Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung und Auswertung von Gen-Delivery-Experimenten mit nicht-viralen polymeren Nanopartikeln. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst mit Gen-Delivery-Partikeln durchtrennt werden. Die Transfektionseffizienz wird dann durch Mikroskopie und Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie bewertet.

Als nächstes werden die Größenverteilung, die Konzentration der Nanopartikel und die Plasmide pro Partikel mit einem Nanopartikel-Tracking-Analysegerät bestimmt. Letztendlich ermöglicht diese Methode die Charakterisierung der Nanopartikelgröße und die Wirksamkeit der Transfektion mit Nanopartikeln. Der Hauptvorteil der Verwendung von biologisch abbaubaren polymeren Nanopartikeln für die Genübertragung besteht darin, dass sie sicherer und effektiver sein können als andere Gentransfermethoden.

Der Hauptvorteil der Nanopartikel-Tracking-Analyse gegenüber bestehenden Methoden wie der dynamischen Lichtstreuung besteht darin, dass die Nanopartikel-Tracking-Analyse direkt die Anzahl, die durchschnittliche Verteilung und die Partikelkonzentration liefert. Diese Methode würde dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der nicht-viralen Genverabreichung zu beantworten, wie z. B. die Anzahl der Plasmide pro Partikel, die für Co-Expressionsstudien wichtig ist. Das folgende Protokoll wird unter Verwendung von humanen retinalen Endothelzellen oder hre als Modellzellen und Poly-Beta-Aminoestern oder PBA-AEs als Modellpolymere demonstriert.

Beachten Sie, dass die Kulturbedingungen und Lösungsmittel je nach den 24 Stunden zuvor verwendeten Zellen und Polymeren angepasst werden müssen. Transfektion. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um hre in eine klare Gewebekultur zu säen, die flach behandelt wurde. Untere 96-Well-Platten mit einer Konzentration von 25 bis 50 Zellen pro Mikroliter.

Dies ergibt am Tag der Transfektion eine 70 bis 80%ige Co-Flüssigkeit, bereitet die behandelte klare, nicht gewebekulturelle Kultur vor und markiert sie. 96-Well-Platten dienen als Master-Platten zur Vorbereitung und Verdünnung von PBA und DNA. Es werden zwei identische Platten vorbereitet.

Eine zur Bewertung der Toxizität und eine zur Bewertung der Transfektionseffizienz. Die Poly-Beta-Aminoester- oder PVAE-Polymer- und P-E-G-F-P-N-1D-NA-Stammlösungen bei Raumtemperatur anwenden. Nach dem Häkeln verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um eine Vertiefung vorzubereiten, die 50 Mikroliter 0,06 Milligramm DNA pro Milliliter in 25 Millimolar Natriumacetatpuffer für jede Bedingung enthält.

Verdünnen Sie anschließend auf derselben Platte die PBAE-Polymere auf 10 Milligramm pro Milliliter in Natriumacetatpuffer. Dann verdünnen Sie die PBAE-Polymere weiter zu einem Polymergewichts-DNA-Gewichtsverhältnis von 30 und 60 und 50 Mikrolitern Natriumacetatpuffer. Verwenden Sie für die Bildung von Nanopartikeln eine 12-Kanal-Pipette, um die 50 Mikroliter verdünntes PBA mit den 50 Mikrolitern verdünnter Plasma-DNA zu kombinieren, die durch Auf- und Abpipettieren kräftig gemischt werden.

Lassen Sie die Mischung dann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, damit sie sich selbst zusammensetzen kann. Nach der Selbstorganisation fügen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette 20 Mikroliter der Nanopartikellösung tropfenweise in jede Vertiefung der ausgesäten Zellen mit Medium hinzu und transfizieren vier Vertiefungen pro Zustand, wie in diesem Diagramm gezeigt. Reservieren Sie für jede Platte mindestens vier Vertiefungen für jede der Negativ- und Positivkontrollen.

Die Negativkontrolle besteht aus unbehandelten Zellen und die Positivkontrolle besteht aus Zellen, die mit einem kommerziell erhältlichen Reagenz wie Lipo 2000 oder Fuge hd transfiziert wurden. Inkubieren Sie die Platten mit den transfizierten Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation verwenden Sie die 12-Kanal-Pipette, um das Medium aus den Zellen zu entfernen und durch 100 Mikroliter pro Vertiefung frisches Fleisch zu ersetzen. Medium für weitere 24 bis 48 Stunden inkubieren.

Nehmen Sie am nächsten Tag eine Platte aus dem Inkubator. Bewertung der Zelltransfektion und Toxizität durch Fluoreszenzmikroskopie und Quantifizierung der Zelltoxizität unter Verwendung des Zelltiters 96 wässriger Eins-Assay, wie im Begleittext beschrieben. Nehmen Sie nach 48 Stunden die andere Platte aus dem Inkubator.

Beurteilen Sie die Transfektionseffizienz durch Fluoreszenz, Mikroskopie und Durchflusszytometrie, wie im Begleittext beschrieben. Nutzen Sie die hier gewonnenen Toxizitäts- und Transfektionsdaten, um die optimalen Konzentrationen von PBAs für zukünftige Experimente zu bestimmen. Das Nano Site NS 500 ist ein Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument, das Informationen über die Größenverteilung einer Nanopartikelprobe liefern kann, indem es die Diffusion einzelner Nanopartikel verfolgt, bevor das fluidische System der Nanostelle in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen angeführt wird.

Bereiten Sie die PBA- und Plasma-DNA für die Analyse wie zuvor in den gleichen Konzentrationen vor, die im vorherigen Abschnitt dieses Videos verwendet wurden. Nach der Selbstorganisation verdünnen Sie die Nanopartikellösung in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen 100-fach in PBS, um ein Endvolumen von mindestens 500 Mikrolitern zu erhalten. Dies ergibt eine Nanopartikelkonzentration im geeigneten Bereich für die Nanopartikel-Tracking-Analyse.

Laden Sie anschließend die Probe in die Nanostelle. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen, die visuell überprüft werden, um sicherzustellen, dass sich zwischen 20 und 100 Partikel auf dem Bildschirm befinden. Eine ideale Zahl für die Verfolgung von Nanopartikeln liegt bei etwa 50 Partikeln.

Wenn zu viele oder zu wenige vorhanden sind, spülen Sie den NS 500, stellen Sie die Verdünnung in PBS ein und laden Sie die Probe neu. Wenn die Anzahl der Partikel auf dem Bildschirm zwischen 20 und 100 liegt, nehmen Sie Videos auf. Sobald die Videos aufgenommen sind, fahren Sie mit der Verarbeitungsphase fort, indem Sie eine Videodatei in derselben Software öffnen.

Sobald die Datei geöffnet ist, erhöhen Sie die Bildschirmverstärkung. Wählen Sie die automatische Anpassung für die Bildparameter aus, indem Sie auf die entsprechenden Felder klicken. Wird ein Partikel auf dem Bildschirm von der Software erkannt, wird es mit einem roten Kreuz markiert.

Sobald alle Partikel markiert sind, klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche "Verarbeiten", um die Videodatei zu verarbeiten. Die Partikelgröße, die Verteilungsgrößendurchschnitte und die Partikelkonzentration werden dann angezeigt, um zu überprüfen, ob die Partikelzahl korrekt ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit derselben Probe, verdünnt um zwei x und vier.

Forex in PBS apre wurden mit den Nanopartikeln E-G-F-P-P-B-A-E transfiziert, wie in diesem Video gezeigt. Um die Transfektionseffizienz visuell zu beurteilen, wurde eine Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Diese Bilder zeigen das Fluoreszenz-Hellfeld und die zusammengeführten Bilder der transfizierten Zellen, wie sie auf dem zusammengeführten Bild zu sehen sind, wobei die Mehrheit der Zellen EGFP exprimiert und die normale Morphologie beibehält.

Um die Transfektionseffizienz zu quantifizieren, wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, wie in dieser Abbildung nach Gating an der lebenden Population zu sehen ist. Die nicht resezierte Population enthielt keine EGFP-positiven Zellen. 71,6 % der behandelten Zellen waren jedoch positiv für die EGFP-Nano-Site. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse wurde dann verwendet, um die Größenverteilung und Konzentration der Nanopartikel zu bestimmen.

Für diese Analyse ist es wichtig, dass die Partikelgrößenverteilung monodispers ist. Anhand dieser Informationen kann die durchschnittliche Anzahl von Plasmiden pro Partikel berechnet werden, indem die Konzentration der Plasmide in Lösung durch die mit dem NS 500 ermittelte Partikelkonzentration dividiert wird. Die Anzahl der Plasmide pro Partikel ist eine Verteilung, die die Partikelgrößenverteilung widerspiegelt.

Innerhalb der Probe gibt es größere Partikel, bei denen die Plasmide pro Partikel größer als der Durchschnitt sind, sowie kleinere Partikel mit den niedrigeren Plasmiden pro Partikel als der Durchschnitt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass abbaubare Polymere nicht zu lange in wässrigem Lösungsmittel verbleiben, bevor Nanopartikel zu Zellen hinzugefügt werden, um sie zu verwenden, und die Verdünnung entsprechend der Dimensionierung anzupassen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Adhärenzzelltypen mit nicht-viralen Genverabreichungspolymeren transfiziert und die Wirksamkeit der Transfektion sowie die Partikelgrößenverteilung misst.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen biologisch gefährlich ist. Tragen Sie während dieses Verfahrens immer persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank.