Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

Die D-Loop-Capture- und Extension-Assays sind die ersten, die eine unvoreingenommene und direkte Quantifizierung der D-Loop-Formations- und Extensionsschritte während der homologen Rekombination in mitotisch wachsenden Hefezellen ermöglichen. Diese lebensfähigkeitsunabhängige Technik ermöglicht die Untersuchung von Proteinen im D-Loop-Stoffwechsel, die sonst nicht von späteren Rollen gelöst werden könnten, wenn man nur BIR-Produkte betrachtet. In Zukunft stellen wir uns vor, diese Assays auf menschliche Zellen zu übertragen, um die Rolle von Schlüsselproteinen, einschließlich BRCA2 und den Bloom- und Warner-Kilo-Fällen bei der homologen Rekombination, besser zu verstehen.

Beginnen Sie mit dem Zentrifugieren der Proben für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 Milliliter 1x Psoralenlösung und geben Sie es in eine 60 x 15 Millimeter große Petrischale. Für keine Vernetzungskontrolle resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 Milliliter TE1-Lösung.