Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Genübertragungsexperimente mithilfe nichtviraler polymerer Nanopartikel durchzuführen und auszuwerten. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst mit Genübertragungspartikeln transfiziert werden. Die Transfektionseffizienz wird anschließend mittels Mikroskopie und hochdurchsatzfähiger Durchflusszytometrie analysiert.

Anschließend werden die Größenverteilung, die Konzentration der Nanopartikel sowie die Anzahl der Plasmide pro Partikel mithilfe eines Instruments zur Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt. Letztendlich ermöglicht diese Methode die Charakterisierung der Nanopartikelgröße sowie die Beurteilung der Transfektionseffizienz unter Verwendung von Nanopartikeln. Der Hauptvorteil der Verwendung biokompatibler, polymerer Nanopartikel für die Genübertragung liegt darin, dass sie sicherer und effektiver als andere Methoden der Genübertragung sein können.

Der Hauptvorteil der Nanopartikel-Tracking-Analyse gegenüber etablierten Methoden wie der dynamischen Lichtstreuung besteht darin, dass die Nanopartikel-Tracking-Analyse direkt die zahlenbasierte Partikelverteilung und die Partikelkonzentration liefert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der nicht-viralen Genübertragung zu beantworten, beispielsweise die Anzahl der Plasmide pro Partikel, was für Co-Expressionsstudien von Bedeutung ist. Das folgende Protokoll wird anhand menschlicher retinaler Endothelzellen oder hre als Modellzellen sowie poly-beta-aminosäureesterartiger Polymere oder PBA AEs als Modellpolymere demonstriert.

Beachten Sie, dass die Kulturbedingungen und Lösungsmittel je nach verwendeten Zellen und Polymeren 24 Stunden vor der Transfektion angepasst werden müssen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um hre in klare, für die Zellkultur behandelte, flache 96-Loch-Platten mit einer Konzentration von 25 bis 50 Zellen pro Mikroliter einzusetzen.

Dies führt am Tag der Transfektion zu einer Konfluenz von 70 bis 80 %. Bereiten Sie klare, nicht für Gewebekultur behandelte 96-Well-Platten vor und beschriften Sie diese, die als Masterplatten dienen, um das PBA und die DNA vorzubereiten und zu verdünnen. Es werden zwei identische Platten hergestellt.

Eine zur Beurteilung der Toxizität und eine zur Beurteilung der Transfektionsrate. Bereiten Sie die Polymer-Stocklösungen von Poly-Beta-Aminoester oder PVAE sowie P-E-G-F-P-N 1D NA bei Raumtemperatur vor. Geben Sie nach dem Auftauen mittels einer 12-Kanal-Pipette in jede Vertiefung 50 µL einer DNA-Lösung mit 0,06 mg/mL DNA in 25 mmol/L Natriumacetat-Puffer für jede Bedingung.

Als Nächstes verdünnen Sie die PBAE-Polymere auf derselben Platte auf 10 Milligramm pro Milliliter in Natriumacetatpuffer. Verdünnen Sie die PBAE-Polymere anschließend weiter in Verhältnissen von Polymergewicht zu DNA-Gewicht von 30 und 60 mit jeweils 50 Mikrolitern Natriumacetatpuffer. Zum Bilden der Nanopartikel kombinieren Sie mithilfe einer 12-Kanal-Pipette die 50 Mikroliter verdünntes PBA mit den 50 Mikrolitern verdünnter Plasmid-DNA, und mischen Sie die Lösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich durch.

Danach die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Selbstassemblierung zu ermöglichen. Nach der Selbstassemblierung mit einer 12-Kanal-Pipette 20 µL der Nanopartikellösung tropfenweise zu jedem gut mit beimpften Zellen hinzufügen, wobei vier Gänge pro Bedingung wie in diesem Diagramm dargestellt transfiziert werden. Für jede Platte mindestens vier Gänge für die jeweiligen negativen und positiven Kontrollen reservieren.

Die negative Kontrolle besteht aus unbehandelten Zellen, und die positiven Kontrollen bestehen aus Zellen, die mit einem kommerziell verfügbaren Reagenz wie Lipo 2000 oder Fuge hd transfiziert wurden. Inkubieren Sie die Platten mit den transfizierten Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation mithilfe einer 12-Kanal-Pipette das Medium von den Zellen und ersetzen Sie es durch jeweils 100 Mikroliter frisches HRE-Medium pro Vertiefung. Führen Sie eine zusätzliche Inkubation für 24 bis 48 Stunden durch.

Am nächsten Tag eine Platte aus dem Inkubator nehmen. Die Zelltransfektion und -toxizität mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilen und die Zelltoxizität mit dem Cell Titer 96 Aqueous One Assay quantifizieren, wie im begleitenden Text beschrieben. Nach 48 Stunden die andere Platte aus dem Inkubator entfernen.

Beurteilen Sie die Transfektions-Effizienz mittels Fluoreszenz, Mikroskopie und Durchflusszytometrie, wie im begleitenden Text beschrieben. Nutzen Sie die hier gewonnenen Daten zur Toxizität und Transfektion, um die optimalen Konzentrationen von PBAs für zukünftige Experimente zu bestimmen. Das Nano-Site NS 500 ist ein Instrument zur Nanopartikel-Verfolgungsanalyse, das Informationen zur Größenverteilung einer Nanopartikelprobe liefern kann, indem es die Diffusion einzelner Nanopartikel verfolgt; vor der Verwendung führen Sie das Fluidiksystem des Nano-Site in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein.

Bereiten Sie das PBA und die PlasmadNA für die Analyse wie zuvor in den gleichen Konzentrationen vor, die im vorherigen Abschnitt dieses Videos verwendet wurden. Verdünnen Sie die Nanopartikellösung nach der Selbstassemblierung 100-fach in PBS in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen, um ein Endvolumen von mindestens 500 Mikrolitern zu erhalten. Dadurch ergibt sich eine Nanopartikelkonzentration im geeigneten Bereich für die Nanopartikel-Tracking-Analyse.

Laden Sie als Nächstes die Probe in die Nanozelle. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen, und prüfen Sie visuell, ob sich zwischen 20 und 100 Partikel auf dem Bildschirm befinden. Eine ideale Anzahl für das Nanopartikel-Tracking beträgt etwa 50 Partikel.

Wenn zu viele oder zu wenige vorhanden sind, spülen Sie das NS 500, passen Sie die Verdünnung in PBS an und laden Sie die Probe erneut auf. Wenn sich auf dem Bildschirm zwischen 20 und 100 Partikel befinden, nehmen Sie Videos auf. Sobald die Videos aufgenommen sind, fahren Sie mit dem Verarbeitungsschritt fort, indem Sie eine Videodatei in derselben Software öffnen.

Danach, sobald die Datei geöffnet ist, erhöhen Sie die Bildschirmverstärkung. Wählen Sie die automatische Anpassung der Bilddaten, indem Sie die entsprechenden Felder anklicken. Wenn das Programm ein Teilchen auf dem Bildschirm erkennt, wird dieses mit einem roten Kreuz markiert.

Nachdem alle Partikel markiert wurden, klicken Sie im Softwaremenü auf die Schaltfläche „Verarbeiten“, um die Videodatei zu verarbeiten. Die Partikelgröße, die durchschnittliche Größenverteilung und die Partikelkonzentration werden daraufhin angezeigt, um zu überprüfen, ob die Partikelanzahl korrekt ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit derselben Probe, die jeweils um den Faktor zwei und vier verdünnt wurde.

Forex-Zellen in PBS wurden mit den E-G-F-P-P-B-A-E-Nanopartikeln transfectiert, wie in diesem Video gezeigt. Zur visuellen Beurteilung der Transfektionseffizienz wurde eine Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Diese Bilder zeigen die Fluoreszenz-, Hellfeld- und Überlagerungsaufnahmen der transfizierten Zellen. Wie im überlagerten Bild zu sehen ist, exprimieren die Mehrheit der Zellen EGFP und weisen eine normale Morphologie auf.

Um die Transfektions-Effizienz zu quantifizieren, wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, wie hier nach der Auswahl der lebenden Zellenpopulation ersichtlich ist. Die unbehandelte Population enthielt keine EGFP-positiven Zellen. Hingegen waren 71,6 % der behandelten Zellen positiv für EGFP. Anschließend wurde die Nanopartikel-Verfolgungsanalyse (Nanoparticle tracking analysis) verwendet, um die Größenverteilung und Konzentration der Nanopartikel zu bestimmen.

Für diese Analyse ist es wichtig, dass die Partikelgrößenverteilung monodispers ist. Mithilfe dieser Information kann die durchschnittliche Anzahl von Plasmiden pro Partikel berechnet werden, indem die Konzentration der Plasmide in Lösung durch die mit dem NS 500 bestimmte Partikelkonzentration dividiert wird. Die Anzahl der Plasmide pro Partikel bildet eine Verteilung ab, die der Partikelgrößenverteilung entspricht.

Innerhalb der Probe befinden sich größere Partikel mit einem pro Partikel höheren Plasmidgehalt als der Durchschnitt sowie kleinere Partikel mit einem pro Partikel niedrigeren Plasmidgehalt als der Durchschnitt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, abbaubare Polymere nicht zu lange in wässrigem Lösungsmittel zu belassen, bevor die Nanopartikel den Zellen zugegeben werden; für die Verwendung mit ncy muss die Verdünnung entsprechend der Partikelgröße angepasst werden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Adhärenz-Zelltypen mit nichtviralen Genübertragungspolymeren transfectiert sowie die Transfektionseffizienz und die Partikelgrößenverteilung bestimmt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen biologische Gefahren birgt. Tragen Sie stets persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie in einem Sicherheitswerkbank, während Sie dieses Verfahren durchführen.