 FRET 供体，FlASH 是 FRET 受体。请按照随附的文字版实验方案制备含有 FRET 供体蛋白的细胞。随后，通过向表达 COL1 分选酶 RBX1 复合物的大肠杆菌细胞沉淀中加入 50 毫升裂解缓冲液，来纯化 COL1 分选酶 RBX1 复合物。

将细胞置于冰上进行超声处理，超声功率为50%。交替开启和关闭超声，每次各持续1秒，交替处理3分钟，以防止样品过热。将得到的细胞裂解液转移至50毫升离心管中，于25,000 × g离心45分钟，以去除细胞碎片。

然后，将上清液加入到5 mL谷胱甘肽琼脂糖珠中，在4°C孵育以清除细胞裂解液。孵育后，在4°C下以1,500 × g离心珠子与裂解液的混合物2分钟。随后，弃去上清液。

接下来，用5毫升不含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液洗涤磁珠。离心溶液后，弃去上清液。然后，向洗涤后的磁珠中加入3毫升裂解缓冲液，并将磁珠悬液转移至一个空柱中。

向新柱中加入5 mL洗脱缓冲液，孵育10分钟后收集洗脱液。接着，向谷胱甘肽珠洗脱液中加入200 µL浓度为5 mg/mL的凝血酶。在4°C过夜孵育后，用缓冲液A将蛋白质样品稀释三倍。以0.5 mL/min的流速将蛋白质样品上样至经缓冲液A平衡的阳离子交换层析柱。

然后，将缓冲液A中的缓冲液B以0%至50%的梯度加入，以每分钟1毫升的流速洗脱蛋白质。接下来，收集含有FRET供体蛋白的洗脱组分，并使用截留分子量为30千道尔顿的超滤膜将其浓缩至2.5毫升。现在，通过分步置换法使用脱盐柱将FRET供体蛋白样品的缓冲液置换为分选酶缓冲液，随后通过分选酶介导的转肽反应将7-氨基-4-甲基香豆素添加到COL1的C末端。

为此，首先用 25 毫升分选酶缓冲液平衡脱盐柱。然后，将 2.5 毫升 FRET 供体蛋白溶液上样至柱中，并弃去穿流液。接着，用 3.5 毫升分选酶缓冲液洗脱样品，并收集穿流液。

在900微升洗脱液中，加入100微升600微摩尔的纯化分选酶A溶液和10微升25毫摩尔的GGGG-AMC肽。将反应混合物在30°C避光条件下孵育过夜，以生成COL1-AMC-RBX1。随后，将全部样品上样至尺寸排阻色谱柱，并用1.5倍柱体积的缓冲液进行洗脱。

最后，合并含有 COL1-AMC-RBX1 的洗脱组分。按照文本方案中的步骤制备 FRET 受体蛋白。许多步骤与 FRET 供体蛋白的制备相似。

完成后，准备 FlASH CAND1 溶液。首先，将 1 µL FlASH 溶液加入 50 µL 新配制的四-半胱氨酸-CAND1 溶液中。充分混匀混合液，并在室温避光条件下孵育 1 至 2 小时，以形成 FlASH CAND1 溶液。

在 300 微升 FRET 缓冲液中，加入 COL1-AMC-RBX1 至终浓度为 70 纳摩尔，并将溶液转移至比色皿中。将比色皿放入荧光分光光度计的样品室。用 350 纳米激发光激发样品，并以 1 纳米为增量，扫描 400 至 600 纳米范围内的发射信号。

然后，在300微升FRET缓冲液中，加入COL1-AMC-RBX1和FlASH-CAND1，使其终浓度均为70纳摩尔。用350纳米的激发光激发样品，并以1纳米为增量，扫描400至600纳米范围内的发射信号。将激发光设定为350纳米，使用带通滤光片，允许450纳米的发射光通过，同时阻断500至650纳米的发射光。

将样品阀置于填充位置，连接一支装有3 mL水的注射器。然后，通过多次上下移动样品注射器驱动装置，用水清洗两支样品注射器，完成后弃去水。接着，连接一支装有FRET缓冲液的3 mL注射器。

用FRET缓冲液清洗两个样品注射器，通过多次上下移动样品注射器驱动器进行清洗，完成后弃去废液。现在，连接一个三毫升注射器，将第一个样品注射器（注射器A）中加入100纳摩尔的COL1-AMC-RBX1溶于FRET缓冲液中。然后将样品阀转至驱动位置。同时，将另一个三毫升注射器连接至注射器B，并在注射器B中加入100纳摩尔的FlASH CAND1溶于FRET缓冲液中，然后将其阀门转至驱动位置。

在软件的“采集”下打开控制面板，记录 COL1-AMC 在 60 秒内的发射信号。然后，进行单次拍摄。将每次拍摄中随时间测得的荧光信号下降拟合为单指数曲线。

按照之前所示方法清洗系统，然后将含有100 纳摩尔 COL1-AMC-RBX1 和100 纳摩尔 FlASH CAND1 的FRET缓冲液加入至注射器A中。将注射器A连接至系统，并保持其处于填充位置。加载注射器A，然后将样品阀转至驱动位置。接着，将Skp1-Skp2溶液加入至注射器B中。将注射器B连接至系统，并保持其处于填充位置。加载注射器B，然后将样品阀转至驱动位置。

在软件中，进入采集并打开控制面板。设置程序以记录 COL1-AMC 在 30 秒内的发射信号，然后进行单次拍摄。

将注射器A和注射器B中的溶液混合后，荧光信号随时间逐渐增强。当分别含有70纳米浓度的COL1-AMC和FlASH CAND1的溶液混合以产生FRET时，发射光谱中出现两个发射峰，其中COL1-AMC的峰高降低，而FlASH CAND1的峰高升高。当使用全长CAND1进行FRET实验时，供体峰的强度降低了10%。

然而，当使用其第一个螺旋被截短的CAND1时，供体荧光峰强度的降低增加至30%，表明FRET效率更高。为了证实信号变化来源于COL1-AMC与FlASH标记的CAND1之间的FRET，将供体FRET与过量未标记的CAND1（即“Chase”）混合，以竞争结合受体。结果发现，供体荧光峰完全恢复，而受体荧光峰则下降。此处显示的是通过线性回归分析得到的平均观测K值随CAND1浓度变化的曲线图。

为了测定该复合物的结合速率常数，使用了50 纳摩尔的COL1-AMC，并通过将50 纳摩尔的COL1-AMC与逐渐增加浓度的FlASH CAND1混合，测量了一系列观测到的解离速率常数。与结合速率常数的测定类似，通过在停流荧光仪上监测供体信号随时间的恢复情况，得到COL1与CAND1的观测解离速率常数。在此实验中，供体信号迅速增强，测得的观测K值为每秒0.4。

相比之下，当缓冲液加入预先组装的复合物时，未观察到信号增加，表明COL1 CAND1的快速解离是由Skp1 Skp2触发的。务必尽量减少供体和受体蛋白暴露于光照的量。应尽可能将荧光基团保存在避光环境中。