Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die protio pathische Seeding-Aktivität aus rekombinanten oder biologischen Quellen zu detektieren und so den sensitiven Nachweis von Proteinen, Aggregaten und einer Probe zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neurodegeneration zu beantworten. Wie können wir zum Beispiel Veränderungen in der Aussaataktivität nach therapeutischen Eingriffen in Tiermodelle für Krankheiten quantitativ bewerten?

Zu den Vorteilen dieser Technik gehört ihre hohe Spezifität gegenüber niedrigen Mengen an Proteinaggregaten. Seine exquisite Spezifität, seine einfache Handhabung und sein hoher Durchsatz. Dieses Verfahren werde ich heute zusammen mit Co-Autor Brandon Holmes demonstrieren.

Um das biologische Saatgut vorzubereiten, beginnen Sie mit dem Wiegen von gefrorenem Hirngewebe in einem Einweg-Molkeschiffchen. Übertragen Sie dann das Gewebe in ein konisches Röhrchen, fügen Sie eiskalten Homogenisierungspuffer hinzu, so dass die endgültige Lösung 10% beträgt, um auf das Volumen zu warten, und überführen Sie die Proben in einen Kühlraum auf Eis. Stellen Sie als Nächstes eine Sonde so auf die entsprechenden Einstellungen ein und spülen Sie die Sonde beiseite und den Boden ab.

Zeigen Sie also dreimal an, wie angegeben, und wischen Sie die Sonde zwischen jeder Lösung ab. Wenn die Sonde bereit ist, tauchen Sie die Spitze in den Homogenisierungspuffer einer Probe und starten Sie das Beschallungsgerät mit insgesamt 25 Impulsen. Wenn das Gewebe vollständig in Suspension ist, schleudern Sie das Homogenat herunter und übertragen Sie das Supinat in ein sauberes Röhrchen.

Darauf achten, den Gaumen nicht zu stören. Während zahlreiche andere Homogenisierungstechniken zur Verfügung stehen, ist die Bewährungszeit für die Isolierung kleiner Mengen protio pathischer Seeds aus biologischen Proben überlegen. Die mechanische Dissoziation ermöglicht einen gleichmäßigen und effizienten Abbau des Gewebes und die anschließende Samenextraktion.

Dann aliquotieren Sie die Rückenlage und lagern die Lysate bei minus 80 Grad Celsius. Um die Biosensorzellen unter sterilen Bedingungen wiederzugeben, spülen Sie jede Zelllinie mit warmem PBS, gefolgt von einer dreiminütigen Inkubation mit Trypsin-EDTA. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit warmem Kulturmedium und überführen Sie die Zellen sofort in ein konisches Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellenreanimation und suspendieren Sie das Pellet in frischem Medium. Zählen Sie dann die Zellen und führen Sie eine Mastermix-Zellverdünnung von 3.500.000 Zellen pro 13 Milliliter Medium durch. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette langsam 130 Mikroliter der Zellen in jede Vertiefung einer mit Flachbodengewebekultur behandelten 96-Well-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die Pipettenspitzen in der Mitte der Vertiefungen platziert werden, ohne den Boden der Platte zu berühren.

Sobald die Zellen plattiert sind, lassen Sie sie 10 Minuten lang ungestört bei Raumtemperatur ruhen und inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und mindestens 80 % relativer Luftfeuchtigkeit. Am nächsten Tag, wenn die Biosensorzellen zu 60 bis 65 % konfluent sind, kombinieren Sie das reduzierte Serummedium-Liposomenreagenz und die biologische Samenquelle, um Transduktionskomplexe herzustellen. Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter Transduktionskomplex an der Seite jeder einzelnen Biosensor-Vertiefung entlang und geben Sie die behandelten Zellen für weitere 24 bis 48 Stunden in den Inkubator zurück, bevor sie geerntet werden.

Unbehandelte Zellen zeigen nur diffuse Fluoreszenz. Zellen, die mit Tau-Samenmaterial behandelt wurden, zeigen jedoch helle Aggregate. Nach ein bis zwei Tagen, um die Zellen zu ernten, ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch 50 Mikroliter Tryin EDTA und stoppen Sie die Reaktion. Nach fünf Minuten mit 150 Mikrolitern gekühlter Kultur, Medium, übertragen Sie die Zellen sofort auf eine runde Bodenplatte mit 96 Well und pelletieren Sie die Zellen, saugen Sie die S-Überstände an, ohne die Pellets zu stören, und releben Sie sie dann sanft, aber gründlich, und suspendieren Sie die Zellen 10 Minuten lang in 50 Mikrolitern 2%-Paraldehyd.

Schleudern Sie dann die Zellen wieder herunter und resuspendieren Sie die Pellets so schnell wie möglich in 200 Mikrolitern gekühltem Durchflusszytometrie-Puffer. Laden Sie die Platte nach der Fixierung auf ein bundkompatibles Durchflusszytometer und erzeugen Sie einen Seitenstreubereich im Vergleich zu einem Vorwärtsstreubereich durch Variantendiagramm. Passen Sie als Nächstes, wenn die erste Zelllinie ausgeführt wird, eine seitliche Streuung an und leiten Sie die Streuspannungen weiter, bis sich die Zellpopulation im unteren linken Quadranten befindet.

Definieren Sie dann mit dem Polygonwerkzeug die Zellpopulation als Gang P eins. Erstellen Sie nun eine Vorwärts-Streuhöhe im Vergleich zu Vorwärts-Streufläche durch Variantendiagramm und wenden Sie das P Eins-Gatter an. Definieren Sie als Nächstes die einzelnen Zellen als Gang P zwei und generieren Sie jeweils ein Histogramm.

Für die Filter C-F-P-Y-F-P und Bünde wenden Sie Gate P zwei bis drei verschiedene Histogramme an, jeweils eines für die Filter C-F-P-Y-F-P und Bünde zur Kompensation. Spike in 30 Mikrolitern der Zelllinie, eine Suspension in 200 Mikroliter der Zelllinie, zwei Suspension. Klicken Sie dann auf das Symbol für die Geräteeinstellungen, gefolgt von der Registerkarte Kompensation und der Matrix, um die Kompensationstabelle zu öffnen.

Erzeugen Sie einen Bundbereich im Vergleich zu einem CFP-Bereich durch Variatplotten und wenden Sie Gate P zwei an. Klicken Sie dann bei laufender Zelllinie eins und Zelllinie zwei auf das Quadrantensymbol und zeichnen Sie Quadranten so, dass die fluoreszierenden negativen und positiven Populationen durch die unteren beiden Quadranten getrennt sind. Erstellen Sie nun eine Statistiktabelle, die die mittlere Fluoreszenzintensität oder MFI des Bundes für die Gatter LL drei und LR drei anzeigt, und passen Sie den Bundparameter in der Kompensationsmatrix an, bis der MFI des Bundsignals ungefähr gleich zwischen LL drei und LR drei ist.

Erstellen Sie als Nächstes eine YFP-Fläche im Vergleich zu einer CFP-Fläche, indem Sie ein variables Diagramm mit Quadranten erstellen. Passen Sie den YFP-Parameter in der Kompensationsmatrix an, bis der MFI des YFP-Signals zwischen den Quadranten ungefähr gleich ist. Ähnlich wie zuvor gezeigt Für die Bund-Durchflusszytometrie.

Der primäre Fluoreszenz-Spillover tritt durch CFP auf, das in den Bunddetektionskanal emittiert wird, was durch Fluoreszenzkompensation mit den einfarbigen Positivkontrollzellen korrigiert werden kann, wenn alle Gates eingestellt und das CFP-Signal kompensiert wurde. Markieren Sie die interessierenden Bohrlöcher, und führen Sie den Rest der Platte aus, um die Daten zu analysieren. Definieren Sie zunächst die Zellen und einzelnen Zellen mit denselben Parametern, mit denen wir die Flussanalyse einrichten.

Zeichnen Sie als Nächstes mit Zelllinie drei die einzelnen positiven YFP-Zellen in einem Bund gegen YFP nach Variantendiagramm auf. Zeichnen Sie ein polygonales Gate, das entlang und weg von der Steigung der positiven Bundpopulation verläuft, um einen falschen Bundgang zu definieren, der ein Übergreifen von YFP in den Bundfilter ausschließt. Nachdem Sie den falschen Bundgang auf alle Proben angewendet haben, plotten Sie die mit leeren Liposomen behandelten C-F-P-Y-F-P-Zellen durch Variatdiagramm auf einen Bund versus CFP und führen Sie ein polygonales ga entlang der Steigung der Population ein, das sich nach oben und links von der Population weg erstreckt.

Alle Ereignisse, die sich in dieses Tor verlagern, gelten als bundpositiv, und der Prozentsatz der Zellen korreliert mit dem während der Behandlung verwendeten Seed-Titer. Notieren Sie abschließend die interessierenden Analyseparameter, einschließlich der prozentualen Positivität des Bunds und der mittleren Fluoreszenzintensität der positiven Bundzellen. Messen Sie dann das Produkt aus der prozentualen Positivität und MFI, um die integrierte Bunddichte manuell zu berechnen.

In Abwesenheit von Tau-Aggregaten oder Seeds wird Tau in einem löslichen monomeren Zustand gehalten, der durch ein konsistentes diffuses und bundnegatives Fluoreszenzsignal dargestellt wird. Nach der Einführung von Tau-Seeds in die Biosensorzellen wird endogenes Tau in eine aggregierte und bundpositive Bund-Quantifizierung umgewandelt. Die anschließende durchflusszytometrische Analyse bestätigt, dass die femtomolaren Konzentrationen von rekombinantem Tau für den Nachweis ausreichend sind. Hier.

Hirnstammgewebe von Tauopathie-Mäusen, die in unterschiedlichem Alter getötet wurden, dient als repräsentative Gehirnregion, die eine konsistente Erkennung der Aussaataktivität bei den Tieren bereits im Alter von 1,5 Monaten zeigt. In diesem Experiment zeigten homogene Gehirn-Probanden der Alzheimer-Krankheit eine robuste Seeding-Aktivität, während altersangepasste Kontroll- und Huntington-Probanden die Assay-Spezifität für Tau-Aggregate nicht zeigten, unbehandelte primäre neuronale Kulturen, die mit Tau, CFP und Tau transduziert wurden. YFP-lentivirale Konstrukte zeigten bei der Behandlung mit rekombinanten Tau-Seeds ein diffuses Fluoreszenzsignal.

Endogenes Tau bildet jedoch große Aggregate, die auch ohne Liposomen-vermittelte Transduktion mit Hilfe der Bund-Durchflusszytometrie nachweisbar sind. Wenn Samenquellen mit Arzneimitteln vorinkubiert werden, die die Tau-Aufnahme hemmen, wie z. B. Heparin, und in Abwesenheit von Liposomen behandelt werden, kann die Seeding-Aktivität, die sowohl in rekombinanten fis- als auch in Tauopathie-Mausgehirnproben enthalten ist, blockiert werden. Einmal gemeistert.

Diese Technik kann in drei Tagen durchgeführt werden, wobei jeder Tag nur ein bis zwei Stunden Arbeit am Werkbank erfordert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass für bestimmte Schritte eine interne Optimierung erforderlich ist. Zum Beispiel bei der Bestimmung wirksamer Titer aus protio pathischen Samen aus verschiedenen biologischen Quellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Bunddurchflusszytometrie-Experimente einrichten, durchführen und analysieren, um die protio pathische Seeding-Aktivität aus rekombinanten und biologischen Quellen nachzuweisen.