Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Unser Protokoll erleichtert die einfache, effiziente und schnelle Herstellung genetisch veränderter Mäuse aus einzelligen Mausembryonen. Unser Protokoll kombiniert die Verwendung von gefriergetauten Einzell-Embryos und Elektroporation, die die schnelle Erzeugung genetisch veränderter Mäuse einschließlich der mutierten Mäuse mit hoher Effizienz und niedrigen Mosaikraten ermöglicht. Für die In-vitro-Fertilisation beginnen Sie mit der Überoulation von vier oder acht Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Mäusen durch intraperitoneale Injektion von 7,5 internationalen Einheiten des schwangeren Stutenserumgonadotropins, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von 7,5 internationalen Einheiten humanen Choriongonadotropins 48 Stunden später.

Als nächstes entfernen Sie Cauda epididymis von geschlechtsreifen drei bis fünf Monate alten männlichen C57BL/6J Mäusen und verwenden Sie eine Seziernadel, um Spermatozoen zu extrahieren. Dann inkubieren Sie die Gerinnsel in einem 200 Mikroliter Tropfen HTF bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 1,5 Stunden für die Kapitulation. 16 bis 18 Stunden nach der injektion humanen Choriongonadotropin, sammeln Cumulus Oozytenkomplexe aus den Eileitern und inkubieren die Komplexe mit 200 MikroliterHT für eine nicht mehr als zweistündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator mit flüssigem Paraffin.

Am Ende der Inkubation einen bis fünf Mikroliter Spermiensuspension von der Grenze des Inkubationsmediums zum 200-Mikroliter-Tropfen Cumulus-Oozyten-Komplexe hinzufügen und die Kokultur drei Stunden lang im Zellkultur-Inkubator platzieren. Am Ende der Inkubation die Eizellen mit kaliumergänztem Simplex-Optimierungsmedium dreimal waschen, um alle verbleibenden Spermien und Cumuluszellen zu entfernen und ein invertiertes Mikroskop zu verwenden, um die pronukleare Bildung und den Grad der einzelligen Embryonen zu überprüfen. Für eine Zellembryonokkonservierung übertragen Sie die Embryonen in einen frischen 200-Mikroliter-Tropfen HTF, ergänzt mit 20% fetalem Rinderserum für eine 10-minütige Inkubation im Zellkultur-Inkubator.

Am Ende der Inkubation 20 bis 100 Embryonen auf 50 Mikroliter einer Molaren-Dimethylsulfoxidlösung übertragen und bis zu 100 Embryonen in fünf Mikroliterlösung auf den Boden eines Kryotube übertragen. Kühlen Sie die Embryonen für fünf Minuten bei null Grad Celsius, bevor Sie 45 Mikroliter DAP213 Lösung an der Seite des Rohres hinzufügen. Nach dem Abdeckeln die Zellen weitere fünf Minuten bei null Grad Celsius aufbewahren, bevor Sie das Rohr schnell in flüssigem Stickstoff lagern.

Bereiten Sie ein Mikrogramm pro Mikroliter CRISPR-RNA und ein Mikrogramm pro Mikroliter tracrRNA in reduziertem Serum minimal entiellem Medium vor. Fügen Sie sechs Mikroliter jeder RNA-Lösung zu 42 Mikrolitern nukleasefreien Puffer hinzu und legen Sie das Gemisch drei Minuten lang bei 95 Grad Celsius in einen trockenen Heizkörper. Am Ende der Inkubation die Mischung bei Raumtemperatur fünf Minuten abkühlen und ein Mikrogramm pro Mikroliter HiFi Cas9-Protein mit reduziertem Serum minimalen essentiellen Medium zubereiten.

Fügen Sie der RNA-Lösung sechs Mikroliter der verdünnten HiFi Cas9-Lösung hinzu und übertragen Sie bis zu 100 aufgetaute Embryonen in 25 Mikroliter der resultierenden Ribonukleoprotein-Komplexlösung in einem ganzen Glasschlitten. Dann brüten Embryonen für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Für die Embryo-Elektroporation am Ende der Inkubation die Elektroporatorparameter einstellen und den Schlitten auf den Elektroporator laden.

Die Elektroporation sollte innerhalb einer Stunde nach dem Auftauen des Embryos durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Genombearbeitung vor der ersten Replikation der DNA erfolgt und um Mosaikismus zu verhindern. Waschen Sie die Embryonen nach der Elektroporation dreimal mit modifiziertem Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer zwei Mittel in zwei Waschungen mit einem Tropfen kaliumergänztem Simplex-Optimierungsmedium, das mit flüssigem Paraffin bedeckt ist. Dann inkubieren Sie die Embryonen in frischem Kalium ergänzt simplex Optimierungsmedium im Zellkultur-Inkubator über Nacht.

Die Verwendung dieser modifizierten Kryokonservierungsmethode für Einzell-Embryonen verbessert die Entwicklungsrate der gefriertauten Embryonen in das Zweizellstadium. Mit dieser Methode waren alle erzeugten Mäuse in diesem repräsentativen Experiment Albino mit nur einer Mosaikmaus, die einen Mantel mit weißen und schwarzen Flecken trug. Hier kann ein repräsentativer Abschnitt eines Chromatogramms einer Albinomaus beobachtet werden, die das M1-Allel enthält.

Wie dargestellt, kann das Protokoll Knockout- und Knock-in-Mäuse mit hoher Effizienz und niedrigen Mosaikraten erzeugen. Tatsächlich sind die F1-Nachkommen der homozygoten F0-Nachkommen heterozygot und enthalten ein mutiertes und ein wildes Allel ohne disparate Mutationen. Denken Sie daran, dass das befruchtete Ei im Einzellstadium zerbrechlich ist.

Die Zugabe von fetalem Rinderserum verstärkt den Embryo. Es muss jedoch bei jedem Schritt sorgfältig behandelt werden. Diese Methode kann zur Analyse der Genfunktion und der Erforschung menschlicher Krankheiten beitragen, indem sie eine schnellere und effizientere Produktion genetisch veränderter Mäuse ermöglicht.