Messung der potenzialimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium basierend auf ¹⁴NH₄⁺/¹⁵NH₄⁺ Analysen mittels Sequenzielle Umwandlung in N 2_O

Küsten- und Meeresökosysteme sind als Reservoirs wichtig, um Nitrat aus terrestrischen Ökosystemen zu entfernen. Nitrat in aquatischer Umwelt kann durch mehrere Prozesse gleichzeitig verbraucht werden. Wie Denitrifikation, Anammox und DNRA.

Während frühere Studien gezeigt haben, dass DNRA potenziell der Denitrifikation zuzurechnen ist, sind Studien, die die DNRA-Aktivität im Vergleich zu denen, die die Denitrifikation messen, noch sehr begrenzt. In unserem Protokoll bieten wir ein detailliertes Verfahren zur Messung der potenziellen DNRA-Rate in Umweltproben an. Wir glauben, dass eine potenzielle DNRA-Rate aus N15-markierter Ammoniumakkumulation mit N15-beschrifteter Nitratzugabe berechnet werden kann.

Der Vorteil unserer Methode im Vergleich zu anderen Methoden ist, dass Ammonium letztlich in Stickstoffoxid umgewandelt wird, das einen niedrigen atmosphärischen Hintergrund hat. Auch ist es nicht klug, dass wir Stickstoffoxid über Quadrupol-Gaschromatographie-Massenspektrometer gemessen haben. Das ist kostengünstiger und einfach zu handhaben als ein Isotopen-Verhältnis-Massenspektrometer.

Legen Sie zunächst ein 60-Millimeter-Stück PTFE-Band auf ein kleines Blatt Aluminiumfolie. Asche ein Glasfaserfilter bei 450 Grad Celsius für vier Stunden in einem Muffelofen. Dann legen Sie den Glasfaserfilter etwas über dem Mittelpunkt der längeren Achse des Bandes.

Als nächstes 20 Mikroliter 0,9 Mol pro Liter Schwefelsäure in der Mitte des Glasfaserfilters erkennen und sofort das PTFE-Band mit flach geendetem Stempel und gerader Pinzette falten. Drehen Sie das PTFE-Band über den Glasfaserfilter, dann versiegeln Sie beide Seiten des PTFE-Bandes durch Falten und drücken Sie dann die Kante mit der Pinzette fest. Falten Sie mit der Pinzette das offene Ende des PTFE-Bandes, und drücken Sie die Kante.

Versiegeln Sie das offene Ende des PTFE-Bandes, indem Sie die Kante mit der Pinzette fest drücken, wobei darauf geachtet wird, den Glasfaserfilter nicht zu drücken. 30 Milligramm Magnesiumoxid in eine 20-Milliliter-Glasdurchstechflasche geben und die PTFE-Hülle in die Durchstechflasche legen. Fünf Milliliter einer zuvor vorbereiteten Probe oder Eines Standards in die Durchstechflasche mit dem Magnesiumoxid und der PTFE-Hüllkurve übertragen.

Und schließen Sie die Durchstechflasche sofort mit einem grauen Butylgummistopfen. Versiegeln Sie dann die Durchstechflasche mit einer Aluminiumkappe. Schütteln Sie die Fläschchen bei 150 U/min drei Stunden bei vier Grad Celsius bei dunkelheit.

Entfernen Sie anschließend die Aluminiumkappe und den Butylgummistopfen aus jeder Durchstechflasche. Entfernen Sie den PTFE-Umschlag von jeder Durchstechflasche mit punktbeendender Pinzette, und spülen Sie den Umschlag und die Pinzette gründlich mit Ionen ausgetauschtem Wasser ab. Wischen Sie dann den Umschlag und die Pinzette mit Wischpapier ab und legen Sie den Umschlag auf frisches Wischpapier.

Öffnen Sie den PTFE-Umschlag mit flachem Ende und spitzer Gepinzer in umgekehrter Reihenfolge der Faltschritte. Mit flacher Pinzette halten Sie den Randbereich des Glasfaserfilters, wo die Schwefelsäure nicht absorbiert werden soll. Und übertragen Sie es in ein 11-Millimeter-Schraubverschluss-Testrohr.

Spülen Sie die Pinzette mit Ionen ausgetauscht Wasser und wischen Sie sie mit Wischpapier. Fügen Sie jedem Reagenzglas einen Milliliter Ionen-Getauschwasser hinzu. Schließen Sie die Reagenzgläser mit PTFE-gefütterten Schraubverschlüssen und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um dem Ammoniumkation vollständig vom Glasfaserfilter zu entgehen.

Anschließend öffnen Sie den Schraubverschluss, fügen Sie dem Reagenz zwei Milliliter eines zuvor vorbereiteten Persulfat-Oxidationslösungreagenzes in das Reagenz hinzu und schließen Sie das Rohr fest mit einem Schraubverschluss, um Verluste oder Verunreinigungen in den folgenden Schritten zu vermeiden. Stehen Sie die Reagenzgläser auf einem Rack, wickeln Sie sie in doppellagige Aluminiumfolie und autoklavieren Sie sie in aufrechter Position für eine Stunde bei 121 Grad Celsius. Mischen Sie 100 Milliliter sterile 40 Millimole pro Liter Phosphatpuffer und 100 Milliliter sterile 30 Millimoles pro Liter Glukose aseptisch.

Fügen Sie einen Glycerinbestand von P.chlororaphis zu 200 Millilitern der phosphatgepufferten Glukoselösung in einem 300 Milliliter Erlenmeyer Kolben hinzu. Und mit einem ultrareinen Heliumstrom für eine Stunde reinigen. Als nächstes zwei Milliliter einer zuvor vorbereiteten Denitrifiersuspension in fünf Milliliter-Fläschchen geben.

Kappe nieren Sie jede Durchstechflasche mit einem grauen Butyl-Gummistopfen und einem Aluminiumverschluss. Ersetzen Sie die Headspace-Luft durch ultrareines Helium, indem Sie drei Minuten lang saugen und das Helium für eine Minute aufladen. Stellen Sie den Headspace-Gas-Positivdruck auf 1,3 Atmosphären ein, um eine unbeabsichtigte Luftverschmutzung zu vermeiden.

Injizieren Sie einen Milliliter einer Probe oder eines Standards durch den Butylkautschukstopfen mit einer Einwegspritze von einem Milliliter. Dann bebrüten Die Fläschchen über Nacht bei 25 Grad Celsius, unter dunklen Bedingungen. Am nächsten Tag 0,3 Milliliter sechs Mol pro Liter Natriumhydroxid injizieren, um die Denitrifikation zu stoppen und das Headspace-Kohlendioxid aufzunehmen, das ansonsten die Lachgasanalyse stören würde.

Denn Kohlendioxid und Lachgas haben das gleiche Molekulargewicht. Bestimmen Sie die Mengen an Lachgas mit einem Molekulargewicht von 44, 45 und 46 im Headspace-Gas mit Quadrupol GC/MS mit einem modifizierten Injektionsanschluss. Die repräsentativen Ergebnisse wurden aus 15 Stickstoff-Tracing-Experimenten von Salzwiesensedimenten abgeleitet, die aus dem Großen Ostjapan-Erdbeben 2011 im Mondgebiet der Stadt Kesennuma und der Präfektur Miyagi in Japan entstanden sind.

Für alle Sedimente, die in den Untergezeiten- und Gezeitenzonen gesammelt wurden, wurde während der gesamten Inkubationszeit ein Anstieg der markierten Ammoniumkonzentration beobachtet. Die DNRA-Kurse lagen im Bereich von 24,8 bis 177. Und sind vergleichbar mit Werten, die in früheren Studien berichtet wurden, aber höher als Werte, die aus ähnlichen Umgebungen abgeleitet wurden.

Die hohe DNRA-Rate erklärt sich aus dem Salzwiesen, der vor dem Erdbeben als Anbaugebiet genutzt wurde. In Übereinstimmung mit den Spekulationen war die DNRA-Rate in der Gezeitenzone, die reich und organische Verbindungen im Vergleich zur Untergezeitenzone ist, höher. Unser Protokoll ist weithin anwendbar auf die Analyse von Stoffwechselwegen, die Ammoniumbildung und N15 Spurenzusätze beinhaltet.