Name: Skelett-Phänotyp-Analyse eines bedingten Stat3-Löschmausmodells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Skelettphänotypen in einem bedingten Stat3-Löschmausmodell mittels TRAP-Färbung, Mikro-CT und histologischer Techniken. Diese Methoden zeigen, wie Stat3-Defizienz die Osteoklastendifferenzierung beeinflusst.

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Wir danken Prof. Weiguo Zou und S. Kato für Reagenzien und Mäuse und den Mitgliedern des Zou-Labors für nützliche Gespräche. Wir danken auch dem Labor für Digitalisierte Stomatologie und dem Forschungszentrum für Craniofacial Anomalien des Shanghai Ninth People es Hospital für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949] unterstützt. Shanghai Summit & Plateau Disciplines, der SHIPM-mu Fonds des Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], das Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine , der crossdisziplinäre Forschungsfonds des Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai JiaoTong university School of Medicine [JYJC201902]. Und L.J. ist Ein Gelehrter des Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program und des Projekts "Chen Xing" der Shanghai Jiaotong University.

Alle hier beschriebenen Methoden zu den hier beschriebenen Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Shanghai Jiaotong University School of Medicine genehmigt.
1. Züchtung von Osteoklast-spezifischen Stat3-Löschmäusen
HINWEIS: Stat3fl/fl Mäuse wurden kommerziell gewonnen. Ctsk-Cre Mäuse wurden von S. Kato (Universität Tokio, Tokio, Japan12) zur Verfügung gestellt. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der institutionellen Tieranlage unter standardisierten Bedingungen gezüchtet und gepflegt.
<ol><li>Paarn Sie eine geschlechtsreife männliche Maus mit zwei gleichaltrigen weiblichen Mäusen. Nach 18 Tagen, überprüfen Sie täglich Kontrollen für Neugeborene. Trennen Sie die schwangeren weiblichen Mäuse und halten Sie sie bei Bedarf allein. Ändern Sie männliche Mäuse zwischen verschiedenen Zuchtkäfigen, wenn die weiblichen Mäuse nicht innerhalb von 1 Monat nach der Paarung schwanger waren.</li>
	<li>Kreuz Stat3fl/fl Mäuse zu Ctsk-Cre Mäusen (F0). Clip die Schwänze für genotypisieren und halten Sie die männlichen Stat3fl /+; Ctsk-Cre Mäuse, bis sie geschlechtsreif sind, was etwa 6 Wochen alt ist (F1). Verwenden Sie die folgenden Primer: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Kreuz 6-Wochen-alte männliche Stat3fl /+;; Ctsk-Cre-Mäuse mit weiblichen Stat3fl/fl Mäusen. Clip die Schwänze für genotyping und halten Sie die männlichen Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre Mäuse, bis sie geschlechtsreif sind, was etwa 6 Wochen alt ist (F2).</li>
	<li>Kreuz 6-Wochen-alte männliche Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre-Mäuse mit weiblichen Stat3fl/fl Mäusen (F3). Schneiden Sie die Schwänze für die Genotypisierung ab und ersetzen Sie die alten Zuchtmäuse rechtzeitig durch jüngere Mäuse (F3+N).</li>
</ol>2. Probensammlung
<ol><li>Euthanisieren Sie sechs Paare von 8 Wochen alten männlichen Stat3fl/fl und Stat3Ctsk Littermate Mäuse getrennt mit Kohlendioxid-Erstickung. HINWEIS: DerCO2-Durchfluss verschiebt 30 % des Käfigvolumens pro Minute (z. B. für 45 cm x 30 cm x 30 cm Käfig beträgt derCO2-Durchfluss 40 L/min).</li>
	<li>Setzen Sie die Mäuse in eine Supine-Position. Dislozieren Sie die bilateralen Hüftgelenke sanft von Hand. Verwenden Sie eine augenheilbe, um die Haut vertikal von der distalen Tibia abzuschneiden und dann die gesamte Haut von der Hintergliedse zu sezieren.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gelenkband des rechten Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere ab, um die Hinterbeine zu trennen. Schneiden Sie den Trochanter und die Kreuzung der Fibel und tauchen Sie dann die hintere Gliedmaße in 4% Paraformaldehyd ein. Halten Sie die rechten Hinterbeine für Schritt 3. Schneiden Sie den Knochen an beiden Enden angemessen ab, um vollständig einzutauchen und das Knochenmark mit 4% Paraformaldehyd zu fixieren.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gelenkband des linken Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere, entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe und trennen Sie die Tibia und den Oberschenkelknochen vorsichtig. Tibia und Oberschenkelknochen getrennt in 75% Ethanol eintauchen. Halten Sie die Femora für Schritt 4 und Tibiafür Schritt 6. Achten Sie darauf, den Trochanter intakt zu halten.</li>
</ol>3. Paraffin-Sektionsvorbereitung
<ol><li>Fixieren Sie die rechte Hintergliedmaße in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 48 h.</li>
	<li>Entkalkung: Waschen Sie die Proben mit 1x PBS 10 min 3 mal. Entkalkung der Proben in 15% EDTA (150 g EDTA in 800 ml ddH2O und 100 ml 10x PBS) mit einem Ultraschallentkalkungsmittel für 3 bis 4 Wochen, bis die Knochen gebogen werden können. Ersetzen Sie es jeden zweiten Tag durch frische entkalkende Flüssigkeit.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben 3x mit 1x PBS vorsichtig und tauchen Sie sie dann über Nacht bei 4 °C in 75% Ethanol ein.</li>
	<li>Dehydrieren: Am zweiten Tag tauchen Die Proben sequenziell in 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol, jeweils für 1 h zweimal.</li>
	<li>Eintauchen von Proben in 1/2 Xylol 1/2 Paraffin für 30 min. Tauchen Sie die Proben über Nacht bei 65 °C in Paraffin ein.</li>
	<li>Einbetten: Wählen Sie einen geeigneten Einbettungsbehälter zum Einbetten aus. Legen Sie die Tibia gleichmäßig darunter. Legen Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia in einem Winkel von 90°. Nachdem das Paraffin vollständig abgekühlt und verfestigt ist, entfernen Sie es aus dem Einbettbehälter. Nummerieren Sie die Proben und lagern Sie sie bei -20 °C über Nacht.</li>
	<li>Schneiden Sie mit dem Mikrotome die 5 m dicken Abschnitte kontinuierlich ab. Schneiden Sie 20–40 Abschnitte. Die Abschnitte auf 37 °C Wasser verteilen, an Mikroskopschlitten kleben und über Nacht bei 42 °C backen.</li>
</ol>4. Micro-CT-Scannen und -Analyse
<ol><li>Scannen Sie die linke Femora mit einem Mikro-CT-Scanner. Auflösung: 10 m; Spannung: 70 kV; Strom: 114 A; Fliter: 0,5 mm Al; Rotationsschritt: 0,5°.</li>
	<li>Rekonstruieren Sie 3D-Bilder des kortikalen Knochens und des Trabeekularknochens mithilfe der unterstützenden Software des Scanners, die der Anweisung des Herstellers folgt. ROIs sind in einer Gesamtbreite von 1 mm Trabecularknochen in der Nähe der distalen Wachstumsplatte und in einem insgesamt 1 mm breiten Abschnitt des kortikalen Knochens in der Mitte der Femora.</li>
	<li>Berechnen Sie die quantitativen Mikroarchitekturparameter: Knochenmineraldichte (BMD), Knochenvolumenfraktion (BV/TV), trabekuläre Dicke (Tb.Th.), Trabeekularzahl (Tb.N.), Trabeekulartrennung (Tb.Sp.) und kortikale Knochendicke (Ct.Th.).</li>
</ol>5. TRAP Färbung
<ol><li>Die Paraffinabschnitte bei 65 °C 30 min backen.</li>
	<li>Dewax: Tauchen Sie die Abschnitte in Xylol für 10 min ein. Führen Sie diesen Schritt 3x mit frischem Xylol aus.</li>
	<li>Rehydratisieren: Tauchen Sie die Abschnitte sequenziell in 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und ddH2O ein, jeweils für 5 min zweimal.</li>
	<li>Bereiten Sie die Färbelösung mit dem TRAP-Färbeset nach den Anweisungen des Herstellers vor und erwärmen Sie sich auf 37 °C. HINWEIS: Trap-Färbungslösung sollte unmittelbar vor jedem Test frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Fügen Sie jeder Probe eine Färbelösung von 50 –100 °L hinzu und in einer 37 °C feuchten Kammer für 20–30 min. Überprüfen Sie alle 5 min den Färbestatus der Osteoklasten unter einem Lichtmikroskop, bis rote mehrkernige Osteoklasten zu sehen sind. Beenden Sie die Reaktion mit ddH2O.</li>
	<li>Gegenfleck in Hämatoxylinlösung für 30 s. Erstellen Sie eine stabile blaue Farbe durch Eintauchen in 1% Ammoniaklösung für 1 min. In langsam fließendem Leitungswasser abspülen.</li>
	<li>Montieren Sie die Abschnitte mit Deckellipsen mit neutralem Balsam und trocknen Sie sie über Nacht.</li>
	<li>Erfassen Sie 3–5 Interessenfelder mit einem Mikroskop. Analysieren Sie den trabekulären Umfang nach Bild J: Messen Sie die Länge des Maßstabsbalkens (Ls) mit dem Werkzeug 'gerade Linie' als L1, und messen Sie dann die Länge des trabekulären Umfangs mit dem Werkzeug 'Segmentlinie' als L2, die physikalische Länge (Lp)= Ls*L2 /L1). Zählen Sie die Anzahl der TRAP-positiven Zellen mit mehr als drei Kernen.</li>
</ol>6. Calcein und Alizarin rot Doppelbeschriftung
<ol><li>Probenzubereitung: Intraperitoneal injizieren 20 mg/kg Calcein (1 mg/ml in 2% NaHCO3 Lösung) am Tag 0 und 25 mg/kg Alizarin rot S (AL, 2 mg/ml in H2O) am 4. Tag. Opfern Sie Mäuse an Tag 7. Die Tibia emittieren vorsichtig und fixieren Sie 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 48 h.</li>
	<li>Dehydrieren: Nach der Fixierung die Tibiae 3x vorsichtig mit 1x PBS waschen. Die Proben sukzessive in 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol für 5 min zweimal getrennt eintauchen.</li>
	<li>Die Proben in Aceton für 12 h, in 1/2 Aceton 1/2 Harz für 2 h und in ReinemHarz in einem Trockenofen über Nacht eintauchen. HINWEIS: Das Harz wurde aus handelsüblichem Harz (z. B. Embed 812 Resin) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.</li>
	<li>Einbetten: Fügen Sie reines Harz in einen geeigneten Kieselgel-Einbettungstank ein und legen Sie die Proben vorsichtig auf, um Blasen zu vermeiden. Polymerisieren Sie das Harz in einem Trockenofen bei 60 °C für 48 h.</li>
	<li>Schneiden Sie die Proben mit einem rotierenden Mikrotom kontinuierlich in 5 m dicke Abschnitte. Den Rest der Proben mit Desiccant bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Halten Sie die Abschnitte mit Pinzette in einem Tropfen von 75% Alkohol. Montieren Sie die Abschnitte mit Abdeckungen mit neutralem Balsam. Erfassen Sie die rote und grüne Fluoreszenzbeschriftung mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Messen Sie die Breite zwischen zwei Beschriftungslinien (Ir.L.Wi), einbeschrifteten trabekulären Umfang (sL.Pm), doppelbeschrifteten trabekulären Umfang (dL.Pm) und dem gesamten trabekulären Umfang (Tb.Pm). Berechnen Sie die Mineralappositionsrate (MAR) und die Knochenbildungsrate (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/Intervalltage. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

<ol><li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+remodeling+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
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<li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li>
<li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Genetisch entwickelte Mausmodelle werden häufig für die Untersuchung des Mechanismus und der pharmazeutischen Behandlung menschlicher Krankheiten verwendet13. Ctsk-Cre Mäuse wurden weit verbreitet für funktionelle Studien von Osteoklasten6verwendet. Die vorliegende Studie beschrieb die Protokolle der Methoden zur Analyse des Skelettphänotyps und zur Untersuchung der kritischen Gene, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern.
Histologis...

Skelettknochen ist das Haupttragende Organ des menschlichen Körpers und steht unter Druck sowohl der inneren als auch der äußeren Umgebung während des Gehens und der Übung1. Das ganze Leben über gehen die Knochen kontinuierlich durch Selbsterneuerung, die durch Osteoblasten und Osteoklasten ausgeglichen wird. Der Prozess der Osteoklasten, die alte Knochen und Osteoblasten, die neue Knochen bilden, beseitigt, behält die Homöostase und mechanische Funktion des Skelettsystems2. Störungen im Gleichgewicht können Knochenstoffwechselerkrankungen wie Osteoporose auslösen. Osteoporose, die durch übermäßige osteoklastische Aktivität verursacht wird, ist weltweit verbreitet und verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste für die Gesellschaft2,3,4. Nach der begrenzten Anzahl von Medikamenten für osteoporose Behandlung und ihr Risiko von Nebenwirkungen4, Ist es wichtig, die Details der Osteoklastbildung und Aktivität zu enthüllen.
Osteoklasten, die aus der hämatopoetischen Abstammung monozyt/makrophage abgeleitet sind, haben mehrere Kerne (können 2 bis 50 Kerne haben) und sind groß (in der Regel größer als 100 m im Durchmesser)2. Obwohl die Erforschung von Mechanismen und das Screening von Medikamenten auf osteoklastische Störungen durch in vitro Osteoklastkultur weitgehend verbessert wurden, machen die komplizierten organischen Reaktionen in vivo Beweise für die zielgerichtete Therapie unverzichtbar. Aufgrund genetischer und pathophysiologischer Ähnlichkeiten zwischen Mäusen und Menschen werden gentechnisch veränderte Mausmodelle häufig zur Untersuchung der Mechanismen und der pharmazeutischen Behandlung menschlicher Krankheiten in vivo6verwendet. Das Cre-loxP-System ist eine weit verbreitete Technologie zur Mausgenbearbeitung und hat es Forschern ermöglicht, Genfunktionen gewebe-/zellspezifisch zu untersuchen5. Cathepsin K (CSTK) ist eine Cystein-Protease, die von Osteoklasten abgesondert wird, die Knochenkollagenabbauenkönnen 8 . Es ist allgemein anerkannt, dass CTSK selektiv in reifen Osteoklasten exprimiert wird; Daher gelten Ctsk-Cre-Mäuse als nützliches Werkzeug für funktionelle Studien von Osteoklasten und wurden6verwendet.
Der Signalgeber und Aktivator der Transkriptionsfamilie (STAT) ist klassisch und sehr signifikant in der Immunität und Krebsprogression und -entwicklung7,8. Unter sieben STATs ist STAT3 als die relevanteste für die Knochenhomöostase9,10. Mehrere In-vivo-Studien haben berichtet, dass die spezifische Inaktivierung von STAT3 bei Osteoblasten die Knochenbildungverringert 9,10. Dennoch sind solide Beweise für die Beteiligung von STAT3 an der Osteoklastbildung und am Knochenstoffwechsel in vivo nach wie vor begrenzt. Kürzlich haben wir in vivo-Beweise mit einem osteoklastspezifischen Stat3-Löschmausmodell (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, im Folgenden Stat3Ctskgenannt,dass STAT3 an der Osteoklastdifferenzierung und dem Knochenstoffwechsel11beteiligt ist. In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Methoden und Protokolle, mit denen wir die Veränderungen der Knochenmasse, der Knochenhistomorphologie und des Knochenanabolismus und katabolismus der Stat3Ctsk-Mäuse analysiert haben, um den Einfluss der osteoklastspezifischen STAT3-Deletion auf die Knochenhomöostase zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyd-Lösung</td><td>Verifizierter Lieferant - Sangon Biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E672002</tr><tr><td>Aceton</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>80000360</tr><tr><td>Alizarin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniaklösung</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875<</td><td></td></tr><tr><td>em>Ctsk-Cre Mäuse</td><td></td><td></td><td>ein Geschenk von S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>DeCa Schnellentkalker</td><td>Pro-Cure</td><td>DX1100</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Verifizierter Lieferant - EDTA Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 RESIN</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylinlösung</td><td>Beyotime Biotechanology</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Scanco Medical AG</td><td>&mu; CT 80</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Shanghai Experimentelles Reagenz Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10018918</tr><tr><td>Neutraler Balsam</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E675007</tr><tr><td>NMA</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A601889</tr><tr><td>Rotationsmikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Stat3fl/fl Mäuse</td><td>GemPharmatech Co., Ltd</td><td>D000527</td><td></td></tr><tr><td>TRAP Färbekit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>Artikel-Nr.: 1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

skelett-phänotyp-analyse eines bedingten stat3-löschmausmodells

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Transgene Mausmodelle sind mächtig für das Verständnis der kritischen Gene, die osteoklastische Differenzierung und Aktivität steuern, und für das Studium von Mechanismen und pharmazeutischen Behandlungen von Osteoporose. Cathepsin K (Ctsk)-Cre Mäuse wurden weit verbreitet für funktionelle Studien von Osteoklasten verwendet. Der Signalgeber und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) ist bei der Knochenhomöostase relevant, aber seine Rolle bei Osteoklasten in vivo bleibt schlecht definiert. Um den in vivo-Beweis dafür zu liefern, dass STAT3 an der Osteoklastdifferenzierung und dem Knochenstoffwechsel beteiligt ist, haben wir ein osteoklastspezifisches Stat3-Löschmausmodell (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) und analysierte seinen Skelett-Phänotyp. Mikro-CT-Scanning und 3D-Rekonstruktion implizierten eine erhöhte Knochenmasse in den bedingten Knockout-Mäusen. H&E-Färbung, Calcein und Alizarin rote Doppelfärbung, und tartrate-resistente Säurephosphatase (TRAP) Färbung wurden durchgeführt, um Knochenstoffwechsel zu erkennen. Kurz gesagt, beschreibt dieses Protokoll einige kanonische Methoden und Techniken zur Analyse des Skelettphäpnotyps und zur Untersuchung der kritischen Gene, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern.

Mit Hilfe des vorliegenden Protokolls wurden osteoklastspezifische Stat3-Deletionsmäuse generiert, um den Einfluss der STAT3-Deletion auf die Osteoklastdifferenzierung zu untersuchen. Stat3Ctsk Mäuse und ihre Wildtyp (WT) Littermates wurden gezüchtet und nach Genotypisierung gehalten. Knochenmarkmakrophagen wurden isoliert und zu Osteoklasten kultiviert, und stat3-Deletion bei Stat3Ctsk-Mäusen wurde nachgewiesen (Abbildung 1)...

Dieses Protokoll beschreibt eine kanonische Methode, um die kritischen Gene zu verstehen, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern. Diese Methode verwendet ein transgenes Mausmodell und einige kanonische Techniken, um Skelett-Phänotyp zu analysieren.

Skelett-Phänotyp-Analyse eines bedingten Stat3-Löschmausmodells

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind leistungsfähige Werkzeuge, um die Mechanismen menschlicher Krankheiten in vivo zu untersuchen. Die Analyse des Skelettphänotyps von Mäusen ist die Grundlage der Skelettforschung. Dieses Partikel beschreibt einige typische Techniken zur Analyse des Skelettphänotyps, die für diejenigen interessant sein können, die neu in der Skelettgewebeforschung sind.Wenn Sie dieses Teilchen versuchen, denken Sie daran, dass Tierversuche Zeit brauchen, also sammeln Sie bei jedem Experiment so viele qualitativ hochwertige Proben wie möglich, auch wenn Sie sie kurzfristig nicht benötigen. Beginnen Sie damit, eine eingeschläferte Maus in Rückenlage zu bringen und die beidseitigen Hüftgelenke vorsichtig mit der Hand auszurenken. Schneiden Sie mit einer Augenschere die Haut vertikal von der distalen Tibia ab und entfernen Sie dann die gesamte Haut von der hinteren Extremität.Schneiden Sie das Gelenkband des rechten Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere ab, um die hintere Extremität zu trennen. Schneiden Sie dann den Knochen an beiden Enden ab, um den Knochen vollständig in 4%PFA einzutauchen. Schneide den Trochanter und den Übergang der Fibula ab.Tauchen Sie die hintere Gliedmaße in 4 % PFA und behalten Sie die rechte hintere Gliedmaße für die Paraffinschnitte bei. Schneiden Sie die Gelenkbänder der linken Hüfte und des Kniegelenks mit einer Schere ab und entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe. Trennen Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen und tauchen Sie sie separat in 75%iges Ethanol.Bewahren Sie die Oberschenkelknochen für die Mikro-CT-Untersuchung und die Tibien für die doppelte Markierung von Calcein und Alizarin rot auf. Um die Paraffinabschnitte vorzubereiten, waschen Sie die fixierte rechte Hintergliedmaße dreimal vorsichtig mit PBS für 10 Minuten pro Waschgang. Entkalken Sie es dann drei bis vier Wochen lang in 15% EDTA mit einem Ultraschall-Entkalker, bis die Knochen gebogen werden können, und ersetzen Sie die Entkalkungsflüssigkeit jeden zweiten Tag.Waschen Sie die Proben nach der Entkalkung dreimal mit PBS und tauchen Sie sie über Nacht in 75%Ethanol bei vier Grad Celsius. Tauchen Sie die Proben am zweiten Tag nacheinander jeweils eine Stunde lang in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol. Tauchen Sie die Proben 30 Minuten lang zur Hälfte in Xylol und zur Hälfte in Paraffin, dann über Nacht in Paraffin bei 65 Grad Celsius.Um die Probe einzubetten, tauchen Sie sie in Paraffin und platzieren Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein in einem 90-Grad-Winkel. Wenn das Paraffin vollständig abgekühlt ist, nehmen Sie die Proben aus dem Einbettbehälter. Nummerieren Sie sie und lagern Sie sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.Die Paraffinabschnitte 30 Minuten bei 65 Grad Celsius backen und dann entwachsen, indem man sie 10 Minuten lang in Xylol taucht. Tauchen Sie die Abschnitte jedes Mal dreimal mit frischem Xylol. Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie nacheinander fünf Minuten lang in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertes Wasser tauchen.Bereiten Sie die Färbelösung mit dem Färbeset TRAP vor und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius. Geben Sie 50 bis 100 Mikroliter Färbelösung in jede Sektion und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten lang in einer 37 Grad Celsius feuchten Kammer. Kontrollieren Sie alle fünf Minuten den Färbestatus der Osteoklasten unter einem Lichtmikroskop, bis rote mehrkernige Osteoklasten zu sehen sind.Beenden Sie dann die Reaktion mit Wasser. Färben Sie die Abschnitte 30 Sekunden lang in Hämatoxylinlösung und erzeugen Sie eine stabile blaue Farbe, indem Sie sie eine Minute lang in 1%ige Ammoniaklösung tauchen. Spülen Sie sie dann in langsam fließendem Leitungswasser ab.Montieren Sie die Abschnitte mit Deckgläsern mit neutralem Balsam und trocknen Sie sie über Nacht. Erfassen Sie drei bis fünf Sichtfelder mit einem Mikroskop und analysieren Sie den trabekulären Umfang mit Bild J.Verwenden Sie das Werkzeug für gerade Linien, um die Länge der Maßstabsleiste als L1 zu messen. Verwenden Sie dann das Werkzeug für segmentierte Linien, um die Länge des Trabekelumfangs als L2 zu messen. Berechnen Sie die physikalische Länge und zählen Sie die Anzahl der TRAP-positiven Zellen mit mehr als drei Kernen. Waschen Sie die Tibien nach der Fixierung dreimal vorsichtig mit PBS und tauchen Sie die Proben nacheinander jeweils fünf Minuten lang in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol.Tauchen Sie die Proben 12 Stunden lang in Aceton und zwei Stunden lang zur Hälfte in Aceton und zur Hälfte in Harz und über Nacht in einem Trockenofen in reines Harz. Geben Sie reines Harz in einen geeigneten Kieselgel-Einbetttank und legen Sie die Proben in den Tank, um Blasen zu vermeiden. Polymerisieren Sie das Harz in einem Trockenschrank bei 60 Grad Celsius für 48 Stunden.Schneiden Sie die Proben kontinuierlich mit einem rotierenden Mikrotom in fünf Mikrometer dicke Abschnitte und lagern Sie den Rest der Proben mit Trockenmittel bei Raumtemperatur. Kleben Sie die Abschnitte mit einer Pinzette in einen Tropfen 75%Ethanol und befestigen Sie sie mit Deckgläsern mit neutralem Balsam. Erfassen Sie die rote und grüne Fluoreszenzmarkierung mit einem Fluoreszenzmikroskop.Osteoklasten-spezifische Stat3-Deletionsmäuse wurden generiert, um den Einfluss der Stat3-Deletion auf die Osteoklastendifferenzierung zu untersuchen. Die Femurrekonstruktion und die quantitative Analyse mittels Mikro-CT zeigten, dass die Knochenmasse der Stat3 Ctsk-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen erhöht war. Die Histomorphologie der Femora von Wildtyp- und Stat3 Ctsk-Mäusen wurde mittels H- und E-Färbung untersucht.Die osteoklastogene Aktivität wurde mittels TRAP-Färbung nachgewiesen. Osteoklasten sind große TRAP-positive Zellen mit mehreren Zellkernen. Die Anzahl der TRAP-positiven Osteoklasten war bei Stat3-Ctsk-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen geringer, was darauf hindeutet, dass ein Stat3-Mangel die Osteoklastenbildung beeinträchtigte.Die Osteogenese wurde mit Calcein und Alizarinrot Doppelmarkierung gemessen. Der Bereich zwischen dem Calcein und der Alizarin-Rotfluoreszenz stellt den neu gebildeten Knochen dar. Das deletierte Stat3 in Osteoklasten hatte keinen Einfluss auf den Knochenanabolismus.Sagittale Paraffinschnitte, bei denen der Knorpel später symmetrisch war und die zeigten, dass hier eine klare M-förmige Linie verwendet wurde. Für die Studien werden wir weitere Merkmale des Skelettsystems einbeziehen, wie z. B. mechanische Eigenschaften.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

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Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

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Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erkennung und Quantifizierung des Proteinspiegels während der craniofacialmorphogenese/pathogenese durch Immunfärbung anhand von Maus-Craniofacial-Geweben als Beispiele vor. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Herstellung und Kryosektion von nicht verkalkten harten Geweben von jungen Mäusen zur Immunfärbung.

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Die Footprint-Analyse ist eine kostengünstige Alternative zu digitalisierten Ganganalyseprogrammen für Forscher, die Bewegungsanomalien bei Mäusen quantifizieren. Aufgrund seiner Geschwindigkeit, Einfachheit und Längspotenzial, Es ist ideal für Verhaltens-Phänotypisierung von Mausmodellen.

Low-Cost Gait Analyse für Verhaltens-Phänotypisierung von Maus-Modellen von neuromuskulären Erkrankungen

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Hier beschreiben wir Berechnungswerkzeuge und -methoden, die die Visualisierung und Analyse von drei- und vierdimensionalen Bilddaten von Mausembryonen im Rahmen der axialen Dehnung und Segmentierung ermöglichen, die durch optische In-toto-Projektionstomographie und durch Live-Bildgebung und Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung mittels Multiphotonenmikroskopie erhalten werden.

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Diese Studie stellt ein Protokoll für die Verwendung von induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Untersuchung des Knochenumbaus unter kieferorthopädischer Kraft zur Verfügung und beschreibt Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während kieferorthopädischer Zahnbewegungen, wodurch ein Licht auf die mechanische Biologie des Skeletts geworfen wird.

Verwendung von induzierbaren osteoblastischen Abstammungs-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Untersuchung des Alveolarknochenumbaus während kieferorthopädischer Zahnbewegung

Hier beschreiben wir ausführlich eine Methode, die auf Mikrocomputertomographie basiert, um 3D-Modelle von kraniomaxillofazialen Knochen bei Mäusen zu segmentieren und zu vermessen, um die Entwicklung des kraniomaxillofazialen Knochens bei Mäusen besser beurteilen zu können, als dies mit aktuellen Methoden möglich ist.

Analyse von kraniomaxillofazialen Fehlbildungen bei Mäusen mittels dreidimensionaler Mikrocomputertomographie

Erfahren Sie die Analyse von Skelettphänotypen in einem bedingten Stat3-Löschmausmodell mittels TRAP-Färbung, Mikro-CT und histologischer Techniken. Diese Methoden zeigen, wie Stat3-Defizienz die Osteoklastendifferenzierung beeinflusst.

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