Systematische Analyse von In-vitro- Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Zellrolling-Studien mit erhöhtem Durchsatz unter einer streng kontrollierten, physiologisch relevanten Scherströmung durchzuführen. Dies wird durch ein mikrofluidisches System mit mehreren Vertiefungen erreicht, bei dem benachbarte Vertiefungen in einer speziellen Platte über einen mikrofluidischen Kanal verbunden sind. Die Schnittstelle des Systems verbindet eine elektropneumatische Pumpe mit der Oberseite der Multi-Well-Platte und übt einen pneumatischen Druck aus, der die Flüssigkeit aus dem Inneren der Wells mit einer definierten Durchflussrate durch die mikrofluidischen Kanäle treibt.

Sobald der mikrofluidische Kanal mit dem gewünschten Substrat oder der Zellmonoschicht beschichtet ist, werden die interessierenden Zellen in den mikrofluidischen Kanal eingeführt, um ihre spezifischen Rollwechselwirkungen mit der beschichteten Oberfläche zu untersuchen. Die Rolleigenschaften der Zellen bei der Interaktion mit dem Substrat oder der Monolayer-beschichteten Oberfläche unter verschiedenen experimentellen Bedingungen können dann mit der entsprechenden Software analysiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der parallelen Plattenströmungskammer besteht darin, dass diese Technik die Untersuchung der Silberwalzeigenschaften mit einem deutlich höheren Durchsatz bei präzise kontrollierter, physiologisch relevanter Rohrströmung bei gleichzeitiger Minimierung des Reagenzien- und Zellverbrauchs ermöglicht. Diese Plattform kann dazu beitragen, exogene zellbasierte Therapien voranzutreiben, indem sie die schnelle und genaue Analyse von technischen Ansätzen ermöglicht, die das Zellrollen und das Homing beeinflussen sollen.

Um einen mikrofluidischen Kanal mit einem Proteinsubstrat zu beschichten, geben Sie zunächst 25 bis 50 Mikroliter der frisch zubereiteten Proteinlösung in den Einlass. Nun, dann wenden Sie fünf Minuten lang eine Kraft von zwei Din pro Quadratzentimeter an, um die Lösung in den Kanal zu perfundieren. Wenn eine Flüssigkeitsperle im Auslass sichtbar wird, stoppen Sie den Durchfluss, inkubieren Sie die Platte für die entsprechende Zeit mit dem gewünschten Protein und aspirieren Sie dann die Lösung aus jedem Protein. Brunnen.

Geben Sie als Nächstes 200 bis 500 Mikroliter PBS in die Auslassvertiefung und wenden Sie dann fünf Minuten lang einen reinen Fluss von zwei Dins pro Quadratzentimeter an, um den Kanal zu waschen und eine Zellmonoschicht im mikrofluidischen Kanal zu erzeugen. Beginnen Sie mit einem sanften Trypsin der interessierenden Zellen aus ihrer Kulturschale für drei Minuten, stoppen Sie die Reaktion mit einem zweifachen Volumen des vollen Mediums und zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 400 G und rt. Waschen Sie anschließend das Pellet in 10 Millilitern vollem Medium.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Vollmedium und zählen Sie, stellen Sie die Zelllösung auf die entsprechende Konzentration ein und geben Sie dann 25 bis 50 Mikroliter der Zellsuspension in jeden Einlass. Platzieren Sie nun die Platte auf dem Mikroskoptisch und wenden Sie einen reinen Fluss von zwei Dins pro Quadratzentimeter an, um die Zellen in den Kanal zu fließen, bis Sie feststellen, dass die Zellen den gesamten Kanal ausfüllen. Nachdem Sie den Durchfluss gestoppt haben, füllen Sie sowohl die Auslass- als auch die Binnenbrunnen mit 200 Mikrolitern des entsprechenden Zellmediums und lassen Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 absetzen und adhäsieren.

Waschen Sie den Kanal nach drei Stunden mit vollem Medium, um die nicht angeschlossenen Zellen zu entfernen. Die Zellen sollten nun vollständig konfluent und einsatzbereit sein, um die entzündliche Aktivierung der Endothelzellen in den Kanälen zu induzieren. Geben Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete TNF-alpha-Lösung in die Einlassvertiefung und führen Sie die Lösung dann in den Kanal ein, indem Sie fünf Minuten lang einen reinen Fluss von zwei Diens pro Quadratzentimeter anwenden.

Für die Kontrolle der nicht aktivierten Endothelzellkanäle geben Sie 100 Mikroliter Basalmedium der Endothelzellen in den Einlass. Nun, um P- oder E-Selektin auf der Oberfläche der Endothelzellen zu blockieren, geben Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter des entsprechenden neutralisierenden Antikörpers in den Kanal und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie dann die Kanäle mit Basalmedien, bevor Sie mit dem Roll-Assay beginnen.

Untersuchen Sie die Kanäle sorgfältig unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Kanäle richtig beschichtet sind. Waschen Sie dann die HL 60-Zellsuspension zweimal nach der zweiten Waschzählung mit Basalmedien und resuspendieren Sie die Zellen dann in IMDM bei fünfmal 10 bis zur sechsten Zellen pro Milliliter-Konzentration. Nachdem Sie 25 bis 50 Mikroliter der Zellsuspension in den Auslass gegeben haben, setzen Sie die Platte gut in den bei 37 Grad Celsius temperaturgesteuerten Plattenhalter ein und stellen Sie den Plattenhalter auf den Mikroskoptisch.

Führen Sie die Zellen in den mikrofluidischen Kanal ein. Sie sollten innerhalb von 10 bis 15 Sekunden beobachtet werden, wenn sie vom Auslass zum Einlass fließen. Hier können die fluoreszenzmarkierten HL 60-Zellen beobachtet werden, die mit der P-select-kodierten Oberfläche interagieren und eine rollende Reaktion anzeigen, um die Rollreaktion als Funktion der Scherspannung zu untersuchen, die Scherung auf 0,25 Dines pro Quadratzentimeter zu reduzieren und 20 bis 32. Videos unter Verwendung der Stromerfassungsfunktion in jeder gewünschten Scherung zu erfassen, und indem die Scherung schrittweise von 0,25 auf bis zu fünf Dines pro Quadratzentimeter erhöht wird.

Verwenden Sie schließlich eine CCD-Kamera, um ein Video des Assays mit einer Stream-Erfassung von 11 Bildern pro Sekunde aufzunehmen. Hier ist zum Beispiel eine HL 60-Zelle zu sehen, die auf einer Monolage aus Chope-Zellen rollt. Analysieren Sie die Walzwege und -geschwindigkeiten mit der entsprechenden kompatiblen Software.

HL 60-Zellen gelten als Goldstandard-Rollen, da sie eine Vielzahl von Homing-Liganden exprimieren, darunter die rollenden Liganden, P select und Glykoproteinliganden eins und CI Lewis X.To Test der Fähigkeiten des mikrofluidischen Systems mit mehreren Well-Platten, zahlreiche mikrofluidische Kanäle wurden gleichzeitig mit verschiedenen Substraten beschichtet und die rollenden Wechselwirkungen von HL 60-Zellen. Nachdem diese Substrate analysiert wurden, zeigten die Zellen ein robustes Rollverhalten auf der P-select-kodierten Oberfläche, wobei die Zellen zuerst aus der Strömung eingefangen wurden, gefolgt von einer deutlichen Rollbewegung. Wie in dieser Grafik dargestellt und in Übereinstimmung mit der Literatur, zeigen HL 60-Zellen ein ähnliches Rollverhalten auf e- und p-Selektinoberflächen, jedoch nicht auf FiberInc-beschichteten Substraten.

Die Zellgeschwindigkeit, wie sie mit kompatibler Software analysiert wurde, wurde gegen reine Belastung aufgetragen und zeigte eine robuste Rollreaktion der Zellen auf p- und e-Selektin mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit zwischen einem und 12 Mikrometern pro Sekunde. Um die Machbarkeit dieses mikrofluidischen Systems bei der effizienten Prüfung der Wechselwirkungen zwischen den interessierenden Zellen und einer Zellmonoschichtbeschichtung auf der Oberfläche zu bewerten, wurden CHO-P-Zellen verwendet, die transfiziert wurden, um stabil P, aber nicht e-Selektin zu exprimieren, wie hier gezeigt. HL 60-Zellen zeigen eine signifikante Rollreaktion auf einer CHO-P-Zell-Monoschicht, um zu testen, ob die Rollbewegung von HL 60 tatsächlich durch Pektin vermittelt wird.

Die Monoschicht wurde mit blockierenden Antikörpern für P- oder E-Selektin vorinkubiert, bevor HL 60-Zellen in den Kanal gelangten. Wie in dieser Grafik gezeigt, führte die Blockierung der CHO p-Monoschicht mit einem P-Selektin-Antikörper zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl der HL 60-Zellen, die auf der Oberfläche rollen, was zeigt, dass P das HL 60-Rollen selektiert und tatsächlich vermittelt. Wie bereits beschrieben, besteht die mikrofluidische Multi-Well-Platte aus zahlreichen separaten mikrofluidischen Kanälen, die Tests mit höherem Durchsatz unter mehreren verschiedenen Bedingungen ermöglichen.

Dieses vorteilhafte Design wurde verwendet, um Endothelzellen in den mikrofluidischen Kanälen für eine schnelle Analyse der Wechselwirkungen zwischen HL-60-Zellen und Endothelzellen zu plattieren. Unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen wurden Endothelzellen mit dem proinflammatorischen Zytokin TNF alpha vorbehandelt, was zu einer Hochregulierung von E-, aber nicht von P-Selektin auf der Endothelzelloberfläche führte. Interessanterweise interagierten die HL 60-Zellen nicht mit den inaktivierten Endothelzellen, und es wurde nicht beobachtet, dass die Zellen auf dieser Oberfläche rollten. Im Gegensatz dazu zeigten die HL 60-Zellen ein robustes Rollverhalten auf TNF-alpha-aktivierten Endothelzellen mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von fünf bis 15 Mikrometern pro Sekunde, um die Beteiligung von p- oder E-Selektin an den rollenden Wechselwirkungen zwischen HL 60-Zellen und aktivierten Endothelzellen zu untersuchen.

TNF-alpha-aktivierte Endothelzellen wurden mit P- oder E-Selektion in blockierenden Antikörpern vorinkubiert, und das Rollen von HL-60-Zellen wurde analysiert, wie in der Grafik dargestellt. Die Blockierung ausgewählter TNF-alpha-Endothelzellen führte zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl der rollenden Zellen auf der aktivierten Endothelmonoschicht. Im Gegensatz dazu hatte die Verwendung einer Isotopenkontrolle oder eines Antikörpers gegen Pektin, das auf aktivierten Endothelzellen nicht exprimiert wird, keinen signifikanten Einfluss auf das Rollen von HL 60 auf der aktivierten Endothelschicht. Diese Daten zeigen die direkte Beteiligung von S-Selektin am HL 60-Rollen auf TNF-alpha-aktivierten Endothelzellen, die mit früheren Berichten übereinstimmen.

Mit einer Analysesoftware lässt sich der Weg einzelner Zellen bei der Interaktion mit der Oberfläche verfolgen. Somit wurden die Wege einzelner Zellen bei der Interaktion mit TNF-alpha-aktivierten Endothelzellen mit oder ohne e Selektion und Antikörperblockierung spezifisch verfolgt. Wie in dieser Abbildung dargestellt, war die Anzahl der rollenden Zellen auf nicht blockierten aktivierten Endothelzellen signifikant höher als auf ausgewählten und blockierten aktivierten Endothelzellen. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Rollbewegung der HL 60-Zellen auf unblockierten Endothelzellen kontinuierlich und robust war, während die Rollwege der Zellen auf den ausgewählten und blockierten Endothelzellen fragmentiert waren.

In Übereinstimmung mit diesem Befund war die Rollgeschwindigkeit von HL 60-Zellen auf nicht blockierten TNF-alpha-aktivierten Endothelzellen signifikant niedriger als die Rollgeschwindigkeit auf e-ausgewählten und geblockten Endothelzellen. Diese Studie demonstriert den Einsatz eines mehrfachen mikrofluidischen Systems zur effizienten Durchführung von Zellwalzexperimenten mit einem erhöhten Durchsatz von bis zu 10 Walzgasen pro Stunde bei streng kontrolliertem Rohrfluss. Insgesamt erweist sich dieses mikrofluidische System als eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Zellrollens, einem Schlüsselaspekt des Zellhackings.

Zum Beispiel verwendet unser Labor dieses System derzeit, um nach Bedingungen zu suchen, die das Homing von mesenchymalen Stammzellen verbessern, um ihre therapeutische Wirkung zu verbessern.