Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen

Die robuste Visualisierung von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL, zwei wichtigen Signalereignissen während der Nekroptose-Induktion, war eine technische Herausforderung. Das vorgestellte Tyramid-Amplifikationsprotokoll ermöglicht einen sensitiven Nachweis dieser beiden Moleküle. Der Signalverstärkungsschritt senkt die Detektionsschwelle und ermöglicht eine robuste und reproduzierbare Detektion von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL.

Beginnen Sie mit der Aussaat der 90.000 ZBP1-exprimierenden HT-29-Zellen im 5A-Medium von McCoy in voller Stärke in einer Vertiefungsplatte mit einer Fläche von einem Zentimeter, die eine High-End-Mikroskopie ermöglicht. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.