Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Die Befestigung von Ports zur Verbindung mit Spritzen mit Schläuchen ist von entscheidender Bedeutung, da es bei richtiger Ausführung keine Lecks gibt, es keine Blasen in der Durchflusszelle gibt und Experimente wiederholt mit derselben Flusszelle über einen Zeitraum von einem Jahr mit sorgfältigem Gebrauch durchgeführt werden können. Hier werden zwei einfache Methoden vorgestellt, um die Steckverbinder an Durchflusszellen zu befestigen. Diese sind einfach, reproduzierbar und ermöglichen es dem Forscher, die Flusszelle ohne großen Aufwand an seine Bedürfnisse anzupassen.

Die Verwendung dieser Flusszellen erfolgte unter Berücksichtigung von Einzelmolekülexperimenten. Insbesondere das, was wir visuelle Biochemie nennen, aber sie können in jeder Studie verwendet werden, in der Mikrofluidik erforderlich ist, und in Situationen, in denen Lamina-Flüssigkeitsfluss verwendet werden soll. Um Fehler zu vermeiden, würde ich vorschlagen, anstatt wertvolle Flusszellen zu verwenden, um die Techniken zu etablieren, zuerst auf einem Glasobjektträger oder einem Deckschein zu üben.

Auf diese Weise kann man ein Gefühl für das Glas oder die PDMS-Materialien bekommen, um zu wissen, wie man damit umgeht und wie viel Kraft beim Einsetzen von Schläuchen oder Kleben der Steckverbinder angewendet werden muss. Dazu müssen einige Anschlüsse geopfert werden, aber sie sind viel billiger als die Flusszellen. Beginnen Sie, indem Sie die Durchflusszelle auf eine saubere, ebene Oberfläche legen.

Halten Sie den PTFE-Schlauch drei Millimeter vom freien Ende mit einer Pinzette und schieben Sie den Schlauch in den Anschluss. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Ports. Verbinden Sie die Einlassöffnungen mit der Spritzenpumpe und den Auslass mit einer Abfallflasche.

Füllen Sie jede Glasspritze mit einem Milliliter spektrophotometrischem Methanol und befestigen Sie sie an einem Schaltventil. Stellen Sie sicher, dass das Ventil den Auslass auf Abfall gerichtet hat, und spülen Sie jede Leitung mit 50 Mikrolitern Methanol. Schalten Sie die Auslassposition auf die Durchflusszelle und pumpen Sie 800 Mikroliter Methanol mit einer Durchflussrate von 100 Mikrolitern pro Stunde durch die Durchflusszelle, um die Oberflächen zu benetzen und Blasen zu beseitigen.

Am nächsten Tag wiederholen Sie diesen Vorgang mit 800 Mikrolitern Reinstwasser. Die Durchflusszelle ist nun einsatzbereit. Wenn Einpressschlauchverbinder verwendet werden sollen, entfernen Sie vorsichtig das Klebeband von einer Seite des Steckers und legen Sie es über das Loch im Objektträger.

Drücken Sie einige Sekunden lang nach unten. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Konnektoren. Stellen Sie die Durchflusszelle dann auf eine saubere, ebene Oberfläche.

Halten Sie den PTFE-Schlauch drei Millimeter vom freien Ende entfernt und schieben Sie den Schlauch in das Loch im Anschluss. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Ports. Befestigen Sie die Schläuche von den Einlässen an den Schaltventilen.

Platzieren Sie den Aufsatz entweder auf einer sauberen, ebenen Oberfläche oder auf einem speziell angefertigten Verteiler, um die Durchflusszelle und die Anschlüsse während der Verklebung an Ort und Stelle zu halten. Platzieren Sie die Durchflusszelle auf dem vertieften Abschnitt des Verteilers, legen Sie dann eine kleine Menge Glaskleber auf den Boden der Baugruppe und setzen Sie die Dichtung ein. Positionieren Sie den Nanoanschluss über einem der Eintrittslöcher auf dem Objektträger.

Drücken Sie vorsichtig nach unten und halten Sie es ohne seitliche Bewegung fest. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Ports. Im Krümmer trocknen lassen oder festklemmen.

Entfernen Sie die Durchflusszelle vorsichtig aus dem Verteiler und stellen Sie sicher, dass die Baugruppen gut an den Eingangsöffnungen in der Durchflusszelle ausgerichtet sind. Stellen Sie eine Durchflusszelle auf den Mikroskoptisch und befestigen Sie den Schlauch mit den fingerfesten Steckern. Füllen Sie jede Glasspritze mit einem Milliliter spektralphotometrischem Methanol.

Befestigen Sie jede Spritze an einem Schaltventil. Stellen Sie sicher, dass das Ventil den Auslass auf Abfall gerichtet hat, und spülen Sie jede Leitung mit 50 Mikrolitern Methanol. Schalten Sie die Auslassposition auf die Durchflusszelle und pumpen Sie 800 Mikroliter Methanol mit einer Durchflussrate von 100 Mikrolitern pro Stunde durch die Durchflusszelle.

Am nächsten Tag wiederholen Sie diesen Vorgang mit 800 Mikrolitern Reinstwasser. Die Messung der Ausgangsleistung ist hier dargestellt. Die Leistungsabgabe des Lasers wird gemessen, bevor der Laserkopf in das optische Layout eingebaut wird.

Sobald die Fallenausrichtung abgeschlossen ist, wird die Strahlleistung nach dem 100-fach-Objektiv für jede Falle gemessen. Die Bilder zeigen den stabilen optischen Einfang von ein Mikrometer fluoreszierenden Perlen. Hier ist F eine feste Falle und M eine mobile Falle.

Mit der mobilen Falle im Scan-Modus, die sich mit 30 Hertz durch einen kleinen oder großen Kreis bewegt. Der Flüssigkeitsfluss innerhalb der Durchflusszelle ist laminar. Das Schema zeigt die Durchflusszelle von oben, um zu zeigen, dass die Zwischenkanaldiffusion die Hauptquelle für die Vermischung zwischen den benachbarten Flüssigkeitsströmen ist.

Blaue Pfeile zeigen die Fließrichtung an und die einzelnen Bäche sind farbig, weiß, hellgrau und weiß. Die sich erweiternden Bereiche der Querdiffusion zwischen den Kanälen sind rot dargestellt. Der Einschub zeigt ein Fluoreszenzbild der benachbarten Flüssigkeitsströme bei 10-facher Vergrößerung mit fluoreszierend markierten DNA-Perlenkomplexen im unteren Strom und Puffern nur im oberen Strom.

Die weißen Flecken im oberen Strom sind Aufnahmerauschen der CCD-Kamera. Das Strömungsprofil und die laminaren Strömungszellen sind parabolisch. Die Durchflusszelle wird von der Seite betrachtet und die Richtung der Strömung wird über jeder Zelle angezeigt.

Die lineare Raupengeschwindigkeit wird durch die Pumpgeschwindigkeit und die Saccharosekonzentration beeinflusst. Die Gegenkraft auf eine Perle wird durch die Lösungsviskosität beeinflusst. Der Raupendurchmesser beeinflusst die Kraft auf Perlen unter Strömung.

Stellen Sie bei diesem Verfahren sicher, dass der Bereich, in dem Sie arbeiten, sauber ist und dass Sie die Glasoberflächen mit spektrometrischem Methanol oder Aceton gereinigt haben. In diesem Stadium sollten Sie eine Durchflusszelle haben, die zu Ihrer Spritzenpumpe gemacht wird, und Sie sind jetzt bereit, Ihre Lösungen vorzustellen und mit optischen Pinzettenexperimenten zu beginnen. Die Verwendung von Flusszellen, die über längere Zeiträume verwendet werden können, hat es den Forschern ermöglicht, eine Vielzahl von Einzelmolekülreaktionen zu untersuchen, bei denen entweder Kräfte gemessen, Reaktionen durch Fluoreszenz oder eine Kombination aus beidem sichtbar gemacht werden.