Name: Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Lernen Sie die Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung phosphorylierter RIPK3 und MLKL in menschlichen HT-29-Zellen nach HSV-1-Infektion. Diese Methode ermöglicht die robuste und reproduzierbare Detektion entscheidender Nekroptose-Marker.

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Wir danken dem VIB Bioimaging Core für die Schulung, den Support und den Zugang zum Instrumentenpark. J.N. wird durch ein Doktorandenstipendium der Forschungsstiftung Flandern (FWO) unterstützt. Die Forschung in der J.M.-Gruppe wurde durch ein Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), ein Junior Research Grant (G031022N) der Research Foundation Flanders (FWO), ein CRIG Young Investigator Proof-of-Concept Grant und die Universität Gent unterstützt. Die Forschung in der P.V.-Gruppe wurde von EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO Senior Research Grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG und GIGG Konsortien und VIB unterstützt.

1. Herstellung von biotinyliertem Tyramid
<ol><li>Biotinyliertyramid ausgehend von Biotin-Tyramid herstellen. Um eine 10 mM Stammlösung herzustellen, lösen Sie 3,6 mg Biotin-Tyramid in 1 ml DMSO. Lagern Sie das gelöste Produkt aliquot bei −20 °C, um die Qualität zu erhalten.</li>
</ol>2. Aufrechterhaltung von HT-29-Zellen in Kultur
HINWEIS: ZBP1-exprimierende HT-29 wurden durch Transduktion mit einem Lentivektor27 erzeugt, der für humanes ZBP1 kodiert.
<ol><li>Halten Sie ZBP1-exprimierende HT-29-Zellen in McCoys 5A-Medium, ergänzt mit L-Glutamin, Natriumpyruvat und 10% fötalem Rinderserum (im Folgenden als Vollmedium bezeichnet) und halten Sie in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% Kohlendioxid. Verwenden Sie idealerweise Zellen mit einer niedrigen Durchgangszahl (kleiner als 10). Lassen Sie die Zellen mindestens 5 Tage nach dem Auftauzyklus vor Beginn des Experiments ruhen.</li>
	<li>Um die Zellen aus dem Kulturkolben zu lösen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 5 mL PBS (vorgewärmt auf 37 °C). Als nächstes wird die entsprechende Menge Trypsin/EDTA (0,05 % Trypsin bzw. 0,032 % EDTA, auf 37 °C vorgeheizt) in die Zellen gegeben (2 ml für einen T75-Kolben, 3 ml für einen T175-Kolben).</li>
	<li>Die Zellen mit Trypsin/EDTA bis zu 10 min in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Klopfen Sie anschließend auf den Kolben und überprüfen Sie visuell, ob sich die Zellen mit einem Mikroskop mit 4-facher Objektivvergrößerung vom Kolben gelöst haben.</li>
	<li>Wenn sich die Zellen nicht vollständig abgelöst haben, inkubieren Sie weitere 5 Minuten bei 37 °C. Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 6 ml volles Medium in den Kolben geben.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem trypanblauen Färbstoff, um die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Eine Verdünnung von 1:5 wird empfohlen. Fahren Sie nur mit dem Experiment fort, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen 90% übersteigt.</li>
</ol>3. Beginn des Experiments, Aussaat und Stimulation der Zellen
<ol><li>Säen Sie 90.000 ZBP1-exprimierende HT-29-Zellen in vollem Medium in einer 1 cm² großen Oberflächenvertiefungsplatte, die eine High-End-Mikroskopie ermöglicht. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 μL pro Vertiefung.</li>
	<li>Die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Beachten Sie, dass einige zusätzliche Vertiefungen für Färbekontrollen ausgesät werden müssen, was in Schritt 5.6 ausführlicher erläutert wird.</li>
	<li>Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70% -80% erreichen, fügen Sie den Zellen einen nekrodose-induzierenden Reiz hinzu. Hier wurden die Zellen mit HSV-1 ICP6mutRHIM (Multiplicity of infection [MOI] of 5, defined as plaque forming units (pfu) dividiert durch die Anzahl der Zellen; die pfu wurde mit einem Plaque-Assay an Vero-Zellen quantifiziert) für 6 h, 8 h oder 10 h infiziert.</li>
	<li>Als Positivkontrolle für die Nekroptose-Induktion stimulieren Sie die Zellen für 4 h mit einem Nekroptose-induzierenden Cocktail, der 30 ng/ml TNF, 20 μM des Pan-Caspase-Inhibitors zVAD-fmk und 5 μM des SMAC-Mimetikums BV6 enthält.</li>
	<li>Als Negativkontrolle für die p-RIPK3 (S227)-Färbung ist GSK'840 (1 μM) enthalten, um die RIPK3-Kinaseaktivität zu hemmen und die Autophosphorylierung von S227 zu verhindern. Idealerweise fügen Sie den Inhibitor in einem unbehandelten Zustand und nach Nekroptose-Stimulation hinzu. Der Inhibitor kann gleichzeitig mit einer Virusinfektion hinzugefügt werden.</li>
	<li>Die Stimulationen in vollem Medium, vorgeheizt auf 37 °C, vorbereiten. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 μL pro Vertiefung für alle Stimulationen.</li>
</ol>4. Fixieren der Zellen
<ol><li>Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 200 μL 1x PBS. Dann 150 μL 4% PFA (bereits bei Raumtemperatur ausgeglichen) in die Zellen geben und bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren. HINWEIS: Wenn Sie Zellen verwenden, die sich leicht lösen lassen, kann die Fixierung der Zellen wie folgt optimiert werden. Entfernen Sie 100 μL Medium aus der Vertiefung, so dass ein Volumen von 100 μL auf der Platte verbleibt. Fügen Sie 100 μL 4% PFA zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur. Anschließend entfernen Sie das Medium/Fixiermittel aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch 150 μL 4% PFA. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur, um eine vollständige Fixierung der Zellen zu gewährleisten.</li>
	<li>Nach der Fixierung die 4% PFA entfernen und die Zellen 3x mit 200 μL 1x PBS waschen. Die Proben können in einem Überschuss (>200 μL) von 1x PBS bei 4 °C über Nacht bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden.</li>
</ol>5. Permeabilisierung und Primärfärbung
<ol><li>Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 100 μL Permeabilisierungspuffer hinzu (0,5% Triton X-100 in PBS). Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie anschließend die Vertiefungen mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Inkubieren Sie die Bildgebungskammer mit Waschpuffer für 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler (20-30 Schaukelbewegungen pro Minute).</li>
	<li>Um eine unspezifische Bindung von primären Antikörpern zu verhindern, fügen Sie 100 μL Sperrmedium hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2 h. Alternativ kann dieser Blockierungsschritt durch eine Blockierung mit 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur ersetzt werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Vertiefungen 3x mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.</li>
	<li>Nach dem Entfernen des Waschpuffers die primären Antikörper in die Bildgebungskammer geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Verwenden Sie ein Endvolumen von 100 μL, um die Vertiefung abzudecken. Während der nächtlichen Inkubation bei 4 °C stellen Sie die Bildgebungskammer nicht auf einen kippbaren Laborshaker. HINWEIS: Anti-p-MLKL (S358; Verdünnung: 1:200) und Anti-p-RIPK3 (S227; Verdünnung: 1:200) teilen Kaninchen als Wirtsart und sollten daher nicht in einer Vertiefung kombiniert werden. Um die Virusinfektion zu überwachen, kombinieren Sie einen primären Antikörper gegen ein virales Protein Ihrer Wahl mit p-MLKL (S358) oder p-RIPK3 (S227). Hier wurden die Zellen mit einer HSV-1-Infektion infiziert, gefolgt von einer ICP0-Färbung (Verdünnung: 1:50, Wirtsspezies: Maus).</li>
	<li>Berücksichtigen Sie an dieser Stelle die notwendigen Färbekontrollen. Geben Sie immer eine Bedingung ohne primäre Antikörper an, um den potenziellen Hintergrund des TSA-Amplifikationsschritts zum Festlegen der Maskierungsschwelle zu visualisieren (siehe Schritt 9). HINWEIS: Im Falle eines Co-Färbeprotokolls (z. B. Kombination von p-MLKL [S358] oder p-RIPK3 [S227] mit einem Antikörper gegen ein virales Protein) verwenden Sie auch einzelne Färbungen. Die Verwendung einzelner Färbungen ist wichtig, um ein potenzielles Durchblutungssignal in anderen Bildgebungskanälen zu korrigieren.</li>
</ol>6. Tyramid-Signalverstärkung (TSA)
<ol><li>Entfernen Sie die primäre Antikörpermischung und waschen Sie die Vertiefungen 3x mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 100 μL HRP-markierten sekundären Antikörper hinzu, um die Art des primären Antikörpers zu erkennen, der amplifiziert werden muss. Um das p-RIPK3 (S227) oder p-MLKL (S358) Signal zu verstärken, fügen Sie 100 μL Anti-Kaninchen-HRP hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborshaker. HINWEIS: Nur p-MLKL (S358) oder p-RIPK3 (S227) wird verstärkt. Die Färbung eines viralen Proteins wird mit einer indirekten Standardfärbemethode visualisiert.</li>
	<li>Anschließend waschen Sie die Vertiefungen 3x mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.</li>
	<li>In den nächsten Schritten fügen Sie das biotinylierte Tyramid zur mikroskopischen Platte hinzu. Unter Verwendung der HRP-Gruppe, die an die sekundären Antikörper gekoppelt ist, löst die enzymatische Reaktion die Bildung von Tyramidradikalen in unmittelbarer Nähe des primären Ziels aus (hier p-MLKL [S358] oder p-RIPK3 [S227]).</li>
	<li>Um die enzymatische Aktivität von HRP zu aktivieren, fügen Sie ein oxidierendes Substrat zusammen mit dem biotinylierten Tyramid hinzu. Um dies zu erreichen, ergänzen Sie den TSA-Puffer (0,1 M Borsäure [pH 8,5]) mit 0,03 MH2O2; Insbesondere nehmen Sie 5 ml TSA-Puffer und fügen Sie 5 μL 30%H2O2hinzu.</li>
	<li>Verdünnen Sie nun das Biotin-Tyramid in H2O2-ergänztem TSA-Puffer im Bereich von 1:1.000 bis 1:20.000. HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor des Biotin-Tyramids muss pro Charge optimiert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Vertiefungen und geben Sie verdünntes Biotin-Tyramid zu den Vertiefungen auf ein Endvolumen von 100 μL. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 min auf einem kippbaren Laborschüttler.</li>
	<li>Als nächstes waschen Sie die Vertiefungen 3x mit 100 μL Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.</li>
</ol>7. Fluorophore
HINWEIS: Da das Signal des primären Antikörpers in eine Biotin-Gruppe umgewandelt wird, werden p-MLKL (S358) und p-RIPK3 (S227) mit Streptavidin sichtbar gemacht, das an ein Fluorophor gekoppelt ist (Fluorophor 568, Verdünnung: 1:500). Zusätzlich werden die Kerne mit DAPI (5 μg/ml) angefärbt. Wenn ein virales Protein im Färbeprotokoll enthalten ist, fügen Sie einen geeigneten fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper gegen die Wirtsspezies Ihres primären Antikörpers hinzu. In den repräsentativen Ergebnissen wurde ein Maus-Anti-ICP0 verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde Ziegen-Maus-Anti-Maus gekoppelt an Fluorophor 633 (Verdünnung: 1:1.000) eingeschlossen.
<ol><li>Stellen Sie die Färbemischung in Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS) her, der die oben genannten Antikörper und Flecken enthält. Entfernen Sie den Waschpuffer, fügen Sie 100 μL Färbemischung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde auf einem kippbaren Laborschüttler. Halten Sie die Bildkammer ab diesem Schritt lichtgeschützt.</li>
	<li>Als nächstes waschen Sie die Vertiefungen 2x mit Waschpuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Die Waschschritte 5 min bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler inkubieren.</li>
	<li>Zum Schluss spülen Sie die Vertiefungen 2x mit 1x PBS ab. Lagern Sie die Proben in einem Überschuss (> 200 μL) von 1x PBS bis zur Bildgebung. Alternativ können Sie die Proben in Montagemedium tauchen, um die Färbung zu erhalten. Die Bildgebungskammer kann nun auf einem konfokalen Mikroskop visualisiert werden.</li>
</ol>8. Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop
<ol><li>Schalten Sie das konfokale Mikroskop und die Laser mindestens 10 Minuten vor der Bildgebung ein.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Immersionsobjektiv für die Empfindlichkeit. Verwenden Sie vorzugsweise eine 40- oder 63-fache Objektivvergrößerung. Reinigen Sie vor der Bildgebung die Tauchobjektive mit einem Linsenreiniger mit geeigneten Wattebällchen. Verschmutzte Objektive (z. B. durch Staub) können zu Bildern mit geringerer Qualität führen.</li>
	<li>Legen Sie eine überschüssige Menge Öl auf den Boden der Bildkammer. Fügen Sie zusätzlich einen Tropfen Öl auf das Ziel Ihrer Wahl hinzu.</li>
	<li>Stellen Sie die Bildgebungskammer auf das Mikroskop. Finden Sie das Fokusfeld mit DAPI-Färbung oder Hellfeld-Bildgebung. Bewegen Sie sich bei Bedarf in der Bildgebungskammer, um eine ordnungsgemäße Verteilung des Tauchöls sicherzustellen.</li>
	<li>Richten Sie die erforderlichen Bildgebungsspuren am Mikroskop ein. Je nach Mikroskop können die folgenden Schritte variieren (Tabelle 1). HINWEIS: Wenn Sie die Bildgebungsspuren einrichten, programmieren Sie die Spuren so, dass die Kernfärbung zuletzt gemessen wird. Der 405-nm-Laser kann zum Photobleaching und damit zum Verlust eines spezifischen Signals in allen Kanälen beitragen.</li>
	<li>Um eine vollständige Zelle auf das Vorhandensein von p-RIPK3 (S227) oder p-MLKL (S358) zu analysieren, messen Sie z-Stacks, die sich über die Höhe der Zelle erstrecken. Hier wurden die Z-Stacks aus 40 Slices alle 0,16 μm hergestellt, woraus sich ein Bereich von 6,22 μm ergibt.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Spur</td>
			<td>Laser</td>
			<td>Strahlteiler</td>
			<td>Filter</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)</td>
			<td rowspan="2">561</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 570-620 + LP645</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS SP615</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Virales Gen: ICP0</td>
			<td rowspan="2">633</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + LP605</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS LP570</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Kern: DAPI</td>
			<td rowspan="2">405</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + BP 495-550</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Bildgebungsspuren für die Zellvisualisierung.
9. Datenanalyse und Quantifizierung
<ol><li>Laden Sie die mikroskopischen Bilder in die Software hoch. Verwenden Sie den erweiterten Fokus, um alle Informationen des Z-Stacks in einem 2D-Bild zu visualisieren.</li>
	<li>Als nächstes programmieren Sie das Analyseprotokoll, um die folgenden Informationen zu extrahieren: die Anzahl der Zellen pro Bild, die Summe der Voxel, die p-RIPK3 (S227)+ oder p-MLKL (S358)+ Färbung zeigen. Ein Voxel stellt ein dreidimensionales Volumen dar, definiert als das dreidimensionale Äquivalent eines Pixels.</li>
	<li>Um die Anzahl der Zellen pro Bild zu quantifizieren, segmentieren Sie den Kern. Um das Rauschen in den Segmentierungsergebnissen zu reduzieren, fügen Sie der Segmentierung eine Größenbeschränkung hinzu (>100 μm³). Die Anzahl der segmentierten Kerne stellt die Anzahl der Zellen im Bild dar.</li>
	<li>Um die Menge an p-RIPK3 (S227)+ oder p-MLKL (S358)+ Voxeln zu quantifizieren, programmieren Sie eine schwellenwertbasierte Segmentierung. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass in den Bildern ohne primäre Antikörper (NP) kein Signal aufgenommen wird.</li>
	<li>Passen Sie den Schwellenwert weiter an, indem Sie die Bilder aus dem unbehandelten Scheinzustand verwenden. Um eine empfindliche Detektion des Signalanstiegs aufgrund der Nekroptosestimulation zu gewährleisten, begrenzen Sie die Aufnahme von p-RIPK3 (S227)+ oder p-MLKL (S358)+ Voxeln unter simulierten Bedingungen, indem Sie einen höheren Schwellenwert festlegen. Überprüfen Sie immer das programmierte Analyseprotokoll in mehreren Bildern von der simulierten Bedingung und Nekroptose-induzierenden Virusinfektion.</li>
	<li>Führen Sie die Analyse für alle Image-Sets aus. Exportieren Sie die Voxelquantifizierung und Kernsegmentierung in eine .txt Datei zur weiteren Verarbeitung in Tabellenkalkulationssoftware.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Pivot-Tabelle der Daten, die den Bildnamen, die Kernquantifizierung und die Summe der erkannten Voxel anzeigt.</li>
	<li>Als nächstes teilen Sie die Summe der positiven Voxel durch die Anzahl der Zellen im Bild. Daraus ergibt sich ein relativer Wert positiver Voxel pro Zelle. Um die Faltenzunahme zu visualisieren, dividieren Sie den relativen Wert von p-RIPK3 (S227)+ oder p-MLKL (S358)+ Voxel pro Zelle durch den Median des unbehandelten Zustands (mock).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll beschreibt die Verwendung von Tyramid-Signalamplifikation (TSA), um die Empfindlichkeit für Signalereignisse des menschlichen nekrtotischen Signalwegs zu erhöhen, die schwer zu erkennen sind, einschließlich der Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL26. Die Einbeziehung eines TSA-Schritts verbessert signifikant die Nachweisschwelle von p-RIPK3 (S227) und p-MLKL (S358) und erhöht die Empfindlichkeit der p-MLKL (S358) Dehnung. TSA enthüllte ein p-RIPK3 (S227) -Sign...

Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 3 (RIPK3) und Mixed Lineage Kinase Domain-like (MLKL) sind zentrale Regulatoren des nekroptotischen Zelltods 1,2. Nekroptose ist eine lytische und entzündliche Form des regulierten Zelltods, die an der antiviralen Immunität und Autoentzündung beteiligt ist. Die Nekroptose von virusinfizierten Zellen stoppt sofort die Virusreplikation. Die Zelllyse nach Nekroptose-Induktion setzt auch schadensassoziierte molekulare Muster frei, die die antivirale Immunität stimulieren 3,4. Die Nekroptose wird durch die Aktivierung von RIPK3 nach RIP homotypic interaction motif (RHIM)-vermittelten Interaktionen mit einem von drei vorgeschalteten aktivierenden Molekülen eingeleitet: RIPK1 (bei TNF-Rezeptor 1 [TNFR1]-Engagement), TIR-Domänen-enthaltendes adapterinduzierendes Interferon-β (TRIF; bei Toll-like-Rezeptor-3- und 4-Engagement) oder dem antiviralen Nukleinsäuresensor Z-DNA-bindende Protein 1 (ZBP1)1,2 . Die Nekroptose-Signalisierung verläuft durch eine Reihe von Phosphorylierungsereignissen, beginnend mit der Autophosphorylierung von RIPK3. Die Autophosphorylierung von humanem RIPK3 an Serin (S)227 innerhalb seiner Kinasedomäne ist eine Voraussetzung für die Nekroptose, indem sie die Interaktion mit MLKL ermöglicht und wird üblicherweise als biochemischer Marker für die Aktivierung von humanem RIPK3 und den nekroptischen Zelltod verwendet 1,5. Nach der Aktivierung phosphoryliert RIPK3 die Aktivierungsschleife von MLKL an Threonin (T)357 und S3581. Dies führt zu einer Änderung der MLKL-Konformation, was zu einer Exposition der N-terminalen Vier-Helix-Bündeldomäne führt. MLKL oligomerisiert dann und transportiert zur Zellmembran, wo es durch das Einführen der exponierten vier Helixbündel in die Lipiddoppelschicht eine Pore bildet, was schließlich zum Zelltod führt 2,6.
ZBP1 ist ein antiviraler Nukleinsäuresensor, der linkshändige Z-Form-Nukleinsäuren einschließlich doppelsträngiger RNA in der Z-Konformation (Z-RNA) erkennt. Die Z-RNA-Bindung erfolgt über zwei Zα-Domänen, die am N-Terminus von ZBP1 positioniert sind. Es wird angenommen, dass Z-RNA, die sich während einer RNA- und DNA-Virusinfektion ansammelt, ZBP1 7,8 direkt angreift. Aktiviertes ZBP1 rekrutiert RIPK3 durch seine zentralen RHIMs und induziert einen regulierten Zelltod, einschließlich Nekroptose 9,10. Viren haben zahlreiche Fluchtmechanismen angenommen, um der ZBP1-induzierten Wirtszellnekroptoseentgegenzuwirken 11. Zum Beispiel beherbergt die Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) Ribonukleotid-Reduktase-Untereinheit 1, bekannt als ICP6 und kodiert durch UL39, RHIM an seinem N-Terminus, der die ZBP1-vermittelte RIPK3-Aktivierung in menschlichen Zellenstört 12,13,14,15. ZBP1 schränkt nicht nur die Virusreplikation ein, sondern Mausstudien haben gezeigt, dass die ZBP1-Aktivierung entzündliche Erkrankungen verursacht und die Krebsimmunität stimuliert 16,17,18,19,20,21. Protokolle, die Signalereignisse erkennen, die während der ZBP1-induzierten Nekroptose in menschlichen Zellen auftreten, sind daher wertvoll, um die Rolle von ZBP1 in diesen Prozessen zu beurteilen.
Die Tyramid-Signalamplifikation (TSA), auch als katalysierte Reporterabscheidung (CARD) bezeichnet, wurde entwickelt, um die Nachweisgrenze und das Signal-Rausch-Verhältnis in Antikörper-basierten Immunoassays zu verbessern. Während der TSA kann jeder primäre Antikörper verwendet werden, um das interessierende Antigen nachzuweisen. Meerrettichperoxidase (HRP), gekoppelt an einen sekundären Antikörper, katalysiert den lokalen Aufbau von biotinylierten Tyramidradikalen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid. Diese aktivierten Biotin-Tyramid-Radikale reagieren dann mit proximalen Tyrosinresten zu kovalenten Bindungen. Mögliche Tyramid-Biotin-Substrate umfassen das Antigen selbst, die primären und sekundären Antikörper und benachbarte Proteine. Während TSA die Empfindlichkeit des Assays signifikant verbessert, geht ein Teil seiner räumlichen Auflösung verloren. In einem letzten Schritt werden Biotinmoleküle mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin nachgewiesen. Die HRP-Reaktion lagert viele Tyramid-Biotin-Moleküle auf oder in der Nähe des interessierenden Antigens ab. Dies erhöht die Anzahl der Streptavidin-Fluorochrom-Bindungsstellen erheblich, wodurch die Empfindlichkeit des Assays stark verstärkt wird (Abbildung 1). Alternativ kann Tyramid direkt an ein Fluorochrom gekoppelt werden, wodurch die Notwendigkeit von Streptavidin-gekoppelten Fluorophoren entfällt. Proteinimmunhistochemie und DNA/RNA in situ Hybridisierung gehörten zu den ersten Methoden, bei denen TSA zur Verbesserung der Signalintensitäten eingesetzt wurde22,23. In jüngerer Zeit wurde TSA mit intrazellulärer Durchflusszytometrie24 und Massenspektrometrie25 kombiniert.
Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Nachweis von Serin 227 phosphoryliertem humanem RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) und phosphoryliertem humanem MLKL (p-MLKL [S358]) nach Aktivierung von ZBP1 durch HSV-1-Infektion mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Wir verwenden eine nekroptosesensitive HT-29 humane kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie, die transduziert wurde, um menschliches ZBP1 stabil zu exprimieren. Diese Zellen wurden mit einem HSV-1-Stamm infiziert, der ein mutiertes ICP6-Protein (HSV-1 ICP6mutRHIM) exprimierte, in dem vier Kernaminosäuren innerhalb des viralen RHIM (VQCG) durch Alanine (AAAA) ersetzt wurden, wodurch das ICP6 nicht in der Lage war, die ZBP1-vermittelte Nekroptosezu blockieren 13,14,15. Um das Problem des niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses der derzeit kommerziell verfügbaren Antikörper gegen p-RIPK3 und p-MLKL bei der Immunfärbung26 zu überwinden, führen wir einen Tyramid-Signalamplifikationsschritt (TSA) durch (Abbildung 1), der zum robusten Nachweis von humanem p-RIPK3 (S227) führt und die Detektionsempfindlichkeit von humanem p-MLKL (S358) um eine Größenordnung verbessert.

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen HRP</td><td>Agilent Technologies Belgium</td><td>K4002</td><td>Envision+ System-HRP Markiertes Polymer Anti-Kaninchen-Kaninchen Anti-Kaninchen</td></tr><tr><td>Anti-Maus DyLight 633</td><td>Thermofisher</td><td>35513</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>HSV-1 ICP0</td> Santa <td>Cruz</td><td>sc-53070</td><td>Maus Anti-ICP0 (HSV-1) Antikörper</td></tr><tr><td>IAV-PR8 Mausserum</td><td>Inhouse-Produktion</td><td>xx</td><td>Maus anti-IAV-PR8 polyklonaler Antikörper</td></tr><tr><td>pMLKL</td><td>Abcam</td><td>ab187091</td><td>Kaninchen anti-MLKL-phospho S358 Antikörper</td></tr><tr><td>pRIPK3</td><td>Abcam</td><td>ab209384</td><td>Kaninchen anti-RIPK3-phospho S227 Antikörper</td></tr><tr><td>Fluorophore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D21490</td><td>Zur Visualisierung des Zellkerns</td></tr><tr><td>Streptavidin gekoppelt an Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher</td><td>S11226</td><td>Zur Visualisierung von Biotinmolekülen</td></tr><tr><td><stark>Verbindungen</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Oxidierendes Substrat, notwendig für die HRP-Aktivität</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>SANBIO</td><td>AR1068</td><td>Zur Fixierung/Vernetzung der Zellen</td></tr><tr><td>Biotinyl-Tyramid</td><td>R& D Systems</td><td>6241</td><td>Zur Amplifikation des Signals, HRP-Substrat</td></tr><tr><td>BV-6</td><td>Selleckchem</td><td>S7597</td><td>BV6 IAP-Inhibitor</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Für die Zellkultur: zum Ablösen der Zellen</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>8,0 g/l NaCl</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,4 g/L Dinatriumsalz von EDTA</td></tr><tr><td>EDTA 0,04</td>%<td>Inhouse-Formulierung</td><td></td><td>1,1 g/L Na2HPO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L NaH2PO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L KCl</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L Glukose</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>TICO</td><td>FBS EU XXX</td><td>Für die Zellkultur, zur Erhaltung der Zellkultur; Chargennummer: 90439</td></tr><tr><td>GSK'840</td><td>Aobious</td><td>AOB0917</td><td>RIPK3-Kinase-Inhibitor</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Für die Zellkultur, zur Erhaltung der Zellkultur</td></tr><tr><td>MAXblock</td><td>Active Motif</td><td>15252</td><td>Blockierungslösung</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10444402</tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>Für die Zellkultur, Erhaltung der Zellkultur</td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>Eigene Produktion</td><td></td> <td>- Signalmolekül, das in Kombination mit BV6 und zVAD den Zelltod auslösen kann</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Zur Permeabilisierung der</td></tr><tr><td>Zellen Trypanblau</td><td>Merck</td><td>11732</td><td>Zur Zellzählung, wird als Lebend-/Totmarker bei 0,1%</td></tr> <tr><td>verwendetTrypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4424</td><td>Für die Zellkultur: zur Ablösung der Zellen</td></tr><tr><td>zVAD</td><td>Bachem</td><td>BACE4026865.0005</td><td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluormethylketon</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 well hoher Glasboden</td><td>iBidi</td><td>80807</td><td>Zur Kultivierung der</td></tr><tr><td>Zellen Cotton Preping Balls-size medium</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71001-10</td><td>Zur Reinigung der Objektive</td></tr><tr><td>Immersol 518 F / 30 &deg; C</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td>Zur Visualisierung der Probe bei hohen Vergrößerungen</td></tr><tr><td>Linsenreiniger</td><td>ZEISS</td><td>000000-0105-200</td><td>Zur Reinigung der Objektive</td></tr><tr><td>LSM880 Fast Airyscan Konfokalmikroskop</td><td></td><td></td><td>Zur Visualisierung der</td></tr> <tr><td>ProbeSoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Office xx</td><td></td><td>Zur Verarbeitung der Daten</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>Graphpad</td><td>xx</td><td>Zur Analyse der Daten - statistische Tests und Diagrammerstellung</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Volocity</td><td>xx</td><td>Zur Durchführung von Quantifizierungen</td></tr><tr><td>Zen black</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Zur Erfassung und Verarbeitung</td></tr><tr><td>von Bildern Zen blue</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Zur Visualisierung von Bildern</td></tr><tr><td><stark>Viren</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HSV-1 (mutRHIM) F-Stamm</td>, <td>produziert von&nbsp; Dr. Jiahuai Han</td><td>in eigener Replikation</td><td>HSV-1 als Auslöser für Nekroptose; Die RHIM-Kerndomäne von UL39/ICP6 ist mutiert (VQCG>AAAA)</td></tr><tr><td>HSV-1 (WT) F-Stamm</td><td>Hergestellt von Dr. Jiahuai Han</td><td>in house</td><td>replication HSV-1 (WT) als Negativkontrolle für die Nekroptose-Induktion (ICP6-Inhibition)</td></tr><tr><td>IAV PR8</td><td>in house stock</td><td>in house replication</td><td>IAV als Auslöser für Nekroptose</td></tr></tbody></table>

tyramid-signalamplifikation zur immunfluoreszenzfärbung der zbp1-abhängigen phosphorylierung von ripk3 und mlkl nach hsv-1-infektion in menschlichen zellen

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

Die Kinase-Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 3 (RIPK3) und ihre substratgemischte Linie Kinase Domain-like (MLKL) sind kritische Regulatoren der Nekroptose, einer entzündlichen Form des Zelltods mit wichtigen antiviralen Funktionen. Die Autophosphorylierung von RIPK3 induziert die Phosphorylierung und Aktivierung des porenbildenden Henkerproteins der Nekroptose MLKL. Der Transport und die Oligomerisierung von phosphoryliertem MLKL an der Zellmembran führt zur Zelllyse, die für den nekroptotischen Zelltod charakteristisch ist. Der Nukleinsäuresensor ZBP1 wird durch Bindung an linkshändige Z-Form doppelsträngige RNA (Z-RNA) nach Infektion mit RNA- und DNA-Viren aktiviert. Die ZBP1-Aktivierung schränkt die Virusinfektion ein, indem sie den regulierten Zelltod, einschließlich Nekroptose, infizierter Wirtszellen induziert. Die Immunfluoreszenzmikroskopie erlaubt die Visualisierung verschiedener Signalschritte nach ZBP1-vermittelter Nekroptose pro Zelle. Die Empfindlichkeit der Standard-Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung derzeit kommerziell verfügbarer Phospho-spezifischer Antikörper gegen humanes RIPK3 und MLKL schließt jedoch eine reproduzierbare Bildgebung dieser Marker aus. Hier beschreiben wir ein optimiertes Färbeverfahren für Serin (S) phosphoryliertes RIPK3 (S227) und MLKL (S358) in humanen HT-29-Zellen, die mit Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) infiziert sind. Die Aufnahme eines Tyramid-Signalamplifikationsschritts (TSA) in das Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll ermöglicht den spezifischen Nachweis von S227 phosphoryliertem RIPK3. Darüber hinaus erhöht TSA die Empfindlichkeit der Detektion von S358 phosphoryliertem MLKL erheblich. Zusammen ermöglicht diese Methode die Visualisierung dieser beiden kritischen Signalereignisse während der Induktion der ZBP1-induzierten Nekroptose.

Der Immunfluoreszenznachweis der MLKL-Phosphorylierung und insbesondere der RIPK3-Phosphorylierung in menschlichen Zellen ist technisch anspruchsvoll26. Wir präsentieren hier ein verbessertes Färbeprotokoll für humanes p-RIPK3 (S227) und p-MLKL (S358) nach der Aktivierung von ZBP1. Das Protokoll beinhaltet einen TSA-Schritt zur Verbesserung der Nachweisgrenze und Empfindlichkeit der Fluoreszenzsignale. Um die Methode zu validieren, wurde ein Side-by-Side-Vergleich der TSA-vermittelten Immunfluores...

Die Tyramid-Signalverstärkung während der Immunfluoreszenzfärbung ermöglicht den sensitiven Nachweis von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL während der ZBP1-induzierten Nekroptose nach HSV-1-Infektion.

Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Die robuste Visualisierung von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL, zwei wichtigen Signalereignissen während der Nekroptose-Induktion, war eine technische Herausforderung. Das vorgestellte Tyramid-Amplifikationsprotokoll ermöglicht einen sensitiven Nachweis dieser beiden Moleküle. Der Signalverstärkungsschritt senkt die Detektionsschwelle und ermöglicht eine robuste und reproduzierbare Detektion von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL.Beginnen Sie mit der Aussaat der 90.000 ZBP1-exprimierenden HT-29-Zellen im 5A-Medium von McCoy in voller Stärke in einer Vertiefungsplatte mit einer Fläche von einem Zentimeter, die eine High-End-Mikroskopie ermöglicht. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Sobald die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, infizieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern vorgewärmtem, vollwertigem McCoy's 5A-Medium, das Herpes-simplex-Virus eins enthält und eine Randmutante ICP6 bei einer Vielzahl von Infektionen von fünf kodiert. Inkubieren Sie die Zellen neun Stunden lang mit dem Virus, um eine Nekroptose zu induzieren. Als Positivkontrolle für die Nekroptose-Induktion stimulieren Sie die Zellen vier Stunden lang mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem Nekroptose-induzierenden Cocktail.Als Negativkontrolle fügen Sie 22 Mikroliter 10 Mikromolare GSK840 hinzu, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt sind, um die RIPK3-Kinaseaktivität zu hemmen. Schließen Sie diesen Inhibitor in einem unbehandelten Zustand und nach Nekroptosestimulation ein, um die Autophosphorylierung von Serin 227 zu verhindern. Um die Zellen zu fixieren, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern PBS.Dann entfernen Sie das PBS und fügen Sie 150 Mikroliter 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie nach der Fixierung die 4% Paraformaldehyd und waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS.Die Proben können über PBS bei vier Grad Celsius über Nacht bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden. Entfernen Sie das PBS von der Platte und inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Permeationspuffer bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem kippbaren Laborshaker. Entfernen Sie nach der Inkubation den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer.Inkubieren Sie die Bildgebungskammer mit Waschpuffer für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborshaker. Um die unspezifische Bindung von primären Antikörpern zu verhindern, inkubieren Sie die Platte mit 100 Mikrolitern Blockmedium bei Raumtemperatur für zwei Stunden auf einem kippbaren Laborschüttler. Als nächstes waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborshaker.Nach dem Entfernen des Waschpuffers 100 Mikroliter der primären Antikörper in die Bildgebungskammer geben. Stellen Sie sicher, dass keine primäre Antikörperbedingung enthalten ist, um den potenziellen Hintergrund der Tyramidsignalverstärkung zu visualisieren und die Maskierungsschwelle festzulegen. Die Kammer über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Entfernen Sie die primäre Antikörpermischung und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler. Nach dem Entfernen des Waschpuffers inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern HRP-markiertem sekundären Antikörper und erkennen Sie die Spezies des primären Antikörpers, die für 30 Minuten auf einem kippbaren Laborschüttler amplifiziert werden sollen. Während der Antikörperinkubation die biotinylierte Tyramidmischung vorbereiten.Um die enzymatische Aktivität von HRP auszulösen, fügen Sie dem TSA-Puffer vor Gebrauch frisch ein oxidierendes Substrat hinzu. Anschließend wird das biotinylierte Tyramid im vorbereiteten TSA-Puffer unter Verwendung der optimierten Verdünnung verdünnt. Nach der Inkubation mit HRP-markierten sekundären Antikörpern waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation auf einem kippbaren Laborschüttler.Nach dem Entfernen des Waschpuffers aus der Vertiefung wird verdünntes Biotin-Tyramid zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern in die Vertiefung gegeben. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf einem kippbaren Laborschüttler, gefolgt von drei Waschpufferwäschen. Bereiten Sie die Färbemischung vor, die den sekundären Antikörper, gekoppeltes Streptavidin und Kernfärbung und Waschpuffer enthält.Entfernen Sie den Waschpuffer und inkubieren Sie die Platte mit 100 Mikrolitern Färbemischung bei Raumtemperatur für eine Stunde auf einem kippbaren Laborschüttler. Halten Sie die Bildkammern ab diesem Schritt lichtgeschützt. Nach dem Färben zweimal nacheinander mit Waschpuffer waschen und die Vertiefungen zweimal mit PBS abspülen.Lagern Sie die Proben über PBS hinaus bei vier Grad Celsius, um die Färbung bis zur Bildgebung zu erhalten. Die Bildgebungskammer kann nun auf einem konfokalen Mikroskop visualisiert werden. Die Einbeziehung der Tyramid-Signalverstärkung ermöglichte den robusten Nachweis von RIPK3, das an Serin 227 im Zytosol des Herpes-simplex-Virus one phosphoryliert wurde, das für eine mit der Felgenmutante ICP6 infizierte Zellen kodiert.Eine Laserleistung von 2% war für die empfindliche Detektion ausreichend. Bei der indirekten Standard-Immunfluoreszenz reichte eine höhere Laserleistung für den Nachweis von Phospho-RIPK3 nicht aus. Bei der Quantifizierung der dreidimensionalen Z-Stack-Bilder zeigten die infizierten Zellen einen etwa 20-fachen Anstieg der Voxel, die positiv für phosphoryliertes RIPK3 waren, gegenüber pseudobehandelten Zellen.Eine erhöhte Phospho-RIPK3-Färbung von Wildtyp-Herpes-simplex-Virus-eins-infizierten Zellen im Vergleich zu nachgebildeten behandelten Zellen zeigte, dass die Randdomäne von ICP6 nicht in der Lage ist, die RIPK3-Phosphorylierung an Serin 227 vollständig zu blockieren. GSK840 bindet an die Kinasedomäne von RIPK3 und verhindert die RIPK3-Phosphorylierung bei Serin 227 nach ZBP1-Aktivierung, was die Spezifität der Tyramid-Signalamplifikations-vermittelten Phospho-RIPK3-Detektionsmethode bestätigt. Die simulierten Zellen zeigten eine geringe leicht punktierte zytosolische Färbung der MLKL-Phosphorylierung bei Serin 358, während eine starke Färbung im Zytosol, im Zellkern und in der Plasmamembran der infizierten Zellen nachgewiesen wurde.Die standardmäßige indirekte Immunfluoreszenz benötigte 40% Laserleistung für den spezifischen Nachweis eines Phospho-MLKL-Signals in den infizierten Zellen. Im Gegensatz dazu erhöhte die Tyramid-Signalverstärkung die Detektionsempfindlichkeit von Phospho-MLKL, wodurch die erforderliche Laserleistung auf 6% gesenkt wurde. Die 3D-Z-Stack-Bildquantifizierung zeigte einen etwa 90-fachen Anstieg der Anzahl der Voxel, die mit Tyramid-Signalverstärkung positiv für Phospho-MLKL waren, verglichen mit einer siebenfachen Erhöhung mit der Standardmethode, was auf eine verbesserte Nachweisschwelle und Empfindlichkeit für Phospho-MLKL hinweist. Ähnlich wie Herpes-simplex-Virus löste die Influenza-A-Virusinfektion eine ZBP1-abhängige Nekroptose aus.Die Tyramid-Signalverstärkung ermöglichte den robusten Nachweis von Phospho-RIPK3 und Phospho-MLKL, was auf eine Nekroptose hindeutet. Um die konfokale Färbung zu interpretieren, müssen mehrere Färbekontrollen einbezogen werden. Dies beinhaltet eine keine primäre Bedingung, einzelne Flecken sowie eine Positivkontrolle.Durch die Anpassung dieses Protokolls können mehrere Ziele mithilfe sequentieller TSA verstärkt werden. Dies würde den Nachweis von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL innerhalb derselben Zelle ermöglichen. Der empfindliche Nachweis von Nekroptose-Biomarkern kann für die laufende ZBP1-Forschung zu Autoinflammation oder Virusinfektion aufschlussreich sein, bei der die ausgeführten ZBP1-abhängigen Zelltodwege noch als Nekroptose, Apoptose oder Pyroptose bestätigt werden müssen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Migräne und ihre Umwandlung zu einer chronischen Migräne sind immens Gesundheitswesen Belastungen brauchen bessere Behandlungsmöglichkeiten. Wir wollen festlegen, wie neuronale Immunsystems Signalisierung der Anfälligkeit moduliert, um Migräne,...

Modeling Neural Immune Signalisierung von episodischen und chronischen Migräne mit Spreading Depression In Vitro</em

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bildung einer HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsen auf Glas unterstützt planare Doppelschichten durch Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie sichtbar zu machen. Das Verfahren kann auch mit Immunfluoreszenzfärbung kombiniert werden, um die Aktivierung und Umverteilung von Signalmolekülen, die während der HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsenbildung auftreten zu erkennen.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung des transportierten infizierten Zellproteins 0, ICP0 bei einer Herpes-simplex-Virus-1-Infektion. Nach der De-novo-Synthese transloziert ICP0 in den Zellkern und wandert später während des Fortschreitens der Infektion in das Zytoplasma. Die Immunfluoreszenzmikroskopie enthüllt und analysiert die subzelluläre Lokalisation des Proteins und bietet Einblicke in seinen Transport über Infektionsphasen hinweg.

Eine Immunfluoreszenztechnik zur Lokalisierung viraler Proteine in infizierten Zellen

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Die Haut ist ein Zielgewebe des humanpathogenen Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1). Um den Invasionsweg von HSV-1 in das Gewebe zu untersuchen, haben wir ein ex vivo Infektionsmodell von murinen Epidermisschichten etabliert, die die äußerste Hautschicht darstellen.

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

ICP0 erfährt nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion. Der molekulare Mechanismus dieses Ereignisses ist nicht bekannt. Hier beschreiben wir die Verwendung von confocal Mikroskop als Instrument zur ICP0 Bewegung in HSV-1-Infektion, die legt den Grundstein für die Analyse von quantitativ ICP0 Translokation in zukünftigen mechanistische Studien zu quantifizieren.

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

In dieser Studie präsentieren wir inhibitor- und siRNA-basierte Strategien, um den autophagischen Fluss in Herpes simplex Virus Typ-1 (HSV-1)-infizierten monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen zu stören.

siRNA Elektroporation zur Modulation der Autophagie bei Herpes Simplex Virus Typ 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Lernen Sie die Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung phosphorylierter RIPK3 und MLKL in menschlichen HT-29-Zellen nach HSV-1-Infektion. Diese Methode ermöglicht die robuste und reproduzierbare Detektion entscheidender Nekroptose-Marker.

Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal

Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen

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