Skelett-Phänotyp-Analyse eines bedingten Stat3-Löschmausmodells
July 3rd, 2020
Dieses Protokoll beschreibt eine kanonische Methode, um die kritischen Gene zu verstehen, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern. Diese Methode verwendet ein transgenes Mausmodell und einige kanonische Techniken, um Skelett-Phänotyp zu analysieren.
Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind leistungsfähige Werkzeuge, um die Mechanismen menschlicher Krankheiten in vivo zu untersuchen. Die Analyse des Skelettphänotyps von Mäusen ist die Grundlage der Skelettforschung. Dieses Partikel beschreibt einige typische Techniken zur Analyse des Skelettphänotyps, die für diejenigen interessant sein können, die neu in der Skelettgewebeforschung sind.
Wenn Sie dieses Teilchen versuchen, denken Sie daran, dass Tierversuche Zeit brauchen, also sammeln Sie bei jedem Experiment so viele qualitativ hochwertige Proben wie möglich, auch wenn Sie sie kurzfristig nicht benötigen. Beginnen Sie damit, eine eingeschläferte Maus in Rückenlage zu bringen und die beidseitigen Hüftgelenke vorsichtig mit der Hand auszurenken. Schneiden Sie mit einer Augenschere die Haut vertikal von der distalen Tibia ab und entfernen Sie dann die gesamte Haut von der hinteren Extremität.
Schneiden Sie das Gelenkband des rechten Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere ab, um die hintere Extremität zu trennen. Schneiden Sie dann den Knochen an beiden Enden ab, um den Knochen vollständig in 4%PFA einzutauchen. Schneide den Trochanter und den Übergang der Fibula ab.
Tauchen Sie die hintere Gliedmaße in 4 % PFA und behalten Sie die rechte hintere Gliedmaße für die Paraffinschnitte bei. Schneiden Sie die Gelenkbänder der linken Hüfte und des Kniegelenks mit einer Schere ab und entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe. Trennen Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen und tauchen Sie sie separat in 75%iges Ethanol.
Bewahren Sie die Oberschenkelknochen für die Mikro-CT-Untersuchung und die Tibien für die doppelte Markierung von Calcein und Alizarin rot auf. Um die Paraffinabschnitte vorzubereiten, waschen Sie die fixierte rechte Hintergliedmaße dreimal vorsichtig mit PBS für 10 Minuten pro Waschgang. Entkalken Sie es dann drei bis vier Wochen lang in 15% EDTA mit einem Ultraschall-Entkalker, bis die Knochen gebogen werden können, und ersetzen Sie die Entkalkungsflüssigkeit jeden zweiten Tag.
Waschen Sie die Proben nach der Entkalkung dreimal mit PBS und tauchen Sie sie über Nacht in 75%Ethanol bei vier Grad Celsius. Tauchen Sie die Proben am zweiten Tag nacheinander jeweils eine Stunde lang in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol. Tauchen Sie die Proben 30 Minuten lang zur Hälfte in Xylol und zur Hälfte in Paraffin, dann über Nacht in Paraffin bei 65 Grad Celsius.
Um die Probe einzubetten, tauchen Sie sie in Paraffin und platzieren Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein in einem 90-Grad-Winkel. Wenn das Paraffin vollständig abgekühlt ist, nehmen Sie die Proben aus dem Einbettbehälter. Nummerieren Sie sie und lagern Sie sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.
Die Paraffinabschnitte 30 Minuten bei 65 Grad Celsius backen und dann entwachsen, indem man sie 10 Minuten lang in Xylol taucht. Tauchen Sie die Abschnitte jedes Mal dreimal mit frischem Xylol. Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie nacheinander fünf Minuten lang in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertes Wasser tauchen.
Bereiten Sie die Färbelösung mit dem Färbeset TRAP vor und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius. Geben Sie 50 bis 100 Mikroliter Färbelösung in jede Sektion und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten lang in einer 37 Grad Celsius feuchten Kammer. Kontrollieren Sie alle fünf Minuten den Färbestatus der Osteoklasten unter einem Lichtmikroskop, bis rote mehrkernige Osteoklasten zu sehen sind.
Beenden Sie dann die Reaktion mit Wasser. Färben Sie die Abschnitte 30 Sekunden lang in Hämatoxylinlösung und erzeugen Sie eine stabile blaue Farbe, indem Sie sie eine Minute lang in 1%ige Ammoniaklösung tauchen. Spülen Sie sie dann in langsam fließendem Leitungswasser ab.
Montieren Sie die Abschnitte mit Deckgläsern mit neutralem Balsam und trocknen Sie sie über Nacht. Erfassen Sie drei bis fünf Sichtfelder mit einem Mikroskop und analysieren Sie den trabekulären Umfang mit Bild J.Verwenden Sie das Werkzeug für gerade Linien, um die Länge der Maßstabsleiste als L1 zu messen. Verwenden Sie dann das Werkzeug für segmentierte Linien, um die Länge des Trabekelumfangs als L2 zu messen. Berechnen Sie die physikalische Länge und zählen Sie die Anzahl der TRAP-positiven Zellen mit mehr als drei Kernen. Waschen Sie die Tibien nach der Fixierung dreimal vorsichtig mit PBS und tauchen Sie die Proben nacheinander jeweils fünf Minuten lang in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol.
Tauchen Sie die Proben 12 Stunden lang in Aceton und zwei Stunden lang zur Hälfte in Aceton und zur Hälfte in Harz und über Nacht in einem Trockenofen in reines Harz. Geben Sie reines Harz in einen geeigneten Kieselgel-Einbetttank und legen Sie die Proben in den Tank, um Blasen zu vermeiden. Polymerisieren Sie das Harz in einem Trockenschrank bei 60 Grad Celsius für 48 Stunden.
Schneiden Sie die Proben kontinuierlich mit einem rotierenden Mikrotom in fünf Mikrometer dicke Abschnitte und lagern Sie den Rest der Proben mit Trockenmittel bei Raumtemperatur. Kleben Sie die Abschnitte mit einer Pinzette in einen Tropfen 75%Ethanol und befestigen Sie sie mit Deckgläsern mit neutralem Balsam. Erfassen Sie die rote und grüne Fluoreszenzmarkierung mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Osteoklasten-spezifische Stat3-Deletionsmäuse wurden generiert, um den Einfluss der Stat3-Deletion auf die Osteoklastendifferenzierung zu untersuchen. Die Femurrekonstruktion und die quantitative Analyse mittels Mikro-CT zeigten, dass die Knochenmasse der Stat3 Ctsk-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen erhöht war. Die Histomorphologie der Femora von Wildtyp- und Stat3 Ctsk-Mäusen wurde mittels H- und E-Färbung untersucht.
Die osteoklastogene Aktivität wurde mittels TRAP-Färbung nachgewiesen. Osteoklasten sind große TRAP-positive Zellen mit mehreren Zellkernen. Die Anzahl der TRAP-positiven Osteoklasten war bei Stat3-Ctsk-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen geringer, was darauf hindeutet, dass ein Stat3-Mangel die Osteoklastenbildung beeinträchtigte.
Die Osteogenese wurde mit Calcein und Alizarinrot Doppelmarkierung gemessen. Der Bereich zwischen dem Calcein und der Alizarin-Rotfluoreszenz stellt den neu gebildeten Knochen dar. Das deletierte Stat3 in Osteoklasten hatte keinen Einfluss auf den Knochenanabolismus.
Sagittale Paraffinschnitte, bei denen der Knorpel später symmetrisch war und die zeigten, dass hier eine klare M-förmige Linie verwendet wurde. Für die Studien werden wir weitere Merkmale des Skelettsystems einbeziehen, wie z. B. mechanische Eigenschaften.
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Überblick
Diese Studie untersucht die Rolle kritischer Gene bei der Osteoklastaktivität unter Verwendung gentechnisch veränderter Mausmodelle. Das Protokoll beschreibt Techniken zur Analyse von Skelett-Phänotypen und betont die Bedeutung hochwertiger biologischer Proben.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Knochenbiologie
- Osteoklast-Differenzierung
- Genetische Regulation des Knochenumbaus
Hintergrund
- Bedeutung von Osteoklasten für die Gesundheit des Skeletts
- Verwendung von transgenen Mäusen zur Modellierung menschlicher Krankheiten
- Notwendigkeit strenger experimenteller Protokolle
Verwendete Methoden
- Skelettanalyse unter Verwendung verschiedener histologischer Techniken
- Transgene Mausmodelle (Stat3 Ctsk Mäuse)
- TRAP-Färbung, Mikro-CT-Scanning und Dual-Labeling zur Messung der Knochenbildung
Hauptergebnisse
- Stat3-Mangel reduzierte die Osteoklastbildung
- Erhöhte Knochenmasse bei Stat3 Ctsk Mäusen im Vergleich zu Wildtyp
- Die Studie validiert die Rolle des Gens bei der Osteoklast-Differenzierung und schlägt einen Mechanismus für die Regulierung der Knochenmasse vor
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt, wie die Genregulation das Osteoklastverhalten und die allgemeine Knochengesundheit beeinflussen kann.
- Die Ergebnisse sind bedeutsam für therapeutische Ansätze bei Erkrankungen im Zusammenhang mit Knochenverlust.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding osteoclast-specific gene function enables mechanistic de-risking in bone-targeted therapeutic development. Conditional knockout models provide predictive confidence for target validation by isolating cellular contributions to bone remodeling. This approach supports preclinical assessment of anabolic versus catabolic pathway modulation in osteoporosis drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis regarding STAT3's role in osteoclast differentiation and bone resorption.
- Operational Value: Enables functional target validation through cell-specific genetic ablation in vivo.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking STAT3 loss to reduced osteoclast formation and increased bone mass.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (bone tissue) for downstream assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Generates quantitative outputs (TRAP+ cell count, bone area, microCT metrics) for reliable compound evaluation.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness through standardized histology and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system continuity from genetic target modulation to skeletal phenotype.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring both resorption (TRAP) and formation (calcein/alizarin) endpoints.
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone mass regulation via osteoclast-specific pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of osteoclast-intrinsic gene function and pathway clarification in bone homeostasis.
- Discovery Biology: Explains how conditional deletion supports hypothesis testing of STAT3 in osteoclasts and biological de-risking of resorption targets.
- Screening: Describes assay readiness via standardized tissue preparation and quantitative histomorphometry for compound screening.
- Analytics: Highlights microCT, TRAP staining, and dual-labeling as quantitative readouts that enable cross-condition comparison of bone phenotype.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to preclinical continuity through integrated resorption and formation analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating osteoclast-specific targets in bone disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in osteoclast regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of skeletal phenotyping workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bone therapeutics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on on-target mechanism validation.
Implementation Considerations
- Required expertise in mouse genetics, bone histology, and microCT analysis.
- Instrumentation needs include microtome, fluorescence and light microscopes, microCT scanner, and decalcification equipment.
- Cross-team standardization requires harmonized staining protocols and imaging analysis between histology and in vivo teams.
- Adaptation considerations across model systems include verifying Cre specificity and compensatory pathways in other osteoclast models.
- Practical limitations include time-intensive decalcification and sectioning, and potential developmental compensation in constitutive models.
