Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Das übergeordnete Ziel dieser Struktur-Funktions-Methode ist es, auf molekularer Ebene die Rolle verschiedener Proteindomänen oder krankheitsrelevanter Mutationen in naiven oder differenzierten embryonalen Stammzellen der Maus zu untersuchen. Diese Methode kann helfen aufzudecken, wie verschiedene Reste oder Domänen eines Proteins zu seiner Funktion in einem bestimmten zellulären Kontext beitragen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine sehr effiziente Ausrichtung von Rettungskonstrukten auf das Genom von embryonalen Stammzellen (Knock-out embryonalen Stammzellen) und die Untersuchung ihrer Rolle in verschiedenen Zelltypen ermöglicht.

Um dies zu erreichen, kombinieren wir drei hocheffiziente Technologien. Dazu gehören eine verbesserte Isolierung embryonaler Stammzellen aus der Maus, die rekombinationsbasierte Assemblierung von Targeting-Faktoren und das Targeting von ES-Zellen über rekombinationsvermittelten Kassettenaustausch (RMC). Einige der Verfahren wird Jinke D'Hont, ein Techniker aus meinem Labor, vorführen.

Der Rekombinations-vermittelte Kassettenaustausch (RMCE) ermöglicht den Austausch von DNA-Fragmenten zwischen einem Vektor und einem genomischen Locus. RMCE nutzt heterospezifische Rekombinationsstellen, die nicht kreuzreagieren und in einen genomischen Locus eingebettet sind. In Gegenwart eines Donorplasmids, das ein DNA-Fragment enthält, das von denselben heterospezifischen Stellen flankiert wird, fügt die Rekombinase dieses DNA-Fragment aufgrund der doppelten gleichzeitigen Translokation in den RMCE-kompatiblen genomischen Locus ein.

Erst nach korrekter Rekombination wird das gefangene promotorlose Neomycin-Resistenz-Gen in der Andockstelle von Rosa 26 über einen PGK-Promotor im eingehenden Targeting-Vektor wiederhergestellt, wodurch die Wirkstoffresistenz entsteht. Dieses Neomycin-Resistenzfallen-System führt zu einer sehr hohen Targeting-Effizienz, oft nahe 100 %Am Tag vor der Blastozystenisolierung fügen Sie 0,1 % Gelatine zu 12 gut kultivierten Platten hinzu. Und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Aspiriere die Gelatinelösung. Säen Sie dann ein Viertel eines Fläschchens mit P2-Maus-Embryonalen Fibroblasten (MEFs) in MEF-Medium aus und verteilen Sie es auf der 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die 12-Well-Platten mit MEFs in zwei Millilitern MEF-Medium bei 37 Grad Celsius.

Und züchten Sie die Zellen zu einer konfluenten Monoschicht. Geben Sie dann 10 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin-Samen in die Vertiefungen. Und inkubieren Sie die Kulturen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu inaktivieren.

Nach der Selektion heterozygoter Knock-out-Mäuse, die eine RMCE-Kassette im Rosa 26-Locus gemäß dem Textprotokoll enthalten, richten Sie Paarungen ein, um RMCE-kompatible heterozygote Knock-out-Mäuse mit heterozygoten Knock-out-Mäusen zu züchten. Überprüfen Sie am nächsten Morgen die Kopulationspfropfen, indem Sie das Weibchen an der Basis der Hülle anheben, und untersuchen Sie die Vaginalöffnung auf eine weißliche Masse. Wenn der Plug schwer zu sehen ist, spreizen Sie mit einer abgewinkelten Sonde die Lippen der Vulva leicht und trennen Sie dann die verstopften Weibchen von ihren Männchen.

Zur Entnahme von Blastozysten 3,5 Tage nach dem Koitus oder DPC. Nachdem Sie die trächtigen Weibchen eingeschläfert haben, machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Bauches und verwenden Sie eine feine Schere und Pinzette, um die Gebärmutter und den Eileiter zu präparieren. Biegen Sie als Nächstes eine 26-Gauge-Nadel in einen 45-Grad-Winkel, der an einer mit M2-Medium gefüllten 1-Milliliter-Spritze befestigt ist.

Und führen Sie die Nadel in das Ende der Gebärmutter ein, das dem Eileiter am nächsten ist. Verwende eine feine Pinzette, um die Nadel an Ort und Stelle zu halten, während du den Kolben drückst, um die Blastozysten aus der Gebärmutter in den Deckel einer 10 Zentimeter großen Schale zu spülen. Die Gebärmutter schwillt an, wenn die Spülung erfolgreich ist.

Verwenden Sie eine Mundpipette, um alle Embryonen in einem Tropfen M2-Medium zu sammeln, und waschen Sie die Embryonen zweimal in einem Tropfen M2-Medium. Unmittelbar nach dem Waschen der Embryonen verwenden Sie PBS, um die Mitomycin-C-inaktivierten Zellen zweimal zu waschen. Plattieren Sie dann mit einer Mundpipette jede Blastozyste in eine separate Vertiefung der mit Mitomycin-C behandelten MEFs in SRES-Zellmedium, ergänzt mit Pluripotent oder 2I.

Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Aktualisieren Sie das SREF-Zellenmedium alle zwei bis drei Tage. Untersuchen Sie jede Blastozyste unter einem Stereomikroskop mit 4-facher Vergrößerung und prüfen Sie, ob sie schraffiert und sich von der MEF-Schicht abgelöst hat.

Verwenden Sie nach 10 bis 12 Tagen Kultur unter einem Stereomikroskop eine P10-Pipette mit Einwegspitzen, um einzelne Icium-Auswüchse zu entnehmen. Übertragen Sie jeden Auswuchs in etwa 10 Mikroliter Medium auf eine V-förmige 96-Well-Platte, die 30 Mikroliter PBS pro Well enthält. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter 0,25 % Trypsin in jede Vertiefung.

Und inkubieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Fügen Sie 100 Mikroliter vorinkubiertes FPS-haltiges ES-Zellmedium hinzu und dissoziieren Sie die Icium-Auswüchse in einzelne Zellen, indem Sie 10 bis 15 Mal pipettieren. Übertragen Sie dann die dissoziierten Zellen auf Mitomycin-C-behandelte 96-Well-MEF-Platten.

Wechseln Sie am nächsten Tag das SR-basierte Medium. Erweitern Sie die ES-Zellen auf ähnliche Weise von 24- auf 6-Well-Platten. Nach der Identifizierung geretteter CDNA-Vektoren gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie eine 10-Mikroliter-LR-Reaktion unter Verwendung von 100 Nanogramm Rettungs-CDNA-Vektor, 150 Nanogramm vorexzidiertem RMCEDV1-Vektor und zwei Mikrolitern Rekombinase-Mix vor, der eine Phagen-kodierte Integrase, eine Exzisionase und einen bakteriellen Integrationswirtsfaktor enthält.

Inkubieren Sie die Reaktion zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Um die rekombinierten Vektoren umzuwandeln, fügen Sie 5 Mikroliter jeder Mischung zu 40 Mikrolitern Hitzeschock-kompetenten E.Coli-Bakterien in ein 2-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen mit Sockel hinzu. Und inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang auf Eis.

Dann inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie einen Milliliter LB-Medium in das Röhrchen und inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. 50 Mikroliter auf Agarplatten mit Ampicillin auffüllen.

Und über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen. Identifizieren Sie Kolonien mit dem richtigen Zielvektor, indem Sie mit einer P200-Spitze fünf Kolonien nach dem Zufallsprinzip auswählen. Gib die Spitze in ein Reagenzglas mit zwei bis fünf Millilitern LB-Medium und züchte sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Nach der Extraktion der DNA aus jeder Kolonie validieren Sie die Proben, indem Sie 0,5 bis zwei Mikrogramm DNA verdauen und die Proben auf einem 1%igen Agarosegel trennen. Starten Sie eine Kultur mit RMCE-kompatiblen Knock-out-ES-Zellen und passieren Sie sie mindestens zweimal auf MEFs in FBS-basiertem ES-Zellmedium. Teilen Sie dann die ES-Zellen auf einer gelatinierten Sechs-Well-Platte.

Verwenden Sie am nächsten Tag 1,5 Milliliter FBS-basiertes ES-Zellmedium, um die ES-Zellen aufzufrischen, die zu etwa 50 % konfluent sind. Kombinieren Sie ein Mikrogramm vorexzidierten RMCEDV1-Targeting-Vektor, der Rescue-CDNA enthält, und ein Mikrogramm FLIPe-Expressionsplasmid in 250 Mikrolitern reinem DMEM-Medium. Geben Sie sieben Mikroliter Transvektionsreagenz auf Lipofectin-Basis zu 250 Mikrolitern reinem DMEM-Medium.

Und inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie die DNA- und Lipofectin-Lösungen. Und die Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Pipettieren Sie dann das Transvektionsgemisch auf die aufgefrischten ES-Zellen und schwenken Sie es vorsichtig. Einen Tag nach der Transvektion spalten Sie alle ES-Zellen aus dem Röhrchen in eine 10-Zentimeter-Kulturschale mit einer konfluenten Schicht aus DR4 MEFS und 10 Millilitern FPS-basiertem ES-Zellmedium. Zwei Tage nach der Transvektion wählen Sie ES-Zellklone mit dem korrekten FLIP-e-vermittelten Kassettenaustausch aus, indem Sie G418 zum Medium hinzufügen.

Wie hier gezeigt, sollte die massive Tötung von nicht bevölkerten Völkern nach drei bis fünf Tagen sichtbar sein. Die Kolonien sollten nach sieben bis 10 Tagen erscheinen. Wählen Sie diese Kolonien aus, erweitern Sie sie und verifizieren Sie die Klone, wie weiter oben in diesem Video gezeigt.

Um ES-Zellen in embryoide Körper oder EBs zu differenzieren, lassen Sie EBs nach der Kultivierung von Knock-out-ES-Zellen mit Rosa-26-gesteuerten Rettungskonstrukten gemäß dem Textprotokoll 30 Tage lang in den nicht adhärenten Schalen bilden. Frischen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage auf, indem Sie die EB-Suspension in eine 50-Milliliter-Tube umfüllen. Und lassen Sie die EBs durch die Schwerkraft zur Ruhe kommen.

Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie frisches Medium hinzu und geben Sie die EB-Suspension in eine bakterielle Schale. Analysieren Sie die ES-Zellen und EBs durch Immunfluoreszenz und TEM gemäß dem Textprotokoll. Unter Verwendung der Strukturfunktionsmethode wurden fünf vorexzlizierte RMCEDV1-Targeting-Vektoren mit einer Effizienz von 100 % generiert, und diese Rettungskonstrukte wurden über RMCE auf P120-Catenin-Knock-out-ES-Zellen mit einer Effizienz von 97 % ausgerichtet. Die zystische EB-Morphologie kann als phänotypisches Messwert verwendet werden, um verschiedene Rettungskonstrukte zu screenen.

Als Proof of Concept rettete die R26-getriebene P120-Catenin-Isoform 1A den p120-Catenin-Knock-out-Phänotyp. Um zu testen, ob die E-Cadherin-unabhängige Membranverankerung von P120-Catenin die csytische EB-Bildung ermöglicht, wurde das k-ras-Membran-Targeting-Motiv, CAAX, mit dem Carboxy-Terminus von P120-Catenin fusioniert und über RMCE in P120-Catenin-Knock-out-ES-Zellen eingeführt, bevor EBs aus ihnen hergestellt wurden. Dieses Konstrukt dient jedoch einem dominanten Negativ, das keine Bindung und Stabilisierung von E-Cadherin zulässt.

Und als Konsequenz rettet es den p120-Catenin-Knock-out-Phänotyp nicht. Der Übergang zwischen Epithel und Mesenchym (EMT) ist ein wesentlicher Entwicklungsprozess, der auch während der Differenzierung von ES-Zellen stattfindet. Bei der Expression in p120-Catenin-Knock-out-ES-Zellen konnten die EMT-Induktoren ZEB1, ZEB2 oder Schnecke, die verschiedene epitheliale Markergene wie E-Cadherin direkt unterdrücken können, die zystische EB-Bildung nicht wiederherstellen.

Einmal gemastert, können RMCE-kompatible ES-Zellen innerhalb eines Monats isoliert werden. RMCE-kompatible Targeting-Vektoren können innerhalb einer Woche generiert werden, und eine gezielte Rettung von ES-Zellen kann mit dieser Technik innerhalb eines Monats erreicht werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie RMCE zur Durchführung von Strukturfunktionsstudien an naiven oder differenzierten embryonalen Stammzellen verwenden können.