Name: 3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von 3D-PDMS-Geräten zur Analyse zellulärer Reaktionen auf Chemoattraktantien-Gradienten in Organoiden. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen in der Zellbiologie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien an AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048) und NCI U54 CA210173) und AL (U54CA209992).

Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee, Johns Hopkins University, School of Medicine, geprüft und genehmigt wurden.
1. Herstellung des mesofluidischen Geräts
<ol><li>Entwerfen Sie die Maske der Form für PDMS-Gerät mit einer 3D-CAD-Software.</li>
	<li>Drucken Sie die Form mit Stereolithografiegeräten mit einem wärmebeständigen Harz. Hinweis: Die hier beschriebenen Verfahren wurden von einem kommerziellen 3D-Druckdienst durchgeführt.</li>
	<li>Mischen Sie eine PDMS-Monomerlösung mit dem Härtemittel in einem 10:1-Verhältnis gründlich. 3 mL PDM-Mischung wurde für die Herstellung des Gerätes benötigt. Das Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der zu fertiger Formen ab.</li>
	<li>Das Gemisch durch den Einsatz eines eigenen Laborvakuums oder einer Vakuumpumpe in einem Vakuumtrockner 1 Stunde abstaubar.</li>
	<li>Die Oberfläche der Form mit einem Klebeband ablöschen, um Staub zu entfernen, und dann die PDMS-Mischung in die Form gießen. Wenn Blasen in den Prozess eingeführt werden, wiederholen Sie die Entgasung im Vakuumtrockner. Blasen, die zwischen den Säulen der Form gefangen sind, können entfernt werden, indem man sie mit einer scharfen Nadel versenkt. Achtung: Der Entgasungsprozess bei Raumtemperatur sollte innerhalb von 1 Stunde oder weniger durchgeführt werden.</li>
	<li>Sichern Sie den PDMS, indem Sie bei 80 ° C für 2 Stunden heizen. Lassen Sie die Form bei Raumtemperatur abkühlen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Grenze zwischen Schimmel und PDMS mit einer Klinge und schälen Sie dann PDMS von der Form vorsichtig ab.</li>
	<li>Das PDMS-Teil auf die 22 mm x 22 mm Coverslip montieren und ein Loch am Eingang schlagen. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	<li>Reinigen Sie das PDMS-Keil und 22 mm x 22 mm Koverslip, indem Sie die Oberflächen mit Lowlint-Gewebe und 70% Ethanol abwischen. Dann große Staubpartikel entfernen, indem sie mit einem Klebeband abnehmen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie das PDMS-Teil und kupfen Sie entweder durch Autoklaven (121 ° C für 8 Minuten nass, 15 Minuten trocken) oder durch UV-Licht für 1 Stunde.</li>
	<li>Die Unterseite des PDMS-Teils behandeln und mit einer Korona-Auslasspistole 5 min in der Gewebekultur abdecken und dann miteinander verbinden. CAUTION: Legen Sie alle nicht leitenden Materialien wie Polystyrol-Schaum auf den Boden und entfernen Sie dabei alle leitenden Materialien. Sammeln innerhalb von 5 Minuten nach der Behandlung in das Gerät einspritzen, um die Bindung zwischen Kollagengel und Glaskappenlippe zu erhöhen.</li>
</ol>2. Zellvorbereitung: Primäres Säugetierorganoid-Isolierung
Hinweis: Die Details der Säugetierung der Organoiden finden Sie in einem früheren Werk 11. Jede Art von Einzelzelle oder Organoid kann nach eigenen Isolation-/Ablösungsprotokollen hergestellt werden.
<ol><li>Das Brustdrüsengewebe der Mäuse mit einem Skalpell würfeln, bis sich das Gewebe entspannt und 30 min bei 37 ° C in 50 mL Collagenase-/Trypsin-Lösung (10 mL pro Maus) in DEME/F12 mit 0,1 g Trypsin, 0,1 g Kollagenase, schütteln , 5 mL FBS, 250 μL von 1 μg/mL Insulin und 50 μL von 50 μg/mL gentamicin.</li>
	<li>Zentrifuge die Collagenase/trypsin Lösung mit 1.250 x g für 10 min. Entfernen Sie den Supernatant durch Aspiration. Die Zellen in 10 mL von DMEM/F12 und die Zentrifuge mit 1.250 x g für 10 min zerlegen. Nach dem Entfernen von DMEM/F12 durch Aspiration, wieder Suspendierung von Zellen in 4 ml DMEM/F12 mit 40 μL DNase (2 units/μL) ergänzt.</li>
	<li>Schütteln Sie die DNase-Lösung von Hand für 2-5 min und dann Zentrifuge mit 1.250 x g für 10 min.</li>
	<li>Trennen Sie Organoide von einzelnen Zellen durch vier Differentialzentrifugationen (pulsieren Sie auf 1.250 x g und stoppen Sie die Zentrifuge 3-4 s, nachdem sie die beabsichtigte Geschwindigkeit erreicht hat). Zwischen jedem Puls, saugen Sie den Supernatant und erneuern Sie das Pellet in 10 mL DMEM/F12.</li>
	<li>Das abschließende Pellet in der gewünschten Menge an Wachstumsmedium von DMEM/F12 mit 1% Penicillin/Streptomycin und 1% Insulin-Transferrin-selenium-X für die Kollagenvorbereitung neu aussetzen.</li>
</ol>3. Kollagenvorbereitung und Injektion
Hinweis: Andere ECM-Gele können nach eigenen Gelengeprotokollen hergestellt werden.
<ol><li>Bereiten Sie Collagen-Typ I-Lösung (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH-Lösung, normales Wachstumsmedium auf Eis. Achtung: Halten Sie Eis auf, bis das Verfahren abgeschlossen ist.</li>
	<li>6 μL von 1 N NaOH-Lösung, 200 μL Wachstumsmedium und 50 μL von 10x DMEM in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr geben und die Lösung gründlich vermischen.</li>
	<li>425 μL Kollagen in die vorgemischte Lösung geben und durch Pipettieren gründlich mischen.</li>
	<li>Zentrifugen Sie die Kollagenmischung kurz (weniger als 5 Sekunden), um Blasen aus der Mischung zu trennen und zu entfernen.</li>
	<li>Halten Sie die neutralisierte Kollagenlösung 1 Stunde lang auf Eis, um die Faserbildung zu induzieren.</li>
	<li>50 μL Zellaufhängung in das Kollagen-Gemisch geben und gründlich mischen. Hinweis: Die endgültige Kollagenkonzentration beträgt 2 mg/mL.</li>
	<li>Die Lösung mit 200 μL Pipet über den Eingang des PDMS-Geräts eingeben, bis die ganze Kammer ausgefüllt ist. Wenn das Kollagengemisch durch die Lücken der Säulen überfließt, schneiden Sie das überschüssige Kollagengel mit scharfem OP-Klinge nach Gelation aus.</li>
	<li>Halten Sie das Gerät im Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO2 für 1 Stunde, um Gelation zu induzieren.</li>
	<li>Füllen Sie die Behälter beidseitig mit Wachstumsmedium aus und halten Sie das Gerät bei 37 ° C mit 5% CO2 im Inkubator, bis eine konfokale Bildgebung durchgeführt wird.</li>
</ol>4.3D-Bildgebung und Quantifizierung
<ol><li>Installieren Sie eine Live-Zell-Bildationskammer in ein konfokales Mikroskop und stellen Sie die Temperatur und CO 2 auf 37 ° C bzw. 5% vor. Um Feuchtigkeit zu erhöhen, Wasser in den Behälter der Kammer geben und bei Bedarf nasse Tücher in die Kammer legen.</li>
	<li>Legen Sie das PDMS-Gerät in die Kammer und fügen Sie EGF zu einem der Reservoirs als "Quelle" des EGF in der Gradientenbildung hinzu. Das andere Reservoir wird einem "Spülbecken" dienen, das für die Entwicklung der räumlich gestaffelten EGF-Verteilung benötigt wird. 2,5 nM EGF wurde in der Spüle für die Herstellung der Steigung von 0,5 nM/mm in dieser Studie hinzugefügt.</li>
	<li>Stellen Sie die Palette des Z-Stapels ein, der das Volumen der organoiden von Interesse abdeckt, und starten Sie die Bildgebung. CAUTION: Um die Phototoxizität zu vermeiden, versuchen Sie eine geringere Laserintensität in der konfokalen Bildgebung oder verwenden Sie Multi-Photon-Bildgebungstechniken.</li>
	<li>Rekonstruieren Sie ein 3D-Bild aus 2D-Bildstapel mit kommerzieller Software oder einem maßgeschneiderten Programm. Messen Sie die Länge und den Winkel der Zweige, die sich von den Organoiden oder der Migration einzelner Zellen erstrecken. Führen Sie hier die Quantifizierung durch, indem Sie mit ImageJ eine freie Umrisslinie um den organoiden Körper ziehen.</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li>
<li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+emerging+paradigms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Stem+Cell+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720(2015).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Herstellung von PDMS-Formen erfolgte mit einem kommerziellen 3D-Druckservice, kann aber auch mit einem High-End-3D-Drucker im eigenen Haus durchgeführt werden. Die Stereolithographie wird unter den verschiedenen 3D-Fertigungsmethoden für hochauflösende Formengenerationen empfohlen. Da die PDMS-Härtung bei einer hohen Temperatur (80 ° C) erfolgt, sollten die Materialien ausreichend thermisch beständig sein, was bei Auslagerung des Drucks explizit angegeben werden sollte. Eine thermische Nachkur kann mit dem Druckdiens...

In physiologischer Umgebung sind Zellen in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet und einer Fülle von Biomolekülen ausgesetzt. Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Mikroumgebung regulieren intrazelluläre Prozesse, die verschiedene Phenotypen steuern, darunter Migration, Wachstum, Differenzierung und Überleben1, 2. In einer herkömmlichen 2D-Zellkultur wurde viel über zelluläre Verhaltensweisen gelernt. Mit dem Aufkommen von intravitalen Bildgebungen und Experimenten mit Zellen, die in 3D-Hydrogelen eingebettet sind, wurden jedoch wichtige Unterschiede in den Zellverhalten in den vereinfachten 2D-In-vitro-Kulturen vs. 3D-Gewebehung-ähnlichen Umgebungen erkannt. Während die Zellen mit ECM-Fasern interagieren und ihre mechanischen Eigenschaften innerhalb der 3D-Matrix spüren, ist die Materialsteifigkeit des Gels keine vollständig unabhängige Variable in einem 2D-In-vitro-System. Die Dimensionalität verändert die fokale Haftbildung, was zu einer unterschiedlichen Zellmorphologie und zum Verhalten führt. Darüber hinaus sind Zellen auf einer 2D-Oberfläche weniger Signalkassen ausgesetzt als Zellen, die in 3D für alle Richtungen offen sind.
Diese Einschränkungen haben die Interessen für 3D-Systeme erhöht, die die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe repräsentieren und besser in vivo-Gewebefunktionen vorhersagen. Sie wurden in vielen Formen entwickelt, von Organoiden als sich selbst zusammenstellende zelluläre Mikrostrukturen bis hin zu Zellen, die zufällig in ECM3,4durchsetzt sind. Die jüngsten Fortschritte in der Mikrofabrikationstechnologie haben das Aufkommen verschiedener Arten von 3D-Kultursystemen5,6,7, 8, 9 fürdie Untersuchung phänotypischer Veränderungen und Mobilartige Reaktionen auf lösliche Signale; Technische Barrieren schränken jedoch den weit verbreiteten Einsatz in Forschungslabors ein. In vielen Fällen erfordern die Herstellungsprozesse Photolithografietechniken und Hintergrundwissen für weiche Lithografie. Darüber hinaus müssen verschiedene Faktoren kontrolliert werden, um ein Gerät erfolgreich zu bauen und über einen langen Zeitraum eine optimale Funktion des Gerätes zu erreichen.
Unsere Methode beschreibt, wie man ein 3D-PDMS-Gerät konstruiert, um Zellen und multizelluläre Organoide in eine 3D-Mikroumgebung mit definierten Chemoattracten-Farbverläufen zu integrieren und dann epitheliale Reaktionen auf EGF10zu analysieren. Unsere Daten zeigen, dass die Fähigkeit von Organoiden, auf flache EGF-Steigungen zu reagieren, aus der interzellulären chemischen Kopplung durch Spaltknoten entsteht. Es schlägt das Potenzial von Organoiden für eine präzisere Erkennung von schwachen und lauten räumlich gestaffelten Eingängen vor. Der Herstellungsprozess erfordert weder eine Reinraumanlage noch Photolithografietechniken. Das 3D-PDMS-Gerät enthält jedoch notwendige Faktoren der 3D-physiologischen Umgebung. Diese Methode wird hilfreich sein, um 3D-zelluläre Verhaltensweisen zu studieren und es hat ein großes Forschungspotenzial mit verschiedenen Zelltypen, Chemoattractants und ECM-Kombinationen.

<table><tbody><tr><td>22mm x 22mm Deckglas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen I, Ratte</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40236</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics 4.2</td><td>COMSOL Inc</td><td></td><td>Zur Simulation der Diffusionsdynamik</td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>DEME/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4623</td><td></td></tr><tr><td>EGF Rekombinantes Mausprotein</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Wird zur Messung von Verzweigungslängen und -winkeln</td></tr><tr><td>verwendet Gentamicin</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>5750-060</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen-X</td><td>GIBCO&nbsp;</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Fusselarmes Taschentuch</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>Kimtech Tuch</td><td></td></tr><tr><td>Formmaterial</td><td>Proto Labs</td><td>Accura SL5530&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formdruckausrüstung</td><td>Proto labs</td><td>Stereolithogrphy</td><td>Maximale Abmessung: 127 mm x 127 mm x 63,5 mm, Schichtdicke: 0,0254 mm</td></tr><tr><td>Formendruckservice Proto</td><td>labs</td><td>Custom</td><td>https://www.protolabs.com/</td></tr> <tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>VWR</td><td>16777-164P</td><td></td></tr><tr><td>Spinning-Disk konfokal Mikroskop</td><td>Solamere Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>184 SIL ELAST KIT&nbsp;</td><td>PDMS-Bausatz</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-analyse von multizellulären reaktionen auf tschoattraktive verläufe

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Verschiedene Begrenzungen von 2D-Zellkultursystemen haben Interesse an 3D-Zellkulturen und-analyseplattformen geweckt, die die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe besser nachahmen und in vivo-Gewebefunktionen nachahmen würden. Die jüngsten Fortschritte in der Mikrofabrikationstechnologie haben die Entwicklung von 3D-Umgebungen in vitro-Umgebungen erleichtert, in denen Zellen in eine klar definierte extrazelluläre Matrix (ECM) und eine definierte Reihe löslicher oder matrix assoziierter Biomoleküle integriert werden können. Die technologischen Barrieren haben jedoch ihren weit verbreiteten Einsatz in Forschungslabors eingeschränkt. Hier beschreiben wir eine Methode, um einfache Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multizellulären Organoiden in 3D-Mikroumgebungen mit einem definierten Chemoattractant Farbverlauf zu experimentieren. Wir veranschaulichen die Nutzung dieser Plattform zur Analyse der Reaktion von Epithelzellen und Organoiden auf die Abstufungen von Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF). EGF-Steigungen waren in den Geräten für mehrere Tage stabil, was zu einer gerichteten Zweigbildung bei Brustorganoiden führte. Diese Analyse ließ zu dem Schluss kommen, dass die kollektive Gradientenwahrung durch Zellgruppen empfindlicher gegenüber einzelnen Zellen ist. Wir beschreiben auch die Herstellungsmethode, die weder Photolithografieanlagen noch fortgeschrittene Soft-Lithografie-Techniken erfordert. Diese Methode wird hilfreich sein, um 3D-zelluläre Verhaltensweisen im Zusammenhang mit der Analyse von Entwicklung und pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs, zu untersuchen.

EGF ist ein wesentlicher Regulator für die Verzweigung der Morphogenese in Brustdrüsen und ein kritischer Chemoattractant, der die Migration von Brusepithelzellen bei invasivem Krebswachstum leitet. Wir haben die oben beschriebenen mesoskopischen fluidischen Geräte verwendet, um die Reaktion der Zellen auf definierte EGF-Fardienten zu untersuchen (Abbildung 1A, B) 10. Das Gerät ergibt einen 5 mm breiten, 10 mm langen u...

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Unterschiede in vereinfachten 2D-In-vitro-Kulturen im Vergleich zu 3D-Gewebe-ähnlichen Umgebungen haben das Interesse an 3D-Systemen erhöht, um die räumliche und chemische Komplexität lebender Gewebe darzustellen. Der Herstellungsprozess erfordert keine Einrichtungs- oder Photolithographietechniken. Das 3D-PDMS-Gerät enthält jedoch die notwendigen Vektoren für 3D-Anwendungen in physiologischer Umgebung.Verwenden Sie für die mesofluidische Gerätevorbereitung ein geeignetes dreidimensionales computergestütztes Design-Softwareprogramm, um die Maske der Form für das Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Gerät zu entwerfen und die Form mit Stereo-Lithographiegeräten mit einem thermoresistenten Harz zu drucken. Wenn die Form fertig ist, mischen Sie grob drei Milliliter PDMS-Monomerlösung pro Form mit einem Härtungsmittel im Verhältnis 10 zu eins und verwenden Sie ein Vakuum, um die Mischung in einem Vakuum-Austrocknungsor für eine Stunde zu entgasen. Am Ende der Austrocknung verwenden Sie ein Stück Klebeband, um Staub von der Oberfläche der Form zu entfernen und die Form vorsichtig mit der entgasten PDMS-Lösung zu füllen.Als nächstes härten Sie das PDMS bei 80 Grad Celsius für zwei Stunden aus, bevor Sie die Form bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Wenn die Form zur Berührung gekühlt wird, verwenden Sie eine Klinge, um die Grenze zwischen der Form und PDMS zu schneiden und das PDMS vorsichtig von der Form zu schälen. Trimmen Sie das PDMS, um einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckel zu montieren, und schlagen Sie ein Loch am Einlass.Wischen Sie das Gerät mit schwachen Fussgeweben und 70 % Ethanol ab und bedecken Sie das Gerät mit einem neuen Klebeband, um große Staubpartikel zu entfernen. Dann autoklavieren Sie das PDMS-Gerät und decken Sie bei 121 Grad Celsius für acht Minuten nass und 15 Minuten trocken und behandeln Sie die untere Oberfläche des PDMS-Teils und Deckenrutsche mit einer Corona-Entladungspistole für fünf Minuten in einer Gewebekulturhaube, bevor sie die Stücke miteinander verkleben. Um das Gerät zu laden, setzen Sie zuerst die Zellen von Interesse in einem geeigneten Volumen von Wachstumsmedium ergänzt mit 1%Penicillin und Streptomycin und 1%insulin-transferrin-selen-x.Als nächstes 50 Mikroliter der Brustdrüsenzellsuspension mit 425 Mikroliterfrischung neutralisierter Kollagenlösung mischen und eine 200-Mikroliter-Pipette mit der Kollagenzellsuspension füllen. Injizieren Sie die Suspension durch den Einlass in das PDMS-Gerät, bis die gesamte Kammer gefüllt ist, und legen Sie das Gerät bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für eine Stunde, um eine Gelation zu induzieren, bevor Sie die Reservoirs auf beiden Seiten mit Wachstumsmedium füllen und das Gerät bis zur konfokalen Bildgebung an den Inkubator zurückgeben. Für die 3D-Bildgebung und Quantifizierung installieren Sie eine live zellbildende Kulturkammer auf einem konfokalen Mikroskop und stellen Sie die Temperatur und das Kohlendioxid auf 37 Grad Celsius bzw. 5 % vor.Fügen Sie Wasser in das Bildkammerreservoir, um die Kammer zu befeuchten, legen Sie bei Bedarf Feuchttücher in die Kammer und legen Sie das PDMS-Gerät in die Kammer. Fügen Sie einem der Reservoirs einen epidermalen Wachstumsfaktor als Quelle des Faktors in der Gradientenbildung hinzu, sodass das andere Reservoir als Senke für die Entwicklung der räumlich abgestuften epidermalen Wachstumsfaktorverteilung dienen soll. Legen Sie dann den Bereich des Z-Stacks fest, der das Volumen der von Interesse interessierten Organoide abdeckt, und starten Sie die Bildgebung.Verwenden Sie am Ende des Experiments ein geeignetes Bildanalyseprogramm, um die Länge und den Winkel der Zweige zu messen, die sich von den Organoiden oder der Migration einzelner Zellen erstrecken. Sowohl in Silico- als auch in In-vitro-Tests ergaben sich die Bildung eines stabilen linearen epidermalen Wachstumsfaktorgradienten im gesamten Zellkulturbereich, der etwa zwei Tage ohne Auffüllung der Quell- oder Senkenreservoirs dauert, was darauf hindeutet, dass der epidermale Wachstumsfaktor, ein 6,4 Kilodalton-Protein, einen stabilen diffusionsbasierten Gradienten innerhalb eines Kollagengels bilden kann, das über einen relativ kurzen Zeitraum hergestellt wurde. Mamma-Organoide bilden mehrere Zweige in Gegenwart eines räumlich gleichmäßigen 2,5 Nanomolar epidermalen Wachstumsfaktors ohne Richtungsverzerrung über drei Tage, wenn der epidermale Wachstumsfaktor im linearen Gradienten mit 0,5 Nanomolaren pro Milliliter addiert wird.Die Verzweigungsformation weist jedoch eine signifikante Richtungsverzerrung auf. Bemerkenswert ist, dass die Zugabe von Spaltknoteninhibitoren die Fähigkeit der Organoide unterdrückt, auf den Gradienten zu reagieren. Der pH-Wert der Kollagenlösung ist entscheidend für die Gelation und Zelllebensfähigkeit.Wenn das Kollagen vor dem Mischen nicht neutralisiert wird, ist die Zelllebensfähigkeit gering. Diese Methode kann erweitert werden, um eine realistischere Gewebemodellierung zu ermöglichen und könnte die Vaskuläre Netzwerkbildung aus einzelnen Zellen innerhalb des Gels aufnehmen.

3d-analysis-of-multi-cellular-responses-to-chemoattractant-gradients

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Dieser Artikel liefert die detaillierte Methode zur Durchführung eines schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Assays durch Integration der On-Chip-Neutrophilen-Isolation aus Vollblut und dem Chemotaxis-Test auf einem einzigen mikrofluidischen Chip.

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Erfahren Sie die Herstellung von 3D-PDMS-Geräten zur Analyse zellulärer Reaktionen auf Chemoattraktantien-Gradienten in Organoiden. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen in der Zellbiologie.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

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