Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)

Dieses Verfahren ermöglicht es Mückenforschern, die reproduktive Fitness ihrer Mücken auf individueller Ebene leicht anzugehen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden reduziert dieses Protokoll den Zeit-, Raum- und Arbeitsaufwand für die Prüfung der Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit von Mücken auf individueller Ebene erheblich. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Platten für das Eileiterexperiment.

Mit einem Haushaltsbohrer mit 1,6 Millimetern bohren Sie vier bis sechs Löcher pro Bohrloch in den Deckel einer 24-Well-Kulturplatte. Einen Tag vor dem Experiment die Teller waschen und abspülen und 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur in 1% bis 5% Bleichmittel einweichen. Dann spülen Sie die Platten gründlich unter laufenden entionisiertem Wasser und trocknen Sie sie.

2%Agarose in entionisiertem Wasser schmelzen und sofort 500 Mikroliter der geschmolzenen Agarose in jeden Brunnen einer 24-Well-Platte geben. Lassen Sie die Platten über Nacht auf der Laborbank, um jegliche Kondensation auszutrocknen. Entfernen Sie mindestens 16 Stunden vor der Blutfütterung jede Wasser- oder Zuckerquelle von den weiblichen Mücken.

Am Tag der Fütterung einen Wasserzirkulator auf 37 Grad Celsius erhitzen und die Mücken 15 bis 30 Minuten lang mit Wirbeltierblut füttern. Dann übertragen Sie die Mücken auf eine Glasschale auf Eis. Wählen Sie die, die mit Blut engorged sind und legen Sie sie in einen Behälter mit 30%Saccharosewasser.

Erlauben Sie den Weibchen mindestens 72 Stunden, um die Ausscheidung und Die Eientwicklung zu beenden. Etwa eine Stunde vor der Übertragung von Mücken auf die 24-Well-Platte, verwenden Sie eine Transferpipette, um zwei bis drei Tropfen Wasser in jeden Brunnen hinzuzufügen. Mücken mit Kohlendioxid abstoßen und auf Eis in eine Glasschale geben.

Dann legen Sie jede Mücke einzeln auf einen invertierten Deckel der 24-Well-Platte. Sobald alle 24 Mücken platziert sind, bedecken Sie den Deckel mit einem invertierten Plattenboden, sichern Sie ihn mit einem frischen neuen Gummiband und legen Sie ihn in eine Umweltkammer, bis sich die Mücken erholen. Drehen Sie dann die Platte nach rechts nach oben.

Lassen Sie die weiblichen Mücken oviposit für 24 bis 48 Stunden. Entfernen Sie dann die Weibchen, indem Sie sie von den Platten in einen großen Käfig freisetzen. Vor dem Zählen der Eier, überprüfen Sie jeden Brunnen auf Eier, die an den Brunnenwänden und am Rand der Agarose und Kunststoffoberfläche sind, wo sie schwer in Fotografien zu lösen sind.

Verwenden Sie einen nassen Pinsel, um diese Eier auf die flache Oberfläche zu bewegen, so dass alle Eier in einer einheitlichen Ebene sind und sich nicht überlappen. Verwenden Sie Zangen, um alle gebrochenen Beine, Flügel und andere Partikel in den Brunnen zu entfernen, die mit bildgebenden Eiern stören können. Stellen Sie eine kompakte Digitalkamera im Mikroskopmodus ein, die es dem Benutzer ermöglicht, sich auf Objekte zu konzentrieren, die bis zu einem Zentimeter nahe sind, und ein Bild von jedem Brunnen zu machen.

Nachdem Sie jeden Brunnen einer Platte fotografiert haben, nehmen Sie ein Bild der gesamten Platte auf. Verwenden Sie ein bildgebendes Auftragsetikett, um die einzelnen Platten später zu unterscheiden. Fügen Sie etwa fünf Tropfen Wasser zu jedem Brunnen hinzu, um zu verhindern, dass der Agarose-Stecker und die Eier trocknen und um die Entwicklung und das Schlüpfen von Embryonen zu induzieren.

Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer und benennen Sie die Dateien mit der Platte und gut IDs für eine einfachere Organisation um. Öffnen Sie die Bilder mit ImageJ und verwenden Sie das Multi-Point-Tool, um jedes Ei zu markieren, ein- oder auszuzoomen, um die Eierklumpen zu zählen. Nachdem Sie alle Eier markiert haben, doppelklicken Sie auf das Symbol mit mehreren Punkten, um die Anzahl der Markierungen anzuzeigen und die Ergebnisse in einer Kalkulationstabelle aufzuzeichnen.

Beginnen Sie, Lebensmittel zu den Brunnen hinzuzufügen, die geschlüpfte Larven enthalten, sobald sie erscheinen. Etwa fünf bis acht Tage später die Larven befeuchten, indem sie die Platte 15 bis 20 Minuten lang mit zerkleinertem Eis bedecken. Legen Sie ein schwarzes Material unter die Platte, um den Kontrast zu verbessern und Bilder von jedem Brunnen zu machen, während die Platten auf Eis gehalten werden.

Nachdem Sie jeden Brunnen fotografiert haben, nehmen Sie ein Bild der gesamten Platte mit einem bildgebenden Auftragsetikett auf. Öffnen Sie Bilder mit ImageJ und verwenden Sie das Multi-Point-Tool, um die Larven zu zählen. Larven können in Form, Winkel und Fokus variieren.

Schließen Sie die Schuppen-Kineken aus, die wie kopfgebundene Larven mit etwas Körper aussehen, oder geschrumpfte Larven. Zeichnen Sie die Ergebnisse in der Kalkulationstabelle auf. Mücken wurden mit doppelsträngiger RNA injiziert, die auf einen Kandidaten-Eisentransporter, FeT, oder ein Kontrollgen, EGFP, abzielte.

Dann wurden sie blutgefüttert und mit der Eagle-Platte-Methode auf Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeitsleistung gemessen. Mücken, bei denen der Ausdruck des Eisentransporters zum Schweigen gebracht wurde, zeigten eine signifikante Verringerung sowohl der Eizahl als auch der Brutrate. FeT-stumme Mücken zeigten auch verzögerte Ausscheidung und kleine und helle Eier.

Gute Bilder zu machen ist ein wichtiger Schritt für diese Methode, da die Qualität der Bilder und die Quantität der einzelnen Eier oder Larven direkt die Qualität der Ergebnisse beeinflussen.