Иммунофлуоресцентное окрашивание, конфокальная визуализация и 3D-реконструкция синоатриального и атриовентрикулярного узла у мыши

Этот протокол объясняет необходимые шаги для выполнения микродиссекции, иммунофлуоресцентного окрашивания и микроскопии специально для синусового узла и AV-узла у мыши. Методология цельного монтирования выгодна для решения точной 3D-локализации и морфологии синуса и AV-узла, а также для изучения взаимосвязи с окружающими тканями. Морфология тканей в значительной степени сохраняется с минимальным обезвоживанием и физическим разрывом тканей.

Для начала проколите сердце иглой 27 калибра в области верхушки, осторожно протолкнув иглу в левый желудочек и осторожно введя от пяти до 10 миллилитров ледяного PBS для обильного сердца. Осторожно поднимите сердце с помощью пинцета и разрежьте крупные сосуды, чтобы удалить сердце. Поместите сердце в диссекционную чашку, наполненную ледяным PBS, под микроскопом для препарирования.

После определения ориентации сердца переверните сердце так, чтобы передняя часть сердца оказалась на дне посуды. Обездвижите сердце, вставив маленькие булавки через верхушку и придаток предсердия в агарозу на дне чашки для вскрытия. С помощью тонкого пинцета и ножниц осторожно удалите несердечную ткань вокруг верхней и нижней полой вены.

Чтобы обнажить междустрочную область, удалите большую часть желудочков, разрезав параллельно борозде между желудочками и предсердиями с помощью микроножниц. Для фиксации и обезвоживания поместите образец в 4% параформальдегид на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день переведите сердце в 15%-ный раствор сахарозы и инкубируйте его в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия.

После инкубации переведите сердце в 30%-ный раствор сахарозы еще на 24 часа при температуре четыре градуса Цельсия. Промойте сердце в 1% Тритоне Х-100, разведенном в PBS. Затем заблокируйте и пропитайте его в блокирующем растворе на ночь при четырех градусах Цельсия.

Поместите сердце в пробирку объемом 1,5 миллилитра и инкубируйте его с кроличьим антимышиным антителом Connexin 43 и крысиными антителами против мыши HTN4, разведенными блокирующим раствором, в течение семи дней при четырех градусах Цельсия. Через семь дней удалите раствор, содержащий первичные антитела, с помощью пипетки. Промойте сердце 1% раствором Triton X-100 три раза в течение одного часа за промывание на орбитальном шейкере.

Повторите этапы промывания после инкубации вторичными антителами и DAPI. Подготовив пластиковые кольца и наполнив их пластилином, поместите сердечко в пластилиновую канавку тыльной стороной сердца вверх. Определите САН, которая расположена на дорсальной стороне сердца с межкавальной областью.

Добавьте PBS в сердце, чтобы вытеснить весь воздух в полости до тех пор, пока сердце полностью не будет покрыто PBS. Нанесите силикон на края пластикового кольца. Аккуратно вдавите окружающую часть образца в пластилин для фиксации сердца и накройте сердце покровным листом.

Затем осторожно нажмите на тыльную сторону пластилина, чтобы выдавить часть PBS, и прикрепите сердце к защитному листу, стараясь избежать пузырьков воздуха в области визуализации. Поместите целые образцы окрашивания вверх ногами на платформу конфокального микроскопа и продолжайте визуализацию, как описано в текстовой рукописи. Параметры для каждого канала конфокального микроскопа задаются с помощью соответствующего программного обеспечения.

Этот протокол был использован для выполнения конфокальной микроскопии как синоатриального узла, так и атриовентрикулярного узла в сердцах мышей. Специфическое окрашивание проводящей системы и рабочего миокарда флуоресцентными антителами, нацеленными на HCN4 и Connexin 43 соответственно, позволяет идентифицировать синоатриальный узел и атриовентрикулярный узел в пределах интактной анатомии. Этот протокол окрашивания позволяет изучать взаимодействие различных типов клеток с использованием различных антител.