Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erkennung und Quantifizierung des Proteinspiegels während der craniofacialmorphogenese/pathogenese durch Immunfärbung anhand von Maus-Craniofacial-Geweben als Beispiele vor. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Herstellung und Kryosektion von nicht verkalkten harten Geweben von jungen Mäusen zur Immunfärbung.

Hier stellen wir Ihnen unser einfaches Protokoll zum Immunfluoreszenznachweis auf Proteinen auf schnittten Materialien vor. Diese Methode erfordert keinen Antigenabruf. Wir verwenden Mausköpfe, einschließlich nicht verkalkter harter Gewebe.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist es, Antigen-Retrieval und Entkalkung von hartem Gewebe zu überspringen. Diese führen zu einer guten Qualität der immunstainierenden Ergebnisse. Diese Methode spart auch Zeit und Arbeit.

Diese Methode ist auch auf andere Gewebe mit entsprechenden Modifikationen anwendbar. Um schöne Abschnitte aus nicht verkalkten Geweben zu machen, sezieren Sie Ihr Zielgewebe weiter, um umgebende Gewebe zu trimmen, und behandeln Sie bei Bedarf die Proben mit 10% EDTA bei vier Grad Celsius für zwei Tage vor dem Kryoschutz. Die visuelle Demonstration bietet eine detaillierte und klare Erläuterung des Verfahrens dieser Methode.

Zu Beginn bereiten Sie für jede trächtige Maus ein 10-Zentimeter- und mehrere 3,5-Zentimeter-Geschirr mit PBS und eine 12-Well-Kulturplatte mit zwei Millilitern 4%PFA in PBS in jedem Brunnen zu und legen sie alle auf Eis. Um Embryonen von schwangeren Mäusen zu sezieren, greifen Sie die Haut unter der Mitte des Bauches einer eingeschläferten Maus mit Zange, schneiden Sie nur durch die Haut und ziehen Sie sie dann sanft an der Haut, um sie von der darunter liegenden Bauchmuskelwand zu trennen. Nach der gleichen Linie des Hautschnitts, in die Bauchhöhle geschnitten.

Entfernen Sie die Gebärmutter, die eine Reihe von Embryonen enthält. Entfernen Sie dann die Embryonen, indem Sie die Gebärmutterwand vorsichtig abschneiden, wodurch die extraembryonalen Gewebe wie der Dottersack und das Amnion entfernt werden. Schneiden und isolieren Sie den Kopf von jedem Embryo, und mit Zangen übertragen Jeden Kopf in einen separaten Brunnen einer 12-Well-Platte mit 4%PFA.

Inkubieren Bei vier Grad Celsius für vier Stunden zu beheben. Spülen Sie die Köpfe in PBS bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln für 12 Stunden. Um die Köpfe kryoprotectzuschützen, übertragen Sie sie mit Zangen in eine neue 12-Well-Platte, die zwei Milliliter 30%Saccharose in PBS enthält.

Mit sanfter Rührung bei vier Grad Celsius bebrüten, bis die Köpfe auf den Boden der Schale sinken. Um die kryogeschützten Köpfe einzubetten, übertragen Sie sie in eine Form mit optimaler Schnitttemperaturverbindung und gleichnden Sie für einige Minuten. Passen Sie mit Zangen die Position und Richtung der Proben so an, dass die getrimmte Seite der Proben mit der Unterseite der Einbettform zu sehen ist.

Dann legen Sie die Form auf Trockeneis zu gefrieren, und lagern Sie in einer Plastiktüte bei minus 80 Grad Celsius, bis bereit für Kryosektionen. Für postnatales Gewebe, nach dem Entfernen der Haut und Fettgewebe einer eingeschläferten, drei Wochen bis drei Monate alten Maus, schneiden und isolieren Sie den Kopf und entfernen Sie den Unterkiefer. Dann fixieren und kryoprotect den Kopf wie mit Embryoköpfen getan.

In 8% Gelatine in ähnlicher Weise einbetten wie Embryoköpfe in OCT, und halten Sie die Cryomolds in einer Plastiktüte bei minus 80 Grad Celsius bis zum Kryosektionen. Stellen Sie die entsprechende Kryostattemperatur ein. Legen Sie die Proben für etwa 30 Minuten in die Kryostatkammer, um die Kryostattemperatur zu ausgrenzen.

Entfernen Sie den Block mit der Probe aus dem Cryomold, und montieren Sie ihn mit einem OCT-Tropfen auf das Probenfutter und frieren Sie ihn ein, um sicherzustellen, dass die getrimmte Seite der Probe am weitesten vom Futter entfernt bleibt und dem Bediener zugewandt ist. Laden Sie das blockmontierte Futter auf den Cryostat-Objekthalter. Stellen Sie den Klingenhalter so ein, dass der Klingenwinkel drei bis fünf Grad relativ zur Probe beträgt.

Sammeln Sie 10-Mikrometer-Abschnitte auf beschichteten Mikroskop-Dias. Lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur bis vollständig trocken, und speichern Sie sie dann bei minus 80 Grad Celsius. Um mit der Färbung zu beginnen, nehmen Sie Rutschen von minus 80 Grad Celsius heraus und halten Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um die Abschnitte lufttrocken zu halten.

Spülen Sie die Dias in 0,1%PBST dreimal für jeweils fünf Minuten, um OCT auszuwaschen und die Abschnitte zu durchdringen. Fügen Sie 200 Mikroliter Blockierlösung zu jeder Folie hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie dann die Blockierlösung, ohne die Folie zu spülen.

Fügen Sie 100 Mikroliter Primärantikörper in Blockierlösung zu jedem Dia verdünnt, und inkubieren Über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Dias mit PBS dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 100 Mikroliter Sekundärantikörper in Blockierlösung verdünnt, und inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.

Spülen Sie in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, noch vor Licht geschützt. Um die Dias zu montieren, fügen Sie zwei Tropfen Anti-Fade-Medium mit DAPI auf jeder Folie, Abdeckung mit einem Coverslip, und speichern Sie bei vier Grad Celsius, bis bereit für das Bild. Frontalknochen von Kontrollembryonen waren positiv für pSmad1/5/9, nachgeschaltete BMP-Signalfaktoren und Ki67, einen Zellproliferationsmarker.

Bei neuronalen Kamm-spezifischen, konstitutiv aktivierten BMPR1A-mutierten Embryonen wurden jedoch pSmad1/5/9-Spiegel erhöht, während die Ki67-Spiegel verringert wurden. Darüber hinaus wurden in den Frontalknochen mutierter Embryonen mehr apoptotische Zellen beobachtet als bei Kontrollembryonen. Koronale Kryosektionen von gelatineförmigen Köpfen zeigen deutlich DAS GFP-Signal und das RFP-Signal einer tdTomato-Kassette im Nasenknochen- und Nasengewebe, was zeigt, dass Gelatine die fluoreszierenden Signale nicht stört.

Wenn diese Abschnitte für SOX9 oder Osterix und E11/Podoplanin immungefärbt wurden, wurden aus den meisten dreiwöchigen harten Geweben hochwertige Abschnitte gewonnen. Auf der anderen Seite wurden mit drei Monate alten Proben nur in einigen der harten Gewebe, einschließlich der trabekulären Fächer des Oberschenkelknochens, des Nasengewebes und des Schädels, einschließlich der Nasen-Premaxilla-Naht und der umgebenden Knochen des Kopfes, hochwertige Abschnitte erhalten. SOX9-positive Zellen wurden speziell in den Chondrozyten der Wachstumsplatte und des Gelenks aus dem Oberschenkelknochen und dem Nasenseptum nachgewiesen.

In dem drei Wochen alten Schneidezahn wurde SOX9 in den mesenchymalen Zellen nachgewiesen. Die Doppelfärbungsergebnisse von Osterix und E11 zeigen, dass Osterix bei Osteoblasten nachgewiesen wurde, während E11 bei Osteozyten von Knochen aus dem Oberschenkelknochen und dem Kopf nachgewiesen wurde. Im dreiwöchigen Schneidemittel war Osterix positiv in Odontoblasten, während E11 in follikulären mesenchymalen Zellen positiv war.

Überschreiben Sie keine Proben mit 4%PFA. Für das Schnitten von nicht verkalkten harten Geweben in Gelatine, die beste Temperatur ist minus 25 Grad Celsius und niedriger. Nach diesem Verfahren können die Fluoreszenzwerte wie in unserem Protokoll beschrieben quantifiziert werden.

Diese Messungen liefern informative Daten, um den Unterschied des relativen Proteinspiegels zwischen verschiedenen Gruppen aufzuzeigen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für doppel- oder dreifache Färbung, um Koexpressionsmuster verschiedener Proteine zu erhalten. 4%PFA ist gefährlich.

Es kann Hautallergien, schwere Augenschäden, Organschäden oder Krebs verursachen. Bitte verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung und waschen Sie die Haut gründlich nach der Handhabung.