Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen aus Zellsuspensionen zu isolieren, um sie für die Einzelzell-Downstream-Analyse zur Verfügung zu stellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Zusammenhang mit Flüssigbiopsien und zellulärer Heterogenität zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Antikörper-basierte Isolierung einzelner Zellen und deren Rückgewinnung für die anschließende molekulargenetische Analyse auf Einzelzellebene ermöglicht.

Sobald diese Technik für den Einsatz bei Patienten zugelassen ist, wird sie die Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen von Krebspatienten ermöglichen. Da diese Methode Aufschluss über die Heterogenität einzelner Zellen geben kann, kann sie auf alle Arten von Zellsuspensionen angewendet werden, die Subpopulationen enthalten, wie z. B. Blutproben, Proben aus Zellkulturen oder dissoziierte Gewebe und Organe. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir ein In-vivo-Anreicherungsgerät verwendeten, das nicht in der Lage ist, Zellen für die nachgelagerte Analyse freizusetzen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Ernte einzelner Zellen mittels Lasermikrodissektion oder Mikromanipulation nur schwer erfolgreich durchzuführen sind, da der Prozess der Ernte einzelner Zellen anfällig für Zellverlust ist und ein hohes Maß an Fachwissen erfordert. In einem Milliliter vorgewärmtem Zellkulturmedium werden die HT-29 CFSE-markierten Zellen resuspendiert und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius regeneriert. Um die Zellen zu ernten, zentrifugieren Sie bei 300 g drei Minuten lang.

Anschließend wird das Zellpellet in einem Milliliter gebrauchsfertiger Hoechst 33342 DNA-Färbelösung bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten resuspendiert. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 g drei Minuten lang. Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in vier Millilitern 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und überprüfen Sie die Fluoreszenzmarkierung mit dem Fluoreszenzmikroskop. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 300 g, verwerfen den Überstand und resuspendieren das Pellet bei etwa 500.000 Zellen pro Milliliter und legen Sie die Zellen auf Eis. In fünf Milliliter peripheres Blut etwa 500 bis 500.000 Zellen geben und dann durch Umdrehen des Röhrchens mischen.

Nachdem Sie den Draht aus dem Aufbewahrungsfach genommen haben, entfernen Sie die Gummikappe, die den Draht hält, waschen Sie den Draht in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung und montieren Sie ihn in die Kappe des Schlauchs. Inkubieren Sie das Röhrchen dann auf einem gekippten Walzenmischer bei fünf Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie den Draht nach der Inkubation dreimal in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Bewahren Sie den Draht dann in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung im Dunkeln auf. Zeichnen Sie mit einem Fettstift einen rechteckigen Bereich auf einen Objektträger und geben Sie dann 500 Mikroliter 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung darauf. Um den Funktionsteil des Drahtes in 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung zu tauchen, biegen Sie den nicht funktionsfähigen Teil des Drahtes und legen Sie ihn auf den Glasschieber.

Um die Anzahl der erfassten Zellen zu zählen, überprüfen Sie beide Seiten des Drahtes visuell. Übertragen Sie den Draht nach der Inspektion zurück in das 15-Milliliter-Röhrchen mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung und bewahren Sie ihn im Dunkeln auf. In einem Milliliter 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung werden vier Milligramm der Freisetzungspufferkomponente aufgelöst und dann die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Sterilfilter filtriert, um den gebrauchsfertigen Puffer zu erhalten.

Erwärmen Sie anschließend den Freisetzungspuffer fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach dem Erwärmen werden 1,6 Milliliter Freisetzungspuffer überführt, um ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen vollständig zu füllen. Als nächstes inkubieren Sie den Funktionsteil des Drahtes im Freisetzungspuffer bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad für 20 Minuten.

Legen Sie den Draht nach der Inkubation 15 Minuten lang bei 500 Umdrehungen pro Minute auf einen Schüttler. Dann zentrifugieren Sie den Draht bei 300 g für 10 Minuten. Sobald die Zentrifugation beendet ist, lösen Sie den Draht aus dem Röhrchen, schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 300 g für 10 Minuten.

Um das Volumen der Zellsuspension zu verringern, verwerfen Sie alle bis auf 100 Mikroliter Überstand für die Mikromanipulation oder 300 Mikroliter für die anschließende Zytozentrifugation und Lasermikrodissektion. Fahren Sie dann schnell mit der Einzelzellprobenahme fort. Für die Mikromanipulation übertragen Sie die gesamten 100 Mikroliter Zellsuspension auf einen Objektträger.

Legen Sie dann den Objektträger auf ein Mikroskop, das mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist, und lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang ruhen. Pipettieren Sie dann in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen zwei Mikroliter des Zelllyse-Mastermixes und übertragen Sie ihn auf Eis. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um eine einzelne Zelle in einem Mikroliter 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu sammeln.

Übertragen Sie die Zelle dann direkt in zwei Mikroliter Zelllyse-Mastermix. Verwenden Sie eine Desktop-Mikrofuge, um die Proben bei 2.000 g drei Sekunden lang schnell nach unten zu schleudern, um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln. Übertragen Sie dann die Probe auf Eis und fahren Sie mit der Adapter-Linker-basierten Ganzgenomamplifikation fort.

Aspirieren Sie nur eine Zelle mit maximal einem Mikroliter Puffer. Wenn Sie die Zelle in die Lyselösung überführen, stellen Sie sicher, dass Sie Blasen sehen, die aus der Lösung aufsteigen, was darauf hinweist, dass das gesamte aspirierte Volumen übertragen wurde. Für die Laser-Mikrodissektion zytozentrifugieren Sie die gesamten 300 Mikroliter Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300 g auf einen membranbeschichteten Objektträger.

Legen Sie dann den membranbeschichteten Objektträger auf ein Mikroskop, das in der Lage ist, eine Lasermikrodissektion durchzuführen. Pipettieren Sie anschließend 4,5 Mikroliter des Zelllyse-Mastermixes in den Deckel des 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens. Setzen Sie die Kappe über die Probe und entnehmen Sie eine einzelne Zelle durch Lasermikrodissektion.

Prüfen Sie direkt danach, ob sich die PCR-Kappe auf isolierte Zellen befindet, nehmen Sie das PCR-Röhrchen aus dem Laser-Mikrodissektionsmikroskop und verschließen Sie das Röhrchen. Sammle die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens mit einer kurzen Drehung. Übertragen Sie die Probe auf Eis und fahren Sie mit der Adapter-Linker-basierten Ganzgenomamplifikation fort.

Stellen Sie sicher, dass Sie die mit dem Laser mikropräparierte Zelle bergen. Daher ist es wichtig, den gesamten Röhrchendeckel mit der Lyselösung zu bedecken. Überprüfen Sie nach der Mikrodissektion den Röhrchendeckel auf das Vorhandensein der Zelle.

Um Zellen zu zeigen, die mit CFSE und Hoechst 33342 gefärbt sind, wurde eine Immunfluoreszenzbildgebung durchgeführt, bevor der Draht geladen wurde, während die Zellen am Draht befestigt wurden, dann vom Draht gelöst und schließlich auf dem Objektträger. Die Immunfluoreszenzbilder der Zellen vor dem Aufladen zeigen eine helle Nukleinfärbung in blau, während das Zytoplasma der Zellen eine grüne CFSE-Färbung mit heterogener Interzellintensität zeigt. Ein ähnliches Färbemuster wird auch bei Zellen beobachtet, die am Draht befestigt und anschließend vom Draht gelöst werden.

Um die Qualität der Produkte zur Amplifikation des gesamten Genoms zu überprüfen, wurde ein 1%Agarose-Gel verwendet. Das Agarose-Gel zeigt einen DNA-Abstrich im Bereich von 0,2 bis über 1 Kilobase für die PCR-Produkte der Ganzgenomamplifikation. Die aus der Einzelzelle gewonnenen PCR-Produkte der 4plex-Qualitätskontrolle ergeben Produkte von 100, 200, 300 und 400 Basenpaaren.

Produkte, die weniger als drei Banden aufweisen, werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Einmal gemeistert, ermöglicht diese Technik die Isolierung einzelner Zellen aus Zellsuspensionen in vier Stunden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen in Puffer einzutauchen, insbesondere während der Zeit, in der die Zellen am Draht befestigt sind, um die Zellen nicht zu beschädigen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können Analysemethoden wie flächenvergleichende genomische Hybridisierung, Next-Generation-Sequencing und zielspezifische PCR durchgeführt werden, um einzelne Zellen anhand von Kopienzahlvariationen und Mutationen zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen mit einem funktionalisierten Draht isoliert und aus Zellsuspensionen gewinnt und wie man einzelne Zellen für mehrere nachgelagerte molekulargenetische Analysen probenimmt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut die Möglichkeit einer Infektion birgt, daher ist das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel bei der Durchführung dieses Verfahrens obligatorisch.