Name: In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisation (IVIL) zur Bewertung der Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung therapeutischer und diagnostischer Antikörper in lebenden Mäusen.

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Wir danken Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) für Diskussionen und den Einsatz von Geräten. Wir danken Dr. Jürgen K. Willmann für seine Betreuung. Diese Studie wurde durch das NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA1118681 Training Grant (KEW) und NIH K99EB023279 (KEW) unterstützt. Der Stanford Neuroscience Microscopy Service wurde von NIH NS069375 unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) der Stanford University genehmigt.
1. Transgenes Mausmodell der Brustkrebsentwicklung
<ol><li>Beobachten Sie Mäuse aus dem gewünschten Krebsmodell für das entsprechende Tumorwachstum mittels Palpation oder Sattelmessung, bevor Sie fortfahren. HINWEIS: Hier wurde das transgene murinische Modell der Brustkrebsentwicklung (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) verwendet. Diese Tiere entwickeln spontan invasive Brustkarzinome zwischen 6 und 12 Wochen in jeder Brustdrüse20. Normale Brustdrüsen wurden als Kontrollen von den transgen-negativen, altersgerechten Littermaten verwendet.</li>
</ol>2. Intravenöse Injektion spezifischer und unspezifischer Antikörper
<ol><li>Reinigen Sie Kaninchen Anti-Maus B7-H3 und Kaninchen IgG Isotyp-Kontrollantikörper auf einer Entsalzungssäule (z. B. PD-10), um Konservierungsstoffe und Speicherpuffer nach Herstelleranweisungen zu entfernen. HINWEIS: Einige Antikörper müssen möglicherweise weiter gereinigt werden mit Protein-A Agarose Perlen basierend Protokoll21.</li>
	<li>Aliquot-Dosierungen von 33 g jedes Antikörperkonjugat in einzelnen Mikrozentrifugenröhren. HINWEIS: Die Dosierung des verabreichten Mittels kann je nach Anwendung variieren und entspricht den Dosierungen, bei denen das Antikörperkonjugat routinemäßig verwendet wird. Die Konzentration der Antikörperlösungen ist erforderlich, wenn das Volumen mehr als 100 l für die Tiersicherheit beträgt.</li>
	<li>Zum gewünschten Zeitpunkt vor der Gewebeentnahme, hier 96 h, das tumortragende Tier mit 2% Isofluran, das bei 2 L/min in Sauerstoff fließt, befeuchten und auf eine 37 °C erhitzte Stufe legen. Machen Sie eine Zehenprise, um sicherzustellen, dass das richtige Niveau der Anästhesie vor dem Eingriff erreicht wurde.</li>
	<li>Um sich auf die Endvenenimpfung der Antikörperlösungen vorzubereiten, desinfizieren Sie den Schwanz des Tieres, indem Sie dreimal mit einem Alkoholwisch abwischen. Deperieren Sie die Schwanzadern durch Erwärmung mit einem Wärmepolster für ca. 30 s. Vermeiden Sie das Erhitzen des gesamten Tieres. Wischen Sie den Schwanz noch einmal mit einem Alkoholwisch ab, nachdem Sie das Heatpad entfernt haben.</li>
	<li>Mit einem 27G Schwanzvenenkatheter die Schmetterlingsnadel in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen einlegen und den Schwanz mit der eingesetzten Nadel vorsichtig mit einem chirurgischen Band auf die Bühne fixieren. HINWEIS: Der sichtbare Blutrückfluss in den Katheter zeigt die richtige Position der Nadel in der Schwanzvene an.</li>
	<li>Spülen Sie den Katheter mit 25 l steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS), und injizieren Sie die Antikörperlösung anschließend mit Insulinspritzen in den Katheter. Spülen Sie den Katheter noch einmal mit 25 l sterilem PBS.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel aus dem Schwanz und wenden Sie Druck an, um jegliche Blutung zu stoppen.</li>
	<li>Schalten Sie die Anästhesie aus und beobachten Sie das Tier, bis es für Anzeichen von Not vollständig wach ist.</li>
</ol>3. Sammlung und Aufbereitung von Zieltumorgeweben
<ol><li>Zum gewünschten Zeitpunkt das Tier nach dem akzeptablen institutionellen Verfahren human einschläfern, hier durch schrittweises Einatmen von 100%CO2 aus einem komprimierten Gastank mit einer Kammerverschiebungsdurchflussrate von 10-30% Volumen/min. HINWEIS: Einige Anwendungen der IVIL-Technik erfordern Sterbehilfe durch Herzperfusion mit PBS, um frei zirkulierende Antikörper zu entfernen19,22.</li>
	<li>Nach Bestätigung der humanen Euthanasie durch Einstellung der Atemwegs- und Herzbewegung, Mangel an Zehenkneifung und Ergrauung der Schleimhäute, Verbrauch Tumorgewebe mit chirurgischen Scheren und Zangen wie folgt:<ol>
<li>Legen Sie die Maus in die Rückenlage und greifen Sie nur die äußere Schicht der Haut zwischen dem Satz der Brustdrüsen am nächsten an den Schwanz(5.)mit Zange, machen einen kleinen Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere.</li>
		<li>Führen Sie die geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie langsam die Spitze, um die Haut vorsichtig von der darunter liegenden Bauchwandmembran zu trennen, die sie intakt hält.</li>
		<li>Machen Sie einen vertikalen Schnitt in den Bauch, weiterhin die Haut von der inneren Membran zu trennen. Zwischen den3. und4. Brustdrüsen, machen Sie einen horizontalen Schnitt über den Bauch, um das Zurückziehen der Haut und die Visualisierung der Brustdrüsen zu ermöglichen. HINWEIS: Brusttumoren und Drüsen befinden sich oberflächlich unter der Haut.</li>
		<li>Greifen Sie jeden Tumor oder normale Drüse mit Zangen, vorsichtig trimmen Sie die befestigte Haut mit chirurgischer Schere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schneidende Gewebe in Einweg-Basisformen des Gewebes geben, voretikettiert und mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) befüllt werden und die Formen schnell einfrieren, indem Sie sie auf Trockeneis platzieren. Um die Off-Target-Lieferung zu untersuchen, verbrauchen Sie andere Gewebe oder Voninteresse (z.B., Leber oder Lunge). HINWEIS: Um das Protokoll an dieser Stelle anzuhalten, lagern Sie gefrorene Gewebeblöcke bei -80 °C, bis sie bereit sind, fortzufahren.</li>
	<li>Mit Hilfe eines Kryostats, Abschnitt gefroreneGewebe Blöcke mit einer Dicke von 10 m und legen angrenzende Abschnitte auf vorbeschriftete Adhäsionglasrutschen. HINWEIS: Um das Protokoll an dieser Stelle anzuhalten, speichern Sie Folien bei -80 °C, bis sie bereit sind, fortzufahren.</li>
</ol>4. Ex-vivo-Färbeprotokoll
HINWEIS: Für den quantitativen Vergleich zwischen Fluoreszenzmikroskopiebildern werden alle Dias gleichzeitig mit den gleichen vorbereiteten Lösungen befleckt.
<ol><li>Spülen Sie gefrorene Gewebeschlitten mit Raumtemperatur PBS für 5 min, um OCT zu entfernen.</li>
	<li>Dearcate Gewebeabschnitte mit einem hydrophoben Barriere-Stift, um das Volumen der Lösungen während der Färbung benötigt zu reduzieren. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass der Stift nicht über die Gewebeproben läuft, da er entweder das Gewebe aus dem Dia entfernen oder eine ordnungsgemäße Färbung des betroffenen Gewebeteils verhindern kann. Lassen Sie die Gewebeabschnitte an keiner Stelle dehydrieren.</li>
	<li>Fixieren Sie die Gewebeabschnitte mit 4% Paraformaldehydlösung für 5 min.</li>
	<li>Spülen Sie Dias in PBS für 5 min.</li>
	<li>Permeabilisieren Gewebeabschnitte mit 0,5% Triton-X 100 in PBS für 15 min.</li>
	<li>Spülen Sie Dias in PBS für 5 min.</li>
	<li>Blockieren Sie das Gewebe mit 3% w/v Rinderserumalbumin (BSA) und 5% v/v Ziegenserum, beide in PBS (Blockierlösung) für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Passen Sie das blockierende Lösungsserum mit dem sekundären Antikörper-Wirtstier ab.</li>
	<li>Spülen Sie Dias in PBS für 5 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie Abschnitte mit aufzeichnungsbasierten Primärantikörpern, möglicherweise einem gemeinsamen Kernkörper (z. B. DAPI), Gefäß (z. B. CD31) oder zytoplasmatischem Marker (z. B. Actin). Hier bei einer Verdünnung von 1:100 wurde in der Blockierlösung über Nacht bei 4 °C, die vor Austrocknung auf einem Diatablett geschützt ist, nach Herstelleranweisungen in der Blockierlösung eingesetzt. HINWEIS: Fügen Sie keine zusätzlichen primären Antikörper oder Antikörperkonjugat hinzu. Das Konjugat, das injiziert wurde und sich in vivo in das Gewebe anreichern durfte, fungiert als Primärantikörper.</li>
	<li>Spülen Sie Dias in PBS für 5 min dreimal, ändern Sie die PBS jedes Mal.</li>
	<li>Inkubieren Sie Dias mit sekundären Antikörpern, um primäre Antikörper zu kennzeichnen. Für diese Anwendung, visualisieren Anti-B7-H3 Antikörper mit AlexaFluor-546 konjugierten Ziegen Anti-Kaninchen-Antikörper (1:200 Verdünnung, optimiert nach Herstelleranweisungen) und CD31 mit AlexaFluor-488 Ziege Anti-Ratten Sekundärantikörper (1:200 Verdünnung, optimiert nach Herstelleranleitung) in Blockierlösung, geschützt vor Licht und Austrocknung auf einem Schiebefach, für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Sekundäre Antikörper stammen vom selben Wirtstier, entsprechen jedoch der Affinität der sekundären Antikörper zu den Wirtsarten des jeweiligen Primärantikörpers. Dias sind ab diesem Zeitpunkt vor Licht geschützt.</li>
	<li>Spülen Sie Dias in PBS für 5 min dreimal, ändern Sie die PBS jedes Mal.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen des Montagemediums in die Mitte der Gewebescheibe auf und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf auf, um das Einschließen von Luftblasen zu vermeiden.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Ränder des Deckels mit klarem Nagellack und lassen Sie sie trocknen. HINWEIS: Um das Protokoll an dieser Stelle bis zu einer Woche pausieren zu können, speichern Sie Folien bei -20 °C, bis sie bereit sind, fortzufahren.</li>
</ol>5. Konfokale Mikroskopie-Bildgebung und quantitative Bildanalyse
HINWEIS: Die Vorbereitung des konfokalen Mikroskops und der Bildgebungsparameter hängt vom verwendeten konfokalen System ab. Das hier verwendete Mikroskop wurde kommerziell erworben (z.B. Zeiss LSM 510 Meta-System) und die zugehörige Akquisitionssoftware (z.B. Zen 2009) verwendet. Viele dieser Schritte gelten jedoch für jedes konfokale Mikroskop und setzen grundlegende konfokale Mikroskopiekenntnisse voraus.
<ol><li>Nachdem das System eingeschaltet und aufgewärmt wurde, wählen Sie das gewünschte Ziel aus. hier wurde ein 20x (numerische Blende = 0,8) Objektiv verwendet.</li>
	<li>Laden Sie einen positiv gesteuerten Schlitten, Abdeckung nach unten, um die Optimierung für das hellste Signal einzustellen. Imaging im roten Kanal, fokussieren Sie das System auf die Probe im Live-Bildgebungsmodus.</li>
	<li>Optimieren Sie für jeden verwendeten Laserkanal die Laserintensität, die Masterverstärkung und die Lochgröße wie folgt:<ol>
<li>Wechseln Sie zum kontinuierlichen Modus für die Bildgebung.</li>
		<li>Optimieren Sie die Laserintensität (die die Laserleistung steuert) und Gain (Master) (die die Spannung für Photomultiplier-Rohr steuert) Diastangen während der Überwachung des Look Up Table (LUT) Histogramm. Passen Sie diese beiden Einstellungen an, bis der Dynamikbereich des Histogramms ohne Sättpixel gefüllt ist. HINWEIS: Wenn die Laserintensität zu hoch ist, tritt eine Photobleichung auf. Wenn der Gain (Master) zu hoch ist, wird das Bild laut. Im Idealfall befindet sich der Gain (Master) in der Mitte seines Bereichs.</li>
		<li>Stellen Sie das Loch auf 1 luftige Einheit (AU) ein, die die höchste Auflösung und die dünnste Z-Scheibe ergibt.</li>
		<li>Schieben Sie die Digital Offset-Leiste, um den Geräuschpegel des LUT-Histogramms für einen echten schwarzen Hintergrund zu minimieren. HINWEIS: Sobald die Mikroskopieeinstellungen für jeden Laserkanal und jedes Ziel optimiert sind, halten Sie sie während der gesamten Bildgebungssitzung und für die Abbildung aller Dias konstant, um den quantitativen Vergleich zwischen Dias zu ermöglichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie unter der Registerkarte Erfassungsmodus unter Mittelungdie gewünschte Zahl und Bittiefeaus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Optimal, um die optimale Pixelgröße festzulegen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Schaltfläche "Aufnahme fangen", um ein hochwertiges Bild zu sammeln. Hier wurden zufällige Sichtfelder aus dem Tumor ausgewählt, aber andere Bereiche von Interesse können für verschiedene Anwendungen gelten (Gefäße, Tumormargen, Penetrationstiefe, etc.)</li>
	<li>Speichern Sie Bilddateien im Format, das von der konfokalen Software (hier ".lsm") für die Offline-Verarbeitung und Quantifizierung verwendet wird. HINWEIS: Wenn nicht alle Folien während derselben Sitzung abgebildet werden, speichern Sie die Einstellungen und laden Sie sie bei nachfolgenden Besuchen neu, obwohl eine Neuabbildung derselben Folie aufgrund von Photobleichungen nicht empfohlen wird.</li>
	<li>Führen Sie die quantitativen Fluoreszenzintensitätsmessungen durch. Öffnen Sie Fidschi (Fiji Is Just ImageJ software)19,23 und laden Sie eine .lsm-Bilddatei, indem Sie auf die Statusleiste ziehen.</li>
	<li>Teilen Sie die Farbkanaldaten auf. Gehen Sie zu Bild > Stapel > Kanäle teilen.</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Fluoreszenzbilder nach Bedarf, d. h. subtrahieren Sie das Hintergrundsignal (Prozess > Hintergrund subtrahieren) oder reduzieren Sie das Rauschen über eine Filtermethode.</li>
	<li>Segmentieren Sie den Farbkanal, der dem Referenzprotein (vaskulär, nuklear, zellulärer Fleck) entspricht, indem Sie einen Schwellenwert für die Signalintensität festlegen (Bild > Anpassen > Schwellenwert). HINWEIS: Die manuelle Schwellenwertierung führt die Subjektivität in die Bildanalyse ein, daher wird die Bildanalyse durch die Verwendung eines automatisierten Schwellenwertalgorithmus oder das Verweisen auf Bildhistogramme weniger verzerrt.</li>
	<li>Verwenden Sie diesen Schwellenwert, um eine binäre Maske zu erstellen (Prozess > Binär > In Maske konvertieren).</li>
	<li>Messen und Beschriften von ROIs innerhalb der Maske (Analysieren > Partikel analysieren > Zum Manager hinzufügen > OK )</li>
	<li>Wenden Sie ROIs auf den Farbkanal an, der dem von Interesse sindden Antikörper (Klickkanalbild, Analysieren > Tools > ROI Manager > Messen). Dadurch werden die Masken-ROIs auf das Antikörperbild angewendet und Bildmessungen für Beschriftungsabschnitte im Ergebnisfenster angezeigt. Fenster "Ergebnisse speichern" (Datei > Speichern).</li>
	<li>Berechnen Sie die gewünschte Zinsstatistik, wie z.B. die mittlere Fluoreszenzintensität, wie hier beschrieben24.</li>
	<li>Führen Sie alle Verarbeitungsschritte identisch mit jedem Bild innerhalb einer Gruppe von Folien aus. Erstellen Sie ein Makro, um dies automatisch für große Bildbatches23zu tun.</li>
	<li>Wenden Sie für die Bildanzeige nur nach quantitativen Messungen qualitative Bildanpassungen an, um die Visualisierung von Bioverteilungsmustern zu optimieren, indem Sie Minimum, Maximum, Helligkeit und Kontrast auf allen Folien an die gleichen Werte anpassen(Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrast).</li>
	<li>Konvertieren Sie den Bildtyp (Bild > Typ > RGB-Farbe) und speichern Sie Dateien in einem verlustfreien Bildtyp wie .tiff (Datei > Speichern unter > Tiff...) für die Verwendung in Präsentationen und Publikationen.</li>
</ol>

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<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+reprograms+lymphatic+vessels+to+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Fluorescence+Immunohistochemistry%3A+Localization+of+Fluorescently+Labeled+Cetuximab+in+Squamous+Cell+Carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors.</a> British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Diese Methode hat mehrere kritische Schritte und erfordert potenzielle Änderungen, um eine erfolgreiche Implementierung sicherzustellen. Erstens müssen die Dosierung und das Timing der intravenösen Injektion von Antikörper/Antikörperkonjugat auf die jeweilige Anwendung zugeschnitten sein. Im Allgemeinen sollten Dosierungen verwendet werden, die mit der Art und Weise übereinstimmen, wie das Antikörperkonjugat typischerweise verwendet wird, d. h. passende Dosierungen des therapeutischen Antikörpers oder des Antikörper-basi...

Monoklonale Antikörper (mAb) sind große Glykoproteine (ca. 150 kDa) der Immunglobulin-Überfamilie, die von B-Zellen abgesondert werden und eine primäre Funktion im Immunsystem haben, um die biologische Funktion von bakterielle oder virale Krankheitserreger und kann abnorme Proteinexpression auf Krebszellen erkennen1. Antikörper können eine extrem hohe Affinität zu ihren spezifischen Epitopen bis hin zu Femtomolarenkonzentrationen haben, was sie zu vielversprechenden Werkzeugen in der Biomedizin2macht. Mit der Entwicklung der Hybridom-Technologie durch Milstein und Köhler (Nobelpreis 1984) wurde die Produktion von mAbs möglich3. Später wurden menschliche mAbs mit der Phagenanzeige-Technologie oder transgenen Mausstämmen erzeugt und revolutionierten ihre Verwendung als neuartige Forschungswerkzeuge und Therapeutika4,5.
Krebs ist ein weltweites Gesundheitsproblem und eine der Hauptursachen für den Tod, was die Notwendigkeit neuer Ansätze für Prävention, Erkennung und Therapie schafft6. Bis heute haben mAbs die Extrication der Rolle von Genen und ihren Proteinen bei der Tumorgenese ermöglicht und können, wenn sie gegen Krebsbiomarker gerichtet sind, die Tumorerkennung und Charakterisierung für die Schichtung des Patienten ermöglichen. Für die Krebstherapie werden bispezifische mAbs, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate und kleinere Antikörperfragmente als Therapeutika entwickelt, und für die gezielte Wirkstoffabgabe zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit7. Zusätzlich dienen Antikörper für die Biomarker-Targeting von Kontrastmitteln für molekulare bildgebende Modalitäten wie Fluoreszenz-geführte Chirurgie, photoakustische (PA) Bildgebung, Ultraschall (US) molekulare Bildgebung und klinisch verwendete Positronenemission Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT)8. Schließlich können Antikörper auch als Theranost-Wirkstoffe eingesetzt werden, die eine Schichtung der Patienten und eine Reaktionsüberwachung für gezielte Therapien ermöglichen9. Daher beginnen neuartige mAbs eine entscheidende Rolle bei der Krebserkennung, -diagnose und -behandlung zu spielen.
Trotz kritischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen aufgrund der Komplexität der Tumorumgebung unwirksam gemacht werden. Antikörperwechselwirkungen sind abhängig von der Art des Epitops, d.h.,ob es linear oder konform10ist. Neben der Erkennung von Antigenen müssen Antikörper natürliche Barrieren wie Gefäßwände, Basalmembranen und tumorstroma überwinden, um Zielzellen zu erreichen, die das Antigen exdrücken. Antikörper interagieren mit dem Gewebe nicht nur durch die variable Fragmentantigenbindung (Fab) Domäne, sondern auch durch das konstante kristalline Fragment (Fc), das weiter zu off-site Interaktionen führt11. Das Targeting wird auch durch die heterogene Expression von Tumormarkern in der Tumormasse und Heterogenität in der Tumorvaskularisation und dem Lymphsystem12,13erschwert. Darüber hinaus besteht die Tumormikroumgebung aus krebsassoziierten Fibroblasten, die Tumorzellen unterstützen, Tumorimmunzellen, die Anti-Tumor-Immunreaktionen unterdrücken, und dem Tumorendothel, das den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen unterstützt, die das Eindringen, die Verteilung und die Verfügbarkeit von Antikörper-basierten Therapeutika oder Diagnostika beeinträchtigen. Insgesamt können diese Überlegungen die therapeutische oder diagnostische Wirksamkeit einschränken, das Behandlungsverhalten reduzieren und zu Tumorresistenzführen führen.
Daher ist es für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats innerhalb der Tumormikroumgebung zu bewerten. Derzeit wird in präklinischen Studien die Markerexpression in Tumorforschungsmodellen ex vivo durch Immunfluoreszenz (IF) Färbung von Tumorabschnitten14analysiert. Standard-IF-Färbung wird mit primären markerspezifischen Antikörpern durchgeführt, die dann durch sekundäre fluoreszierend markierte Antikörper auf ex vivo Tumorgewebescheiben hervorgehoben werden, die vom Tier isoliert wurden. Diese Technik hebt die statische Position des Markers zum Zeitpunkt der Gewebefixierung hervor und gibt keinen Einblick, wie sich die antikörperbasierten Therapeutika oder Diagnostika unter physiologischen Bedingungen verteilen oder interagieren könnten. Die molekulare Bildgebung durch PET, SPECT, US und PA kann Informationen über die antikörperkonjugierte Kontrastmittelverteilung in lebenden präklinischen Modellen8,15liefern. Da es sich bei diesen bildgebenden Modalitäten um nicht-invasive, Längsschnittstudien handelt und zeitkritische Daten mit einer minimalen Anzahl von Tieren pro Gruppe gesammelt werden können. Diese nicht-invasiven molekularen bildgebenden Ansätze sind jedoch nicht empfindlich genug und haben nicht genügend Auflösung für die Lokalisierung der Antikörperverteilung auf zellulärer Ebene. Zusätzlich können die physikalischen und biologischen Eigenschaften des primärantikörpers durch die Konjugation eines Kontrastmittels drastisch verändert werden16.
Um die in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen zu berücksichtigen, wie antikörperbasierte Therapeutika und Diagnostika innerhalb der Tumorumgebung interagieren und eine hochauflösende zelluläre und sogar subzelluläre Verteilung zu erhalten Profile von nicht konjugierten Antikörpern schlagen wir einen IF-Ansatz vor, der als In-Vivo-Immunfluoreszenzlokalisation (IVIL) bezeichnet wird, bei dem der antigenspezifische Antikörper intravenös in vivo injiziert wird. Der Antikörper-basierte therapeutische oder diagnostische, als primärer Antikörper wirkt, zirkuliert in funktionellen Blutgefäßen und bindet an sein Zielprotein in der hochgenauen, lebenden Tumorumgebung. Nach isolierung von in vivo-markierten Tumoren mit dem primären Antikörper wird ein sekundärer Antikörper verwendet, um angesammelte und zurückgehaltene Antikörperkonjugate zu lokalisieren. Dieser Ansatz ähnelt einem zuvor beschriebenen IF-Histologie-Ansatz, bei dem fluoreszierend markierte Antikörper17injiziert werden. Obwohl hier, die Verwendung von nicht konjugierten Antikörpern vermeidet eine mögliche Änderung der Bioverteilungseigenschaften durch Antikörpermodifikation induziert. Darüber hinaus vermeidet die Ex-vivo-Anwendung von fluoreszierendem Sekundärantikörper einen möglichen Verlust des Fluoreszenzsignals während der Gewebeentnahme und -verarbeitung und sorgt für eine Verstärkung der Fluoreszenzsignalintensität. Unser Etikettierungsansatz spiegelt die In-vivo-Biodistribution von Antikörper-basierten Medikamenten und gezielten Wirkstoffen wider und kann wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger diagnostischer und therapeutischer Wirkstoffe liefern.
Hier beschreiben wir zwei Anwendungen der IVIL-Methode, wie sie in früheren Studien zur Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für molekulare bildgebende Ansätze zur Brustkrebserkennung angewandt wurden. Erstens die Bioverteilung eines Antikörper-nahen Infrarotfarbstoffkonjugats (Anti-B7-H3-Antikörper, der an den nahen Infrarotfluoreszenzfarbstoff, Indocyaningrün, B7-H3-ICG) und des Isotypkontrollmittels (Iso-ICG) für Fluoreszenz und photoakustische molekulare molekulare Bildgebung wird untersucht18. Die Methode dieser Anwendung wird im Protokoll beschrieben. Als nächstes werden die Bioverteilungsergebnisse eines konformen Antikörpers gegen Netrin-1, der in der Regel nicht mit herkömmlicher IF-Bildgebung nachweisbar ist und mit ultraschallmolekularer Bildgebung verwendet wird, quantifiziert und in den repräsentativen Ergebnissen19dargestellt. Am Ende dieses Protokollpapiers sollten sich leserende Menschen wohl fühlen, wenn sie die IVIL-Methode für ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anwenden.

<table><tbody><tr><td>Animal Model</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002374</td><td>Weibchen, Alter 4-6 Wochen</td></tr><tr><td>Animal Handling Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G Katheter</td><td>VisualSonics</td><td>Bitte rufen Sie an, um zu bestellen</td><td>Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit</td></tr><tr><td>Alkohol-Tücher</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246073</td><td></td></tr><tr><td>Mullschwämme (4" x 4" 16-lagig)</td><td>Cardinal Health</td><td>2913</td><td></td></tr><tr><td>Wärmelampe</td><td>Morganville Scientific</td><td>&nbsp; HL0100</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0490117</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Klebeband</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Basisformen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-556</td><td></td></tr><tr><td>Optimale Schnitttemperatur (OKT) Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Londoner Zange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488 Anti-Ratte für Ziegen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-546 Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-594 Anti-IgG für Ziegen</td><td>Life Technologies</td><td>A11014</td><td></td></tr><tr><td>IgG-Isotyp-Kontrolle beim Menschen</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97043</td><td></td></tr><tr><td>Humanisierter Anti-Netrin-1-Antikörper</td><td>Netris Pharma</td><td></td><td>contact@netrispharma.com</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus CD276 (B7-H3)</td><td>Abcam</td><td>ab134161</td><td>EPNCIR122 Klon</td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>MEC 13.3 Klon</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Klarlack Polen</td><td></td><td></td><td>Jede örtliche Drogerie</td></tr><tr><td>Indocyanin Grün - NHS</td><td>Intrace Medical</td><td>ICG-NHS Ester</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TA-006-FM</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19135680</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>steriles Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhäsionsglas-Objektträger</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Entsalzungssäulen</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobe Barriere Pen</td><td>Ted Pella</td><td>22311</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger-Färbetablett</td><td>VWR</td><td>87000-136</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>LOCI, UW-Madison.</td><td>Version 4.0</td><td>https://fiji.sc/</td></tr></tbody></table>

in vivo immunfluoreszenzlokalisation zur bewertung der therapeutischen und diagnostischen antikörperbiodistribution in der krebsforschung

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoklonale Antikörper (mAbs) sind wichtige Instrumente zur Krebserkennung, -diagnose und -behandlung. Sie werden verwendet, um die Rolle von Proteinen in der Tumorgenese zu entwirren, können auf Krebsbiomarker gerichtet werden, die die Erkennung und Charakterisierung von Tumoren ermöglichen, und können für die Krebstherapie als mAbs oder Antikörper-Wirkstoff-Konjugate verwendet werden, um Immuneffektorzellen zu aktivieren, Signalwege oder direkt töten Zellen, die das spezifische Antigen tragen. Trotz klinischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen durch die Komplexität und Heterogenität der Tumormikroumgebung beeinträchtigt werden. Für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika ist es daher entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats mit der lebenden Tumormikroumgebung zu bewerten. Hier beschreiben wir In Vivo Immunofluoreszenzlokalisierung (IVIL) als einen neuen Ansatz zur Untersuchung von Wechselwirkungen von Antikörper-basierten Therapeutika und Diagnostika unter den in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen. Bei dieser Technik wird ein therapeutischer oder diagnostischer Antigen-spezifischer Antikörper invivo in vivo injiziert und ex vivo mit einem sekundären Antikörper in isolierten Tumoren lokalisiert. IVIL spiegelt daher die In-vivo-Bioverteilung von Antikörper- und Targeting-Mitteln wider. Zwei IVIL-Anwendungen werden beschrieben, um die Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für die molekulare Bildgebung von Brustkrebs zu bewerten. Dieses Protokoll wird es zukünftigen Anwendern ermöglichen, die IVIL-Methode an ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anzupassen.

Die IVIL-Methode wurde hier verwendet, um die In-vivo-Bioverteilung und Gewebeinteraktion von B7-H3-ICG und Iso-ICG zu untersuchen, indem die Wirkstoffe nach intravenöser Injektion in ein lebendes Tier 96 h mit dem Zielgewebe interagieren konnten und geerntet werden, um als primäre Antikörper während der Ex-vivo-Immunfärbung zu fungieren. Die IVIL-Methode wurde auch mit der Standard-Ex-vivo-IF-Färbung der Gewebe für den B7-H3-Marker verglichen. Normale murinische Brustdrüsen drücken den i...

Die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisationsmethode (IVIL) kann verwendet werden, um die In-vivo-Bioverteilung von Antikörpern und Antikörperkonjugaten für onkologische Zwecke in lebenden Organismen mit einer Kombination aus In-vivo-Tumor-Targeting und Ex-vivo-Immunfärbung zu untersuchen. Methoden.

In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Dieses Protokoll für die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisierung (IVIL) bewertet die In-vivo-Bioverteilung diagnostischer und therapeutischer Antikörper oder Antikörper-basierter Wirkstoffe für die Krebsforschung, -detektion und -behandlung. Im Gegensatz zur herkömmlichen immunfluoreszenten Färbung, bei der die zelluläre Expression von Antigenen ex vivo offenbart wird, erläutert die IVIL-Methode, wie sich Antikörper und Antikörper-basierte Wirkstoffe im lebenden Tier verteilen. Dieses Video wird das Verständnis des gesamten Workflows der IVIL-Methode unterstützen.Es zeigt wichtige Details für eine erfolgreiche Reproduktion des Protokolls für andere Anwendungen und Antikörper. Beobachten Sie Mäuse aus dem gewünschten Krebsmodell für das entsprechende Tumorwachstum mittels Palpation oder Sattelmessung, bevor Sie fortfahren. Reinigen Sie Kaninchen Anti-Maus B7-H3 und Kaninchen IgG Isotyp-Kontrollantikörper auf einer Entsalzungssäule, um Konservierungsstoffe und Speicherpuffer nach den Anweisungen des Herstellers zu entfernen.Aliquot Dosierungen von 33 Mikrogramm jedes Antikörperkonjugats in einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Anästhesisierung, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie sich auf die Endschwanzvenenimpfung der Antikörperlösungen vor. Desinfizieren Sie den Schwanz des Tieres, indem Sie dreimal mit einem Alkoholwisch wischen.Die Schwanzvenen durch Erwärmung mit einem Wärmepolster für ca. 30 Sekunden delateieren. Vermeiden Sie das Erhitzen des gesamten Tieres. Mit einem 27-Spur-Schwanzvenenkatheter legen Sie die Schmetterlingsnadel in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen ein.Visualisieren Sie den Blutrückfluss in den Katheter, um sicherzustellen, dass die Nadel richtig platziert wird, so dass die Lösungen vollständig in das Tier gelangen, anstatt im Schwanz gefangen zu werden. Verwenden Sie ein Stück operationsekband, um den Schwanz mit der eingesetzten Nadel vorsichtig auf die Bühne zu fixieren. Spülen Sie den Katheter mit 25 Mikroliter steriler Phosphat-gepufferter Saline.Anschließend injizieren Sie die Antikörperlösung mit Insulinspritzen in den Katheter. Spülen Sie den Katheter noch einmal mit 25 Mikroliter sterilem PBS. Entfernen Sie die Nadel aus dem Schwanz, und wenden Sie Druck auf, um jegliche Blutung zu stoppen.Führen Sie eine humane Euthanasie der Maus durch, wie im Textprotokoll beschrieben, und legen Sie die Maus in die Supine-Position. Verwenden Sie chirurgische Schere und Zangen, um Tumorgewebe zu verbrauchen. Verwenden Sie Zangen, um nur die äußere Schicht der Haut zwischen dem Satz der Brustdrüsen am nächsten zum Schwanz zu erfassen, und machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer chirurgischen Schere.Führen Sie die geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie langsam die Spitze, um die Haut vorsichtig von der darunter liegenden Bauchwandmembran zu trennen und sie intakt zu halten. Machen Sie einen vertikalen Schnitt in den Bauch, weiterhin die Haut von der inneren Membran zu trennen. Zwischen der dritten und vierten Brustdrüse, machen Sie einen horizontalen Schnitt über den Bauch, um das Zurückziehen der Haut und die Visualisierung der Brustdrüsen zu ermöglichen.Greifen Sie jeden Tumor oder normale Drüse mit Zangen, vorsichtig trimmen Sie die befestigte Haut mit chirurgischer Schere. Legen Sie ausgeschnittene Gewebe in Einweg-Basisformen des Gewebes, die voretikettiert und mit einem optimalen Schnitttemperatur-Einbettmedium gefüllt sind. Die Formen schnell einfrieren, indem man sie auf Trockeneis platziert.Um die Off-Target-Lieferung zu untersuchen, verbrauchen Sie andere Gewebe oder Organe von Interesse. Mit einem Kryostat, Abschnitt gefrorene Gewebeblöcke mit 10-Mikron Dicke, und legen Sie angrenzende Abschnitte auf vorbeschriftete Adhäsion Glasrutschen. Spülen Sie gefroreneGewebe diagletten mit Raumtemperatur PBS für fünf Minuten, um das Einbettmedium zu entfernen.Dearcate Gewebeabschnitte mit einem hydrophoben Barriere-Stift, um das Volumen der Lösungen während der Färbung benötigt zu reduzieren. Fixieren Sie die Gewebeabschnitte mit 4%Paraformaldehyd-Lösung für fünf Minuten. Nach dem Spülen der Dias in PBS für fünf Minuten, permeabilisieren Gewebeabschnitte mit 0,5%Triton X-100 in PBS für 15 Minuten.Spülen Sie die Dias erneut in PBS für fünf Minuten. Blockieren Sie das Gewebe mit PBS mit einem Gewicht von 3 % pro Volumen Rinderserumalbumin und 5 % Volumen pro Volumen Ziegenserum für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem Spülen der Dias in PBS für fünf Minuten, inkubieren Sie die Abschnitte mit Aufzeichnungen primäre Antikörper wie eine gemeinsame kern-, vaskuläre, oder zytoplasmatische Marker.Hier bei einer Ein-zu-100-Verdünnung in der Blockierlösung wird Ratten-Anti-Maus-CD31 eingesetzt. Die Dias mit Primärantikörpern werden über Nacht bei vier Grad Celsius gelassen, geschützt vor Austrocknung auf einem Diatablett. Nach der Inkubation spülen Sie die Dias in PBS dreimal für fünf Minuten.Ändern Sie die PBS jedes Mal. Inkubieren Sie die Dias mit sekundären Antikörpern, um die primären Antikörper zu kennzeichnen. Für diese Anwendung, visualisieren Anti-B7-H3 Antikörper mit Alexa Fluor 546 konjugierten Ziege Anti-Kaninchen-Antikörper, und visualisieren CD31 mit Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Ratten Sekundärantikörper in Blockierlösung.Schützen Sie die Dias eine Stunde lang bei Raumtemperatur vor Licht und Austrocknung auf einem Diatablett. Nach dem Spülen der Dias in PBS wie zuvor, einen Tropfen des Montagemediums in die Mitte der Gewebescheibe auftragen. Legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf, um das Einwickeln von Luftblasen zu vermeiden.Versiegeln Sie die Ränder des Deckels mit klarem Nagellack und lassen Sie sie trocknen. Fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie-Bildgebung und quantitativen Bildanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Repräsentative konfokale Mikrographien zeigen den Vergleich spezifischer B7-H3-Antikörper-ICG-Konjugat- und unspezifischer Isotyp-Kontroll-Antikörper-ICG-Konjugatlokalisierung in murinen Brustdrüsen, die normales oder karzinomhaltiges Gewebe enthalten.Normale murinische Brustdrüsen von einem Tier, das intravenös mit Iso-ICG oder B7-H3-ICG injiziert und mit CD31 kontragefärbt ist, zeigen keine Färbung der Antikörperkonjugate. Es wurde gezeigt, dass normale Gewebe keine Expression von B7-H3 durch Standard-Ex-vivo-Immunfluoreszenzfärbung haben. Bei invasiven Brusttumoren bindet B7-H3-ICG stark an die Vaskulatur, den ersten Kontaktpunkt in vivo, und ist dann in der Lage, aus der Vaskulatur zu extravasieren, um das Tumorepithel heterogen zu färben.Iso-ICG zeigt unspezifische Akkumulation innerhalb des Tumorgewebes. Die Standard-Ex-vivo-Immunfluoreszenzfärbung zeigt eine gleichmäßige Expression des B7-H3-Markers auf epitheliale und endotheliale Zellen. Repräsentative konfokale Mikrographien zeigen die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisierungsmethode zum Nachweis der Netrin-1-Expression oder der Isotypkontrollexpression bei murinen Karzinom und normalen Brustdrüsen.In vivo Immunfluoreszenzlokalisierung bestätigt epitheliale Signal für Netrin-1 in MMTV-PyMT Tumoren, aber nicht in normalen Brustdrüsen. Darüber hinaus gibt es ein starkes Netrin-1-Signal auf Endothelzellen in Brusttumoren, wie durch das kolokalisierte gelbe Signal angezeigt. Das Signal ist in normalen Brustdrüsen deutlich schwächer.Die IVIL-Methode muss in Bezug auf DieAntikörperdosierung, Gewebesammlung Timing und sekundäre Antikörperverdünnung für eine erfolgreiche Umsetzung optimiert werden. IVIL ermöglicht die Ausrichtung auf konforme Epitope, die nicht mit Standard-Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen werden können, die eine Gewebeverarbeitung erfordert. Auch können gesunde Organe von tumortragenden Mäusen gesammelt werden, um die abwegige Abgabe von therapeutischen Antikörpern zu bewerten.Durch den verstärkten Einsatz von Antikörper-basierten Therapeutika und Kontrastmitteln in der Krebsforschung und -therapie ist die IVIL-Methode sehr gut auf die pharmazeutische Forschung und Entwicklung anwendbar. Forscher in Krebstherapien, molekulare Bildgebung, Entzündungen und anderen Bereichen können feststellen, dass die IVIL-Methode nützliche Informationen liefert.

in-vivo-immunofluorescence-localization-for-assessment-therapeutic

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Diffuse Fluoreszenz-Tomographie bietet eine relativ kostengünstige und potenziell hoher gesamten Ansatz für...

Computertomographie-gesteuerte Time-Domain diffuse Fluoreszenz-Tomographie in der Kleintiere für die Lokalisierung von Krebs-Biomarker

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Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Untersuchung der in vivo Lokalisierung von tumorspezifischen Antikörpern in einem Maus-Tumor-Xenotransplantat-Modell. Nach der subkutanen Injektion von Krebszellen in Mäuse zur Tumorbildung werden fluoreszenzmarkierte Antikörper injiziert, die an tumorspezifische Rezeptoren binden und so eine In-vivo-Beurteilung der Antikörperlokalisierung durch Bildgebung ermöglichen.

Eine Technik zur Beurteilung der in vivo Lokalisation von tumorspezifischen Antikörpern

Dieses Video demonstriert eine in vivo Immunfluoreszenz-Lokalisierungstechnik (IVIL), um die Bioverteilung von tumorgerichteten Antikörpern in einem Mausmodell von Brustkrebs zu untersuchen. Nach der intravenösen Injektion eines tumorspezifischen Antikörpers in die Maus wird der Tumor chirurgisch isoliert und die Lokalisation des Antikörpers im Tumorgewebe durch ex vivo Immunfärbung bestätigt.

Eine in vivo Immunfluoreszenz-Lokalisierungsmethode zur Untersuchung der Antikörper-Biodistribution

Das Video zeigt eine Fluoreszenzbildgebungsmethode für die Lokalisierung von  in vivo Antikörpern in einem Maus-Tumor-Xenotransplantatmodell. Dabei werden Tumorzellen in eine Maus injiziert, um feste Xenotransplantate unter der Haut zu erzeugen. Die anschließende Injektion von fluoreszierenden Antikörpern bestätigt die spezifische Lokalisation durch verstärkte Fluoreszenzsignale innerhalb des Tumor-Xenotransplantats.

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Eine In-vivo-Technik zur Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports zu Tumoren

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In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung (Video) | JoVE Journal

In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung

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