Name: Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Isolierung seltener Zielzellen aus Zellsuspensionen für Einzelzellanalysen. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen und liefert wertvolle Einblicke in die zelluläre Heterogenität.

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Diese Studie wurde von der Wissenschaftsfonds (FWF), Projekt-Nr. finanziert. Ich 1220-B19 (für PS) im Rahmen des Projekts ERANET in Translational Cancer Research (TRANSCAN) "Zirkulierende Tumorzellen als Biomarker für minimaler Resterkrankung in Prostate Cancer (CTC-SCAN)". Doktorand S.C wurde im Rahmen des PhD Programm Molekularmedizin der medizinischen Universität Graz ausgebildet. Die Autoren erkennen dankbar Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz und Johanna Schiller für ihre kompetente technische Unterstützung. Die Autoren danken Georg Peinhaupt für grafische Gestaltung unterstützen.

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<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li>
<li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).</li>
<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die beschriebene Protokoll soll Abrufen von Zellen aus dem funktionalisierten Draht (als Gerät bezeichnet) für ex-Vivo einzellige Genomanalyse. Wir testeten drei EpCAM-positiven Zellinien (HT-29, LNCaP und VCaP), aber grundsätzlich kann dieses Verfahren für jede Zelllinie EpCAM zum Ausdruck zu bringen. EpCAM-positiven Zellen können das Gerät als reines Zellsuspension vorgestellt werden (siehe 2.1.) oder in einen Überschuss von hintergrundzellen gemischt (zB. peripheren Blut, siehe 2.2.). Vor allem Letzteres verwendet werden könnte, Isolierung Kapazitäten unter seltenen Zelle Bedingungen zu testen, fine-tuning der Anzahl der Zellen an den Draht befestigt kann erfolgen mit der beschriebenen Low-Volume Ansatz (siehe 2.3.). Unterschiede zwischen Zell-Linien sind zu erwarten, Geschwindigkeit geeignet Zelldichten zum Aufladen des Drahtes, Drehung sowie Inkubationszeit empirisch geprüft werden, durch die Anzahl der angeschlossenen Zellen mit einem Immunfluoreszenz-Mikroskop auswerten müssen.
Für genomische downstream-Anwendungen auf die einzelne Zelle Ebene WGA ist erforderlich. Die WGA-Methode der Wahl variieren zwischen Labors und unsere Methode ist grundsätzlich offen für alle Methoden als Proben aus Mikromanipulation oder Laser Mikrodissektion verarbeiten kann. In diesem Protokoll verwenden wir eine Methode basierend auf enzymatisch fragmentierte DNA durch eine bessere Leistung im Vergleich zu eine Hitze-Fragmentierung basierte WGA-7. Optional, einzelne Zellen können Isotherme WGA weitergeleitet werden, so dass anschließende DNA-profiling20,21.
Das beschriebene Protokoll zielt auf Wiederherstellung intakte Zellen nach Anhaftung an eine neue Generation von funktionalisierten Drähte für einzellige Genomanalyse. Die erste Generation der funktionalisierten Drähte, die auch bisher nur CE-Zulassung in Vivo Bereicherung Geräte auf dem Markt vertreten, dienten zum Auflisten von CTCs im metastasierten Krebspatienten. Bisherige Veröffentlichungen und unseren eigenen Daten vorschlagen der in Vivo Isolation Technik, um empfindlicher sein im Vergleich zu den aktuellen Gold-Standard Technologie2. So ermöglicht diese in Vivo -Isolierung-Technik mit einem Recovery-Funktion auszustatten, da im Gerät realisiert kombiniert hohe CTC-Rückgewinnung mit Charakterisierung der Ebene der einzelligen.
Aber das Gerät ist nicht für den Einsatz bei Patienten gelöscht, so liegen keine klinischen Daten. Ex-Vivo Anwendungen (d.h. CTCs nach der Entnahme aus dem peripheren Blut zu isolieren) sind nicht empfehlenswert, da die Technologie in den cubital eitel, z.B. geringen Durchmesser der eitel (erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass die Einstellungen angepasst ist direkter Kontakt zwischen CTCs und Fang Antikörper) und lange Verweilzeit (30 min, so dass 2-3 L des Blutes, den Draht zu übergeben). Aber, wie in Abschnitt 2.2. Ziel-Zellen können auch von Mischproben7isoliert werden.
Eine Strombegrenzung der Methode ist die ineffiziente Wiederherstellung des fixierten Zellen nach der Loslösung von den Drähten. Dies könnte jedoch durch eine Zelle Fixierung Schritt vor der Ablösung Behandlung verbessert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen ist dieses Protokoll ein erster Schritt in Richtung der kombinierten Nutzung einer in-Vivo -Isolierung-Technik mit Handy Recovery für genetisch Charakterisierung einzelne Zellen. Weitere Anstrengungen müssen die Optimierung der Zelle Erholung und Freiraum für ihre Anwendung in Patienten1,2. Personalisierter Medizin für Behandlungsentscheidungen Überwachung und Therapie ist jedoch über die Aufzählung der CTC. Diese Methode ist somit ein erster Schritt zur genomischen CTC Charakterisierung der Ebene der einzelnen Zelle.
Anwendungen in Richtung einzellige Transkriptom-Analyse scheinen machbar, wie intakte Zellen geerntet werden. Es bleibt jedoch um zu prüfen, ob die Wiederherstellung Prozedur auf Integrität der RNA (z. B. Weiterleitung wiederhergestellten Einzelzellen zu direkten Lyse gefolgt von RT-qPCR22) auswirkt. Im Erfolgsfall kann auf die Transkriptom-Ebene, so dass detailliertere Analysen Charakterisierung einzelner Zellen (z. B. CTCs) verschoben werden. In dieser Hinsicht, RNA-Seq mit Smart-seq2 bietet ein wertvolles Werkzeug für RNA nachgelagerte Analyse einzelner Zellen, wie die preamplified cDNA (erhältlich bei RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung) quantitative PCR ausgesetzt sein kann. Dadurch wird eine kombinierte Ziel und Screening-basierte Analyse der wiederhergestellten Einzelzellen22,23.
Die aktuellen funktionalisierten Drähte basieren auf Anti-EpCAM-Antikörper, die eine weit verbreitete epitheliale Marker für positive Selektion von CTC24ist. Wie mehrere CTCs Downregulate epitheliale Marker wie cytokeratin oder EpCAM25könnte, würden Antikörper wie HER2/neu hinzufügen erhöht die Chance der CTC-Isolation. Verschiedene Antikörper basierten Bereicherung Strategien entwickelt und bewertet von Ferreira Et Al. in 201626. Eine Mischung von Antikörpern, die unbeweglich auf einem Draht könnte eine künftige Verbesserung der Technologie führt zu die Isolierung von einer höheren Anzahl und weitere Subtypen des CTC.
Es ist obligatorisch für alle Schritte, die mit Draht Handhabung halten das Funktionsteil des Drahtes in Lösung eingetaucht, um seine Funktionalität zu erhalten. Wir empfehlen, legen Sie den Draht mit 1 X PBS-Puffer bei der Auswertung (Mikroskop; zB. Schritte 3.1. -3.3.) und Lagerung. Um unangemessene Fleckenbildung zu vermeiden, empfehlen wir mit frisch Färbelösung in Schritten 1.2.1 vorbereitet. und 1.2.2. Schwach gefärbten Zellen hemmen Zelle zählen auf dem Draht und können dazu führen, die Unterschätzung der angeschlossenen Zellen.
Es ist notwendig, um zu vermeiden, stecken die Pasteur-Pipette mit der Gummikappe beim Einfügen des Drahts in der Pasteurpipette für das anschließende Laden die Zellsuspension (Schritt 2.3.4.). Die Gummikappe wird verwendet, um den Draht in Position zu halten, so dass das Funktionsteil Geheimtipp der Pasteurpipette befindet. Wenn die Kappe an der Rückseite des Pasteur-Pipette zu fest sitzt, ist laden die Zellsuspension nicht möglich. In diesem Fall erleichtern Sie die Kappe so, dass die Luft durch die geladenen Zellsuspension verdrängte die Pipette verlassen kann.
Biege den Draht ist entscheidend für die Ausrichtung in der Zelle zählen in Schritten 3.2. und 3.3. Montieren Sie die Drähte mit Klebeband so, dass der nicht-funktionalen Ende des Drahtes auf der einen Seite zu liegen kommt. Nach dem Scannen der gesamten Länge der Funktionsteil, wird der Draht 180° gerollt, so dass die andere Hälfte des funktionalen Drahtes gescannt werden kann. Dieser Schritt ist wichtig für erste Experimente, die Anzahl der Zellen auf dem Draht zu beurteilen. Sobald die Anzahl der Zellen für eine bestimmte Zell-Linie und Verfahren ausgewertet wird, kann das Verfahren wiederholt werden, ohne Zellzählung (zB. nur Prüfung auf Vorhandensein von Zellen oder diesen Schritt weglassen). Sorgfältige pipettieren ist entscheidend für die Zelle Verlust zu vermeiden, wenn Sie die Lautstärke des Überstands im Schritt 4.8 reduzieren. Sicherstellen Sie, dass pipettieren reibungslos erfolgt ohne Turbulenzen zum Pellet.

Vor kurzem wurde CellCollector DC01, eine medizinische Leitung funktionalisiert mit Anti-EpCAM Antikörper zur Isolierung von CTCs aus dem peripheren Blut von Krebspatienten, das methodische Spektrum der CTC-Enumeration1,2,3 hinzugefügt . In einer laufenden Studie mit nicht-metastatischem Prostatakrebs funktionalisierten Draht berichtet fast doppelt so viele Patienten CTC-positiv sein und höhere CTC zählt im CTC-positiven Patienten im Vergleich zu CellSearch, den Goldstandard in CTC-Enumeration3 . Aufgrund dieser erfreulichen Entwicklung Isolation von Zellen aus dem funktionalisierten medizinische Draht für einzellige Analyse wäre wünschenswert, aber weder enzymatische Behandlung mit Zelle Ablösung Lösungen (z.B. Trypsin) Laser Mikrodissektion ermöglicht die Wiederherstellung der intakten Zellen (Daten nicht gezeigt).
Um das Ablösen der erfassten Zellen zu ermöglichen, wurde eine neue Generation von funktionalisierten Drähte mit einem speziellen Polymer ausgestattet. Dieses Polymer, das die Capture-Antikörper auf den Draht verbindet, ist anfällig für eine Veröffentlichung Puffer Behandlung ermöglicht Ablösung der intakte Zellen (CellCollector DC03 bezeichnet als Gerät). Das neue funktionalisierten Gerät ermöglicht Isolation der Zielzellen aus verschiedenen Konzentrationen von Krebszellen Zelle Zeile versetzt in Rinderserumalbumin (BSA) / Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und peripheren Blut, beziehungsweise.
Um die visuelle Erkennung von Zellen auf dem Gerät und nach der Genesung zu erleichtern, sind die Krebszellen mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-) und eine DNA-Fleck vor der Wiederherstellung Behandlung beschriftet (i.e. Lade- und abnehmen). Die behandlungseffekte auf DNA-Qualität einzelner Zellen wurden zuvor nach WGA mittels einer Qualitätskontrolle PCR4,5, Array-CGH6,7 bewertet und gezielte Sequenzierung7 zeigen keinen Unterschied im Vergleich zu unbehandelten Zellen Micromanipulated Zelle Suspensionen7. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Kombination von seltenen Zielzelle Voranreicherung und die Erholung der Zellen für einzellige nachgelagerte Analyse (Abbildung 1). Die aktuellen CE-Kennzeichnung in Vivo sammelvorrichtung dient in der Regel für die Enumeration von CTC nicht für einzellige molekulare Charakterisierung2,8. Jedoch umfassendere Analyse zu untersuchen, Heterogenität unter CTCs lang für Analysen auf der Ebene der einzelnen Zelle (d. h. gezielte Sequenzierung der Ebene der einzelligen). Andere Zell-basierte Methoden basieren auf Immunomagnetic Isolierung von EpCAM-positiven CTCs und einzellige Handling basierend auf Dielektrophorese für nachfolgende molekulargenetisch analysiert9,10. Molekulare Charakterisierung von CTCs ist eine wichtige Voraussetzung für ihre nützliche Umsetzung in einem klinischen Umfeld und ist ebenso wichtig für die Grundlagenforschung der metastatischen Kaskade. Parallel zur CTCs zirkulierenden Tumor-DNA (CtDNA) von großer Bedeutung geworden es DNA-Analyse der tumorlast mit minimalen technischen Isolierung Verfahren11,12erlaubt. Die zellbasierte Ansätze als einen ergänzenden Beitrag dienen könnte, denn es ermöglicht eine RNA13,14 und Eiweiß15 Expressionsanalyse und auch für CTC abgeleitet Zelle Kulturen oder Xenotransplantate16, 17. Obwohl Hindernisse wie niedrige Zelle Erholung und Freiraum für die Anwendung bei Patienten noch überwunden werden müssen, die fangen und freilassen-Methode akzeptiert einen wichtigen nächsten Schritt zur Charakterisierung der seltenen Zielzellen.

<table><tbody><tr><td>Gilupi Release Buffer</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>Wird verwendet, um Zellen vom Draht zu lösen</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1x) Suppl. mit L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>Kulturmedium für HT-29-Zellen, passt das Kulturmedium an die für die Experimente verwendete Zelllinie</td></tr><tr><td>an HEPES Pufferlösung (1 M)</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>Ergänzung für McCoy's 5A Medium</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Supplement für McCoy's 5a modifiziertes Medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>Supplement für McCoy's 5a modifiziertes Medium</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Zellablösungslösung (Zellkultur)</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>GFL</td><td>Typ 1003</td><td>Wird zum Vorwärmen von Lösungen</td></tr><tr><td>verwendet Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Wird zum Inkubieren von Zellen (Zellkultur) verwendet50</td></tr> <tr><td>mL Reaktionsgefäße</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>Walzenmischer</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>Wird verwendet, um Zellen am Draht zu befestigen und gleichzeitig zu verhindern, dass die Zellen sedimentieren</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Zellproliferation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Zur Markierung lebender Zellen (zytoplasmatische Markierung)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Zur Färbung von DNA (Nukleinsäure-Gegenfärbung)</td></tr><tr><td>Zentrifuge (ausgerüstet für die Aufnahme von 15 mL und 50 mL Reaktionsröhrchen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Zur Pelletierung</td></tr> von <tr><td>Zellen Observer Z1 (Fluoreszenz-/Laser-Mikrodissektionsmikroskop)</td><td>Carl Zeiss Microimaging</td><td></td><td>Inverses (Immunfluoreszenz-)Mikroskop für die Lasermikrodissektion; Fluoreszenzmikroskope müssen in der Lage sein, Hoechst 33342 (DAPI-Filter) und CFSE (FITC-Filter) zu detektierenRinderserumalbumin</td></tr> <tr><td>(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>Wird zur Beschichtung von Glas-/Kunststoffoberflächen</td></tr><tr><td>verwendet MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td>Wird zum Vortexen von</td></tr><tr><td>Vacutainer-EDTA- (oder Na-Heparin-) Röhrchen</td><td>verwendet BD</td><td>366450 (oder 366480)</td><td>Wird als Reaktionsröhrchen für die ex vivo-Erfassung von Zielzellen verwendet</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>Funktionalisierter Draht zum Isolieren und Trennen von EpCAM-positiven Zellen (auch als catch& Veröffentlichung, C& R)</td></tr><tr><td>Spritzennadeln (G20)</td><td>VWR</td><td>613-0554</td><td>Wird zum Durchstechen von Gummikappen verwendet, um den nicht funktionsfähigen Teil des C& R zur Führung</td></tr><tr><td>Neubauer-Kammer</td><td></td><td>Roth T729.1</td><td>Zur Zellzählung</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Zur Applikation von Zellen mit geringem Volumen auf die C& R</td></tr><tr><td>Fettstift</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Wird auf Objektträgern verwendet, um die Zellsuspension an Ort und Stelle zu halten</td></tr><tr><td>Steriler Spritzenvorsatzfilter (0,2 & Mikro; m)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>Zum Filtrieren frisch zubereiteter Gilupi Release Buffer</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>Wird zum Rühren während der Zellablösung</td></tr><tr><td>verwendet 1,5 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA Kit</td><td>Silicon Biosystems</td><td></td><td>Zu bestellen über Silicon Biosystems</td></tr><tr><td>Axiovert M200 ausgestattet mit Mikromanipulator MMJ und CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>Mikromanipulation griffbereit</td></tr><tr><td>Mikrokapillaren (25 & Mikrokapillaren) m im Durchmesser), CustomTip Type I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>Zur Mikromanipulation von Zellen</td></tr><tr><td>0,2 mL PCR-Röhrchen</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>Zytozentrifuge und Zubehör</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>Zytozentrifuge zur Hand verwenden</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>Jeder Thermocycler mit beheiztem Deckel kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>Desktop-Zentrifuge zur Hand verwenden</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>Membranbeschichtete Objektträger für die Lasermikrodissektion</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800 Stratagene</td><td></td><td>400072</td><td>DNA-Vernetzer zur Hand verwenden</td></tr><tr><td>Standard-PCR-Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6x DNA-Beladung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Gel verwenden Laden des Farbstoffs zur Hand</td></tr><tr><td>DNA-Leiter</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>Verwenden Sie eine 100 bp Leiter zur Hand</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Gel Electorphoresestation</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Verwenden Sie ein Elektrophoresesystem zur Hand</td></tr><tr><td>Gel Rote Nukleinsäure Färbung</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Interkalierender Farbstoff für die DNA-Visualisierung In Agarose-Gelen</td></tr></tbody></table>

ziel zelle voranreicherung und ganze genome amplifikation für einzelne zelle nachgelagerten charakterisierung

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Seltene Zielzellen können aus einem hohen Hintergrund von nicht-Ziel-Zellen Antikörper spezifisch für Oberflächenproteine von Zielzellen mit isoliert werden. Eine neu entwickelte Methode verwendet einen medizinische Draht funktionalisiert mit Anti-Epithelzelle Adhäsion Molekül (EpCAM) Antikörper zur in-Vivo -Isolierung zirkulierender Tumor Zellen (CTCs)1. Eine Patient abgestimmt Kohorte in nicht-metastatischem Prostatakrebs zeigte, dass die in-Vivo -Isolierung-Technik führte zu einen höheren Prozentsatz von Patienten positiv für CTC sowie höhere CTC zählt im Vergleich zu den aktuellen Goldstandard in CTC-Enumeration. Wie Zellen aus aktuellen medizinischen Geräten wiederhergestellt werden können, wurde ein neues funktionalisierten Kabel (als Gerät bezeichnet) durch enzymatische Behandlung hergestellt ermöglicht Erfassung und anschließende Ablösung der Zellen. Zellen sind Anfügen an das Gerät, auf dem Mikroskop sichtbar gemacht und gelöst mit enzymatischen Behandlung erlaubt. Wiederhergestellte Zellen sind Cytocentrifuged auf Membran-beschichtete Folien und einzeln mittels Laser Mikrodissektion oder Mikromanipulation geerntet. Einzellige Proben werden dann ganze Genom einzellige Verstärkung erlaubt mehrere nachgelagerte Analyse einschließlich Screening und Target-spezifische Ansätze unterzogen. Das Verfahren der Isolation und Erholung liefert qualitativ hochwertige DNA aus einzelnen Zellen und anschließende ganze Genom Verstärkung (WGA) nicht beeinträchtigt. Eine einzelne Zelle amplifizierten DNA kann auf Screening weitergeleitet werden und/oder gezielte Analyse wie Array vergleichende Genom Hybridisierung (Array-CGH) oder Sequenzierung. Das Gerät ermöglicht ex Vivo Isolation von künstlichen seltene Zellproben (d.h. 500 Zielzellen in 5 mL des peripheren Blutes versetzt). Während Loslösung der Zellen akzeptabel (50-90 %) sind, die Wiederfindungsrate freistehende Zellen auf Folien umfasst ein breites Spektrum hängt von der Zell-Linie verwendet (< 10 - > 50 %) und einige weitere Aufmerksamkeit benötigt. Dieses Gerät ist nicht für die Anwendung bei Patienten gelöscht.

Zellen nach CFSE- und Nukleinsäuren Färbung können mit einem Immunfluoreszenz-Mikroskop ausgestattet mit Filter für DAPI und FITC ausgewertet werden. Kerne präsentieren mit einer hellen gegenfärbung im DAPI-Kanal während Zytoplasma der Zellen zeigen einheitliche Kennzeichnung mit CFSE mit heterogenen Inter Zelle Intensität (Abbildung 2A und 2E). Ähnliche Form und Färbung Intensitäten von Zellen mit dem Draht (Abb. 2 b und 2F) erwartet als auch losgelöst von den Draht und erholte sich auf einer Folie (Abb. 2D und 2 H).
Hohen Zelldichten (z. B. &gt; 1 000 000 Zellen/mL) kann in vollständige Abdeckung des Drahtes mit Zellen führen, wenn die Drähte zu laden. Doch unteren Zelldichten, Veränderungen der Drehzahl während der Inkubation und den Einsatz von verschiedenen Zelllinien beeinflussen die Isolierwirkung und gesondert geprüft werden müssen. Wenn die Drähte wurden mit 5 mL von HT-29 Zellen auf 100 000 Einwohner Zellen inkubiert / mL als in Abschnitt 2.1 beschrieben., einen Mittelwert von 254 ± 103 Zellen (n = 5) auf den Drähten gefangen genommen wurden. Mit der gleichen Experimentieren mit LNCaP Zellen, einen Mittelwert von 440 ± 319 Zellen (n = 5) pro Draht gewonnen wurde.
Präsentieren 500, 5 000 und 50 000 HT-29 Zellen in einem Hintergrund von 5 mL des peripheren Blutes Drähte (laut Protokoll Abschnitt 2.2.) führte zu der Einnahme von 75 ± 18 Zellen, 25 ± 9 Zellen und 47 ± 57 Zellen (n = 3, jedes), beziehungsweise. Wenn der Draht mit 15 µL Zellsuspension (1 000 000 Zellen/mL) nach dem Protokoll in Abschnitt 2.3 aufgeladen ist., bis 1 000 (HT-29) Zellen zu einem Draht befestigen können.
Handy-Abteilung Wirkungsgrade zwischen 81 % in HT-29 Zellen (reichen 54,9 % 93,2 % und n = 5) auf 81 % (reichen 63.51 % 92,87 %, n = 6) und 91 % (reichen 84,7 95,3 %, n = 6) in LNCaP und VCaP Zellen, beziehungsweise. Ebenso unterscheidet sich die Erholung der freistehende Zellen zwischen Zell-Linien: ein Mittelwert von 28 % der freistehenden HT-29 Zellen wurden von Cytocentrifugation geborgen. Während die Wiederfindungsrate für LNCaP unter 10 % lag, war die mittlere Verwertungsquote für VCaP Zellen 55 %.
Etwa 75 % der Einzelzellen unterzogen WGA Ertrag WGA Qualitätsprodukte: Dies ist (1) Abstrich der WGA-Produkte von 0,1 bis &gt; 1 kb (Abb. 4, oben) und (2) drei oder vier Bands in der 4plex Qualität kontrollieren PCR (Abbildung 4, Bodenplatte) . WGA-Produkte sind für 1) Array-CGH Profilierung erfüllt die Qualitätskriterien für einzellige Array-CGH profile 6,7 und 2) gezielte NGS nach erneuten Verstärkung WGA 7einsetzbar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow für die Isolierung und Wiederherstellung von Zielzellen für einzellige Analyse. (A) Zellen sind zu 90 % Konfluenz kultiviert und geerntet (B) um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Nach der Färbung mit CFSE- und Nukleinsäuren Fleck, (C) des funktionalisierten Drahts wird in Anwesenheit von Zellen in einem Volumen von 5 mL Reaktionsgefäße mit oder ein geringes Volumen mit einer Pasteur PIPETTENSPITZE inkubiert. Letzteres ermöglicht Anwendung der Zelle Aussetzung Bände so niedrig wie 15 µL., (D) Zellen müssen innerhalb von 4 Stunden nach der Aufladung loszubinden. Daher befindet sich der Draht in eine 1,5 mL Reaktionsgefäß mit Freigabe Puffer gefüllt. Nach 15 min Inkubation auf einer Wippe und 10 min zentrifugieren der Draht entfernt und die Zellsuspension wird zentrifugiert, um die Zellen zu Pellets. (E) Recovered Zellen sind entweder auf einen Glasobjektträger für einzellige Mikromanipulation (oben) oder Cytocentrifuged auf eine Membran-beschichtete Folie übertragen und weitergeleitet, um laser-Mikrodissektion (unten). (F) schließlich werden geerntete Einzelzellen durch ganze Genome Amplifikation (WGA) verstärkt. WGA-Produkte sind kompatibel mit Array-CGH und gezielte NGS nachgelagerte Analyse. EpCAM-Epitop: grüner Kreis auf der Zelloberfläche. Funktionalisiert Draht: Gerät, grauen Triple-spiralförmige Kabeln. Polymer: violette Linien. Anti-EpCAM-Antikörper: Orange. Lassen Sie Puffer Aktivität: roter Pfeil. Fett-Marker auf die Zellsuspension in Position zu halten: dunkel blaue Ellipse. Zellsuspension wiederhergestellt: hellblau. Kapillare für Mikromanipulation: schwarze Linie. Vergrößerung: wiederhergestellte Zelle durch Mikromanipulation geerntet, Cytospin auf Membran bedeckt schieben mit wiederhergestellten Zellen (grau gefüllte Ellipse). Vergrößerung: wiederhergestellte Zelle wird laser-Microdissected (graue Kreislinie: Membran Membran Folie dient als Rückgrat für Laser-Mikrodissektion), Objektive mit Laserstrahl (blaue Linie nähert sich die Membran Folie von unten). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Abbildung 2: Visualisierung von markierten Zellen. (A, E) Zellen vor dem Laden: Zellen sind gekennzeichnet mit CFSE und counterstained mit einer DNA verschuppen Farbstoff zeigt eine Reihe von CFSE-(grün)-Signalintensität. (B,F) Markierten Zellen auf den Draht festgehalten. (C,G) Draht nach Zelle-Ablösung Eingriff. (D,H) Zellen aus Draht getrennt und wiederhergestellt, indem Cytocentrifugation auf einer Folie. CFSE-: FITC Kanal (grün). DNA-Fleck: DAPI-Kanal (blau). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Abbildung 3: Draht und lagern. (A) Fächer des Drahtes. (B) Detail der funktionalisierten Teil. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Abbildung 4: Qualitätskontrolle WGA Produkte aus einzelnen Micromanipulated Zellen gewonnen. Oberseite: WGA-Erzeugnisse, die aus einzelnen Zellen in der Regel Ergebnis in DNA Abstriche von bis zu 0,2 kb &gt; 1,0 kb mit einem Peak-Intensität bei rund 0,5 kb. Proben Nr. 1, 7 und 13 (mit Sternchen gekennzeichnet) suboptimale zeigen oder keine DNA schmiert. Bodenplatte: WGA Produkte sind von ausreichender Qualität, wenn die 4plex PCR drei oder vier von vier PCR Produkte ergibt (bei 100, 200, 300 und 400 bp). Proben 1, 7, 10 und 13 zeigen weniger als drei Bands und würde von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Lane M enthält eine 100 bp-Leiter und Sternchen geben die Proben nicht ausreichend WGA-Produktqualität. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer Sequenz</td>
			<td>HINWEIS</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-Gtt Cca Ata Tga Ttc Cac cc-3′</td>
			<td>100 bp forward primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-Ctc Ctg Gaa Gat Ggt Gat Gg-3′</td>
			<td>100 bp-rückwärts-primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-Agg Tgg Agc gag gct Agc-3′</td>
			<td>200 bp forward primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-Ttt Tgc Ggt Gga Aat AGB ct-3 '</td>
			<td>200 bp-rückwärts-primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-Agg Tga Gac Att Ctt gct Gg-3′</td>
			<td>300 bp forward primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-Tcc handeln Aac Cag Tca Gcg Tc-3 '</td>
			<td>300 bp-rückwärts-primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-Aca Gtc Katze Gcc Atc handeln gc-3 '</td>
			<td>400 bp forward primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-gct Tga caa Agt Ggt Cgt tg-3′</td>
			<td>400 bp-rückwärts-primer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Primer-Sequenzen für 4plex Qualitätskontrolle PCR

Dieses Protokoll ist zu erholen und molekulare genetische Charakterisierung der Ebene der einzelligen seltene Zielzellen aus einer Mischung mit Nichtziel-hintergrundzellen vorbereiten. DNA-Qualität entspricht nicht behandelten Einzelzellen und einzellige Anwendung (sowohl Screening basiert und gezielte Analyse) ermöglicht.

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen aus Zellsuspensionen zu isolieren, um sie für die Einzelzell-Downstream-Analyse zur Verfügung zu stellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Zusammenhang mit Flüssigbiopsien und zellulärer Heterogenität zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Antikörper-basierte Isolierung einzelner Zellen und deren Rückgewinnung für die anschließende molekulargenetische Analyse auf Einzelzellebene ermöglicht.Sobald diese Technik für den Einsatz bei Patienten zugelassen ist, wird sie die Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen von Krebspatienten ermöglichen. Da diese Methode Aufschluss über die Heterogenität einzelner Zellen geben kann, kann sie auf alle Arten von Zellsuspensionen angewendet werden, die Subpopulationen enthalten, wie z. B. Blutproben, Proben aus Zellkulturen oder dissoziierte Gewebe und Organe. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir ein In-vivo-Anreicherungsgerät verwendeten, das nicht in der Lage ist, Zellen für die nachgelagerte Analyse freizusetzen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Ernte einzelner Zellen mittels Lasermikrodissektion oder Mikromanipulation nur schwer erfolgreich durchzuführen sind, da der Prozess der Ernte einzelner Zellen anfällig für Zellverlust ist und ein hohes Maß an Fachwissen erfordert. In einem Milliliter vorgewärmtem Zellkulturmedium werden die HT-29 CFSE-markierten Zellen resuspendiert und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius regeneriert. Um die Zellen zu ernten, zentrifugieren Sie bei 300 g drei Minuten lang.Anschließend wird das Zellpellet in einem Milliliter gebrauchsfertiger Hoechst 33342 DNA-Färbelösung bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten resuspendiert. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 g drei Minuten lang. Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in vier Millilitern 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer und überprüfen Sie die Fluoreszenzmarkierung mit dem Fluoreszenzmikroskop. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 300 g, verwerfen den Überstand und resuspendieren das Pellet bei etwa 500.000 Zellen pro Milliliter und legen Sie die Zellen auf Eis. In fünf Milliliter peripheres Blut etwa 500 bis 500.000 Zellen geben und dann durch Umdrehen des Röhrchens mischen.Nachdem Sie den Draht aus dem Aufbewahrungsfach genommen haben, entfernen Sie die Gummikappe, die den Draht hält, waschen Sie den Draht in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung und montieren Sie ihn in die Kappe des Schlauchs. Inkubieren Sie das Röhrchen dann auf einem gekippten Walzenmischer bei fünf Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie den Draht nach der Inkubation dreimal in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Bewahren Sie den Draht dann in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung im Dunkeln auf. Zeichnen Sie mit einem Fettstift einen rechteckigen Bereich auf einen Objektträger und geben Sie dann 500 Mikroliter 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung darauf. Um den Funktionsteil des Drahtes in 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung zu tauchen, biegen Sie den nicht funktionsfähigen Teil des Drahtes und legen Sie ihn auf den Glasschieber.Um die Anzahl der erfassten Zellen zu zählen, überprüfen Sie beide Seiten des Drahtes visuell. Übertragen Sie den Draht nach der Inspektion zurück in das 15-Milliliter-Röhrchen mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung und bewahren Sie ihn im Dunkeln auf. In einem Milliliter 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung werden vier Milligramm der Freisetzungspufferkomponente aufgelöst und dann die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Sterilfilter filtriert, um den gebrauchsfertigen Puffer zu erhalten.Erwärmen Sie anschließend den Freisetzungspuffer fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach dem Erwärmen werden 1,6 Milliliter Freisetzungspuffer überführt, um ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen vollständig zu füllen. Als nächstes inkubieren Sie den Funktionsteil des Drahtes im Freisetzungspuffer bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad für 20 Minuten.Legen Sie den Draht nach der Inkubation 15 Minuten lang bei 500 Umdrehungen pro Minute auf einen Schüttler. Dann zentrifugieren Sie den Draht bei 300 g für 10 Minuten. Sobald die Zentrifugation beendet ist, lösen Sie den Draht aus dem Röhrchen, schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 300 g für 10 Minuten.Um das Volumen der Zellsuspension zu verringern, verwerfen Sie alle bis auf 100 Mikroliter Überstand für die Mikromanipulation oder 300 Mikroliter für die anschließende Zytozentrifugation und Lasermikrodissektion. Fahren Sie dann schnell mit der Einzelzellprobenahme fort. Für die Mikromanipulation übertragen Sie die gesamten 100 Mikroliter Zellsuspension auf einen Objektträger.Legen Sie dann den Objektträger auf ein Mikroskop, das mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist, und lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang ruhen. Pipettieren Sie dann in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen zwei Mikroliter des Zelllyse-Mastermixes und übertragen Sie ihn auf Eis. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um eine einzelne Zelle in einem Mikroliter 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu sammeln.Übertragen Sie die Zelle dann direkt in zwei Mikroliter Zelllyse-Mastermix. Verwenden Sie eine Desktop-Mikrofuge, um die Proben bei 2.000 g drei Sekunden lang schnell nach unten zu schleudern, um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln. Übertragen Sie dann die Probe auf Eis und fahren Sie mit der Adapter-Linker-basierten Ganzgenomamplifikation fort.Aspirieren Sie nur eine Zelle mit maximal einem Mikroliter Puffer. Wenn Sie die Zelle in die Lyselösung überführen, stellen Sie sicher, dass Sie Blasen sehen, die aus der Lösung aufsteigen, was darauf hinweist, dass das gesamte aspirierte Volumen übertragen wurde. Für die Laser-Mikrodissektion zytozentrifugieren Sie die gesamten 300 Mikroliter Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300 g auf einen membranbeschichteten Objektträger.Legen Sie dann den membranbeschichteten Objektträger auf ein Mikroskop, das in der Lage ist, eine Lasermikrodissektion durchzuführen. Pipettieren Sie anschließend 4,5 Mikroliter des Zelllyse-Mastermixes in den Deckel des 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens. Setzen Sie die Kappe über die Probe und entnehmen Sie eine einzelne Zelle durch Lasermikrodissektion.Prüfen Sie direkt danach, ob sich die PCR-Kappe auf isolierte Zellen befindet, nehmen Sie das PCR-Röhrchen aus dem Laser-Mikrodissektionsmikroskop und verschließen Sie das Röhrchen. Sammle die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens mit einer kurzen Drehung. Übertragen Sie die Probe auf Eis und fahren Sie mit der Adapter-Linker-basierten Ganzgenomamplifikation fort.Stellen Sie sicher, dass Sie die mit dem Laser mikropräparierte Zelle bergen. Daher ist es wichtig, den gesamten Röhrchendeckel mit der Lyselösung zu bedecken. Überprüfen Sie nach der Mikrodissektion den Röhrchendeckel auf das Vorhandensein der Zelle.Um Zellen zu zeigen, die mit CFSE und Hoechst 33342 gefärbt sind, wurde eine Immunfluoreszenzbildgebung durchgeführt, bevor der Draht geladen wurde, während die Zellen am Draht befestigt wurden, dann vom Draht gelöst und schließlich auf dem Objektträger. Die Immunfluoreszenzbilder der Zellen vor dem Aufladen zeigen eine helle Nukleinfärbung in blau, während das Zytoplasma der Zellen eine grüne CFSE-Färbung mit heterogener Interzellintensität zeigt. Ein ähnliches Färbemuster wird auch bei Zellen beobachtet, die am Draht befestigt und anschließend vom Draht gelöst werden.Um die Qualität der Produkte zur Amplifikation des gesamten Genoms zu überprüfen, wurde ein 1%Agarose-Gel verwendet. Das Agarose-Gel zeigt einen DNA-Abstrich im Bereich von 0,2 bis über 1 Kilobase für die PCR-Produkte der Ganzgenomamplifikation. Die aus der Einzelzelle gewonnenen PCR-Produkte der 4plex-Qualitätskontrolle ergeben Produkte von 100, 200, 300 und 400 Basenpaaren.Produkte, die weniger als drei Banden aufweisen, werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Einmal gemeistert, ermöglicht diese Technik die Isolierung einzelner Zellen aus Zellsuspensionen in vier Stunden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen in Puffer einzutauchen, insbesondere während der Zeit, in der die Zellen am Draht befestigt sind, um die Zellen nicht zu beschädigen.Im Anschluss an dieses Verfahren können Analysemethoden wie flächenvergleichende genomische Hybridisierung, Next-Generation-Sequencing und zielspezifische PCR durchgeführt werden, um einzelne Zellen anhand von Kopienzahlvariationen und Mutationen zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen mit einem funktionalisierten Draht isoliert und aus Zellsuspensionen gewinnt und wie man einzelne Zellen für mehrere nachgelagerte molekulargenetische Analysen probenimmt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut die Möglichkeit einer Infektion birgt, daher ist das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel bei der Durchführung dieses Verfahrens obligatorisch.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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