Name: Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Lernen Sie eine reproduzierbare Präparationstechnik zur Trennung von retinalem Pigmentepithel und Netzhaut aus menschlichen Augen für histologische Analysen. Diese Methode ermöglicht morphometrische Untersuchungen mit REShAPE-Software.

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Wir danken dem Histologiekern des National Eye Institute (NEI) für den Einsatz des Zeiss Axio Scan.Z1. Wir danken auch den Spendern, ihren Familien, dem Advancing Sight Network und dem Lions Eye Institute für ihre Großzügigkeit. Diese Arbeit wurde durch NEI IRP-Mittel (Förderkennzeichen ZIA EY000533-04) unterstützt.

Die menschlichen Globen von Leichen wurden vom Advanced Sight Network (Birmingham, AL) bezogen. Arbeiten an Leichengewebe werden vom NIH Institutional Review Board vom Forschungsethikausschuss ausgenommen.
1. Augenglobus Versand
<ol><li>Nach der Enukleation frische Augenkugeln in einem Behälter verschicken, der 1x mit eiskaltem DPBS mit Ca2+ undMg2+ gefüllt ist. HINWEIS: Es ist besser, das Auge innerhalb von 24 Stunden nach der Enukleation zu analysieren. Die RPE-Morphologie wird in diesem Zeitfenster nicht verändert.</li>
</ol>2. Silikonformvorbereitung
<ol><li>Schneiden Sie die unteren 20 mm eines Rundbodenrohrs mit einem Durchmesser von 25 mm ab. Legen Sie es auf die Basis eines quadratischen Wiegebootes (81 mm x 81 mm x 25 mm).</li>
	<li>Mischen Sie die beiden Komponenten des Silikon-Elastomer-Kits im Verhältnis 10:1 und achten Sie darauf, keine Luft einzuschließen. Gießen Sie die Mischung in das Wiegeboot, das das kugelförmige Stück des Rundbodenrohrs enthält.</li>
	<li>Das Silikon über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Entfernen Sie das Wiegegefäß und das Rundrohr aus der ausgehärteten Silikonform.</li>
</ol>3. RPE-Dissektion
<ol><li>Reinigen Sie die Sklera von der frischen Augenkugel von Muskeln und Bindegewebe. Befestigen Sie das Auge mit 27 G-Nadeln, die durch die Sklera gefädelt werden, an der Silikonform. Füllen Sie den Hohlraum der Form mit DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Augenkammer nicht zu durchbrechen. Die Nadeln sollten nur durch die Sklera gehen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze und eine 21-g-Nadel, um ~400 μL 1.700 mOsm D-Mannitol-Lösung in den Glaskörper zu injizieren. Führen Sie die Nadel durch die Pars Plana ein, um eine Punktion der Vorderkammer des Auges zu vermeiden. Lassen Sie das Auge bei Raumtemperatur für ~45 min.</li>
	<li>Schneiden Sie die Vorderkammer auf Höhe der Pars plana mit einer feinen Schere und einer Pinzette auf. Füllen Sie die hintere Augenkammer mit DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+. Unter dem Stereomikroskop lokalisieren Sie die Makula (den gelben Fleck auf der Netzhaut).</li>
	<li>Wenn ein chirurgischer Glaskörperschneider zur Verfügung steht, entfernen Sie den Glaskörper und ersetzen Sie ihn durch DPBS 1x mit Ca 2+ und Mg2+. Alternativ können Sie versuchen, den Glaskörper mit einer Pinzette anzuheben und mit einer feinen Schere zu schneiden.</li>
	<li>Achten Sie darauf, die Makularegion zu erhalten, schneiden Sie das Auge in Quadranten: nasal, temporal, superior und inferior. Entfernen Sie die Nadeln, wenn sie im Weg sind.</li>
	<li>Überführen Sie die schmetterlingshintere Augenkammer in eine 100 mm Petrischale, die DPBS 1x mit Ca2+ und Mg2+ enthält. Bevor Sie die Netzhaut entfernen, markieren Sie das Blütenblatt, das die Makula enthält, indem Sie einen kleinen Schnitt (V-förmig) im Ziliarand machen. Heben und schneiden Sie den gesamten Glaskörper, der auf der Netzhaut liegt.</li>
	<li>Heben Sie die Netzhaut vorsichtig von mehreren Seiten mit einem gekrümmten Spatel oder einer Pinzette an, um zu überprüfen, ob sich die Netzhaut vom RPE gelöst hat, und um etwas Flüssigkeit zwischen den beiden Schichten zirkulieren zu lassen. HINWEIS: Die Netzhaut wird immer noch an der äußersten Peripherie (Ziliarrand) und am Sehnerv befestigt.</li>
	<li>Schneiden Sie die Netzhaut von den Ziliarändern in allen Blütenblättern ab und stellen Sie sicher, dass das RPE nicht zerkratzt wird. Legen Sie das Gewebe in 4% PFA und inkubieren Sie für ~ 1 h. 3x mit DPBS waschen, 1x mit Ca2+ undMg2+. Das Gewebe in einen mit DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ gefüllten Behälter überführen und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt ist die Netzhaut nur am Sehnerv befestigt. Dies ist ein Pausenpunkt in diesem Experiment.</li>
	<li>Die Probe wird in eine 100-mm-Petrischale überführt, die DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ enthält. Stanzen Sie den Sehnervenkopf mit einem 1,5-mm-Biopsiestempel aus und entnehmen Sie die Netzhaut. Lagern Sie die neurale Netzhaut in DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ bei 4 °C. HINWEIS: Bevor Sie den Sehnervenkopf ausstanzen, achten Sie darauf, den Sehnerv so weit wie möglich auf der Skleraseite zu schneiden. Dies erhöht die Präzision des Stempels. Das Ausstanzen des Sehnervs, nachdem der Flatmount in 4% PFA fixiert wurde, reduziert die Schädigung der RPE-Zellen, die sich um den Sehnerv befinden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Sklera aus dem RPE/Aderhaut, indem Sie die RPE/Aderhautschicht vorsichtig von der Peripherie abheben und die Aderhautgefäße und das Bindegewebe, die sich zwischen der Sklera und dem RPE befinden, mit einer Vannas-Federschere durchtrennen. Sobald die RPE/Aderhaut vollständig von der Sklera getrennt ist, sammeln Sie die RPE/Aderhautschicht. Das Gewebe in einen mit DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ gefüllten Behälter überführen und bei 4°C lagern. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann das Experiment pausiert werden.</li>
</ol>4. Färbung
<ol><li>Übertragen Sie die RPE/Aderhaut in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Blockieren und permeabilisieren Sie die Probe in DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ mit 1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,5% Tween 20 und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe mit Phalloidin, das mit einem 647-Fluorophor konjugiert ist, in einer Verdünnung von 1:250 in DPBS 1x mit Ca 2+ und Mg2 mit 1 % BSA, 0,5 % Tween20 und 0,5 % Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. 3x in DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ waschen.</li>
	<li>Übertragen Sie die RPE/Aderhautprobe auf einen 50 mm x 75 mm großen Glasobjektträger und glätten Sie ihn. Schneiden Sie jedes "Blütenblatt" in zwei Teile, um die Probe flacher zu machen. Achten Sie auf die Makula. Zeichne mit einem hydrophoben Stift eine Kontur des Flatmounts.</li>
	<li>Um die Lipofuszin-Autofluoreszenz zu löschen, werden 500 μl der auf 1:20 verdünnten Autofluoreszenzlöschlösung in 70%igem Ethanol zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert.</li>
	<li>Gründlich (mindestens 3x) in DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ waschen. Entfernen Sie den DPBS und fügen Sie das Einhängemedium hinzu. Legen Sie ein Deckglas auf das Flatmount und versiegeln Sie es mit Nagellack.</li>
	<li>Fotografieren Sie den Flatmount mit einem Fluoreszenzmikroskop (vorzugsweise mit einem 10-fachen oder 20-fachen Objektiv).</li>
</ol>5. REShAPE-Analyse
HINWEIS: Da der KI-basierte Algorithmus von REShAPE mit 10x- und 20x-Bildern trainiert wurde, wird dringend empfohlen, bei der Bildgebung ein 10x- oder 20x-Objektiv zu verwenden . Ist dies nicht der Fall, müssen die Bilder entsprechend skaliert werden.
<ol><li>Wenn die Bilder mit mehr als einem Fluoreszenzkanal aufgenommen werden, isolieren Sie den Kanal, der zur Erfassung der Zellränder verwendet wird. Exportieren Sie die Bilder als 16-Bit-Graustufen-TIF-Dateien. HINWEIS: Bilder, die mit der Dateiendung .czi aufgenommen wurden, müssen nicht als TIF-Dateien exportiert werden, aber der Kanal, der die Zellenränder enthält, muss noch isoliert werden.</li>
	<li>Installieren Sie die Software auf Windows x64- oder Linux-Plattformen (Centos 7). HINWEIS: Die Software und die Installationsanweisungen finden Sie unter https://github.com/nih-nei/REShAPE.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software (Abbildung 1).</li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte Verzeichnisse die Eingabe- und Ausgabeordner aus. Wählen Sie im Eingabeverzeichnis den Ordner aus, der die Bilder enthält. Lassen Sie die Software im Ausgabeverzeichnis automatisch den Pfad in " Eingabeverzeichnis/Verarbeitet" ändern. Alternativ können Sie das Ausgabeverzeichnis auch manuell ändern. HINWEIS: Die Software durchläuft alle Bilder, die im Eingabeordner enthalten sind.</li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte NN-Segmentierungsoptionen die folgenden Einstellungen für die Bildsegmentierung aus:<ol><li>Batchgröße: Geben Sie einen Wert von 20 in das Textfeld als guten Ausgangspunkt ein, senken Sie ihn jedoch, wenn das System keine Grafikprozessoren (GPUs) mehr hat. HINWEIS: Das Originalbild wird zur Bearbeitung in kleinere Kacheln aufgeteilt. Die Batchgröße gibt an, wie viele Kacheln gleichzeitig verarbeitet werden können.</li>
		<li>GPU verwenden?: Wenn das System nicht über genügend GPU-Ressourcen verfügt, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nein.</li>
		<li>Interne Skalierung: Ändern Sie über das Dropdown-Menü die interne Skalierung von "Keine ", wenn die Bilder nicht mit einem 10-fachen oder 20-fachen Objektiv aufgenommen wurden. Skalieren Sie beispielsweise 40-fache Bilder mit der 1/2-Taste auf die halbe Größe. Die im Dropdown-Menü verfügbaren Optionen für die Neuskalierung sind wie folgt: 5x, 2x, Keine, 1/2, 1/5. HINWEIS: Das maschinelle Lernen wurde mit 10x- und 20x-Bildern trainiert. Es kann sein, dass Zellränder von Bildern, die mit anderen Vergrößerungen aufgenommen wurden, nicht erkannt werden. In diesem Fall werden binäre Bilder vollständig schwarz angezeigt.</li>
		<li>Arti-Filter: Verwenden Sie den Artefaktfilter, um sehr helle Partikel (Trümmer oder kleine Teile der Netzhaut oder des Bindegewebes um den Sehnerv herum) zu entfernen, die im Bild vorhanden sein können und die Segmentierung der Zellgrenzen stören können. Standardmäßig wird kein Filter verwendet. Die künstlichen Filteroptionen im Dropdown-Menü lauten wie folgt: Normal, Stark und Schwach.</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie auf der Registerkarte Kachelbildoption einen Wert in das Textfeld ein, um den Grad der Überlappung zwischen den Bildkacheln anzugeben, indem Sie den Parameter " Kacheln auffüllen nach" anpassen. Eine Überlappung von 100 Pixeln funktioniert in der Regel gut.</li>
	<li>Passen Sie auf der Registerkarte "Ausgabegrafikoptionen " die Einstellungen für die Heatmap-Generierung an:<ol><li>Kachelbilder rekonstruieren?: Wenn das System nicht über genügend Ressourcen für die Analyse großer Bilder verfügt, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nein , damit die Software die Analyse abschließen kann, indem sie einzelne Kacheln speichert, ohne das gesamte Bild zu rekonstruieren.</li>
		<li>Farbbilder erstellen: Um Heatmaps zu erstellen, wählen Sie " Alle " aus dem Dropdown-Menü.</li>
		<li>Wählen Sie für die Färbung eine der verschiedenen Farbpaletten aus, die im Dropdown-Menü verfügbar sind: Thermisch, Grün, Mpl-Magma, Phase, Feuer, Jet, Cyan Hot.</li>
		<li>Speichern Sie die Bilder unter Bildformat als TIF oder PNG, indem Sie eine der Optionen auf der Registerkarte auswählen.</li>
		<li>Aktivieren Sie in Bezug auf die Funktion "Manuelle Grenzwerte verwenden?" das Kontrollkästchen Nein , damit die Software die in jedem Bild erkannten Minimal- und Maximalwerte verwenden kann. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Ja , um den Wertebereich für jede Heatmap der Formmetrik manuell anzupassen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Grenzwerte festlegen , um Bereiche für die einzelnen Parameter auszuwählen, indem Sie Werte in die Textfelder einfügen. Nachdem Sie die gewünschten Werte geändert haben, klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie auf Standardwerte laden , um alle Grenzwerte zurückzusetzen. HINWEIS: Verwenden Sie manuelle Grenzwerte, wenn Heatmaps aus mehreren Bildern verglichen werden müssen, z. B. beim Vergleich der Auswirkungen verschiedener Verbindungen auf die Zellform. Auf diese Weise wird derselbe Wertebereich verwendet. Der Satz der manuell einzugebenden Werte variiert je nach Art der Probe. Es wird empfohlen, einige Iterationen auszuführen, um den optimalen Bereich auszuwählen.</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte Zellengrößenbeschränkungen für die Analyse einen Schwellenwert für die Zellengröße für die Analyse aus:<ol><li>Geben Sie unter Niedrigere Zellengröße die Größe der kleinsten Zelle in das Textfeld ein, die in die Analyse einbezogen werden soll.</li>
		<li>Geben Sie unter Obere Zellengröße die Größe der größten Zelle in das Textfeld ein, die in die Analyse einbezogen werden soll. HINWEIS: Die Einheit der Zellengröße ändert sich von Pixeln zu Mikrometern im Quadrat, abhängig von der Option, die auf der Registerkarte " Automatische Einheitenumrechnung" ausgewählt wurde.</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte Automatische Einheitenumrechnung die bevorzugte Einheit für die Analyse aus:<ol><li>Aktivieren Sie unter Pixel in reale Einheiten konvertieren? das Kontrollkästchen Nein , um die Analyse in Pixeleinheiten auszuführen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Ja , um die Analyse in Mikrometern auszuführen.</li>
		<li>Geben Sie unter Länge des Maßstabsbalkens (Pixel) den Pixelwert in das Textfeld ein.</li>
		<li>Geben Sie unter Länge des Maßstabsbalkens (Mikrometer) den entsprechenden Abstand in Mikrometern in das Textfeld ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Um die Analyse zu starten, klicken Sie auf Go For It. HINWEIS: Die Software kann auch die Lebensfähigkeit der Zellen messen, wenn die Zellen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und Propidiumiodid gefärbt sind (Registerkarte CZI-Optionen ), dies gilt jedoch nicht für RPE-Flatmounts.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig01.jpg"> Abbildung 1: Grafische Benutzeroberfläche von REShAPE. Die grafische Benutzeroberfläche verfügt über verschiedene Registerkarten zum Auswählen der Arbeitsverzeichnisse (Registerkarte Verzeichnisse ), zum Ändern der Segmentierungsoptionen (Registerkarten NN-Segmentierungsoptionen und Kachelbildoptionen ), zum Festlegen der Parameter für die Analyse (Zellengrößenbeschränkungen für die Analyse und zur automatischen Einheitenumrechnung ) und für die Heatmap-Generierung (Registerkarte Ausgabegrafikoptionen ). Abkürzung: GUI = grafische Benutzeroberfläche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<ol><li>Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+adherence+as+a+measure+of+retinal+adhesion%3A+Dependence+on+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).</li>
<li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+detachment+from+hyperosmotic+intravitreal+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).</li>
<li>Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+induced+retinal+detachment+in+the+rabbit+and+primate.+Electron+microscopy+of+the+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).</li>
<li>Ban, Y., Rizzolo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Molecular Vision. 3, 18(1997).</li>
<li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119(2022).</li>
<li>Schaub, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+predicts+function+of+live+retinal+pigment+epithelium+from+quantitative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).</li>
<li>Beatty, S., Koh, H. -H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+of+retinal+pigment+epithelial+cells+in+the+living+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).</li>
<li>Bhatia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RPE+morphometry+in+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Analysis of RPE morphometry in human eyes.</a> Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+A+comparison+to+unaffected+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die konsequente und effiziente Trennung von humanem RPE und Netzhaut kann mit diesem Protokoll erreicht werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung regionaler Unterschiede in der RPE-Form über die gesamte menschliche Netzhaut5. Ein entscheidender Schritt im Protokoll ist die physische Trennung von RPE und Netzhaut. Wenn sich die beiden Gewebe in einigen Bereichen nicht vollständig lösen, sollte man die Netzhaut vorsichtig anheben, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht bricht. Die REShAPE-Analyse von großen Flatmounts kann den Einsatz von Systemen mit beträchtlichen RAM-Ressourcen erfordern. In diesem Fall kann die Reassemblierung des gesamten Bildes deaktiviert werden, damit die Software die Analyse trotz fehlender Verarbeitungsressourcen erfolgreich abschließen kann.
Die Haupteinschränkung bei der Verwendung von REShAPE zur Segmentierung menschlicher RPE-Flatmounts besteht darin, dass der KI-Algorithmus hauptsächlich auf Bildern von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten RPE trainiert wurde. Infolgedessen ist die Segmentierung von menschlichen RPE-Flatmounts weniger genau. RPE-Zellen von gealterten Spendern enthalten eine große Menge an Lipofuszin7, und das breite Spektrum seiner Autofluoreszenz stört die Segmentierung der Zellgrenzen. In Zukunft werden mehr Bilder von RPE-Flatmounts verwendet, um die Segmentierung der Zellgrenzen in dieser Art von Probe zu verbessern. Trotz dieser Einschränkung wurde REShAPE speziell darauf trainiert, RPE-Zellgrenzen zu erkennen und zu segmentieren und schneidet besser ab als andere bestehende Methoden, wie z.B. die Segmentierung von RPE-Zellen Voronoi8 und CellProfiler9 .
Darüber hinaus bietet REShAPE im Vergleich zur manuellen Segmentierung 10 den Vorteil, große Bilder schnell zu analysieren (~130.000 Pixel x130.000 Pixel wurden getestet). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Präpariermethode sehr reproduzierbar ist und leicht auf andere Tiermodelle ausgedehnt werden kann. Darüber hinaus kann die Software verwendet werden, um die RPE-Form in Augen-Flatmounts oder in Zellkulturmodellen zu untersuchen, um die Wirkung bestimmter Behandlungen zu untersuchen. Schließlich macht die Vielseitigkeit von REShAPE es breit anwendbar für die Analyse anderer Arten von Epithelzellen.

Das retinale Pigmentepithel (RPE) und die neurale Netzhaut sind aufgrund der starken physiologischen Abhängigkeit der Photorezeptoren vom RPE stark miteinander verbunden. Während der Dissektion führt die mechanische Trennung der neuronalen Netzhaut von der RPE zum Zerreißen der RPE-Zellen, wobei die apikalen Teile des RPE an den äußeren Segmenten der retinalen Photorezeptoren gebunden bleiben. Das Ausmaß der RPE-Retina-Adhäsion ist so groß, dass die Menge an Pigment, die nach der Trennung auf der Netzhaut verbleibt, verwendet wird, um die Stärke der Netzhautadhäsion zu quantifizieren1. Insbesondere RPE-Tight Junctions und die Aktinstruktur, die sie verbindet, die sich auf der apikalen Seite befinden, brechen während der mechanischen Trennung ab. Daher führt das Färben von RPE-Flatmounts für Zellgrenzen zu einer fleckigen Monoschicht, in der viele Zellen fehlende Ränder aufweisen. Dieser Effekt wird verstärkt, wenn das Gewebe vor der Dissektion mit Paraformaldehyd (PFA) fixiert wird, da die Proteine vernetzt werden.
Studien zur intravitrealen Wirkstoffabgabe haben gezeigt, dass Injektionen von hyperosmotischen Lösungen in die Hinterkammer eine Netzhautablösung induzieren 2,3. In diesen Experimenten wurden 50 μL verschiedener Lösungen im Bereich von 1.000 mOsm bis 2.400 mOsm, die in den mittleren Glaskörper injiziert wurden, innerhalb von Minuten zu einer Netzhautablösung geführt. Bemerkenswert ist, dass die RPE-Tight Junctions selbst nach langen Expositionen bei Lösungen mit hoher Osmolarität in den transmissionselektronenmikroskopischen Bildern von Kaninchen- und Affenaugen intakt erschienen3. Einer ähnlichen Strategie folgend, injizierten wir eine hyperosmotische Lösung von D-Mannitol in den mittleren Glaskörper, um eine effiziente Netzhautablösung zu induzieren, bevor wir eine RPE-Dissektion durchführten. Da D-Mannitol nicht durch das RPE4 transportiert wird, wird eine hohe intravitreale Konzentration aufrechterhalten, wodurch ein osmotischer Gradient erzeugt wird. Die effiziente Trennung von RPE und Netzhaut über die gesamte hintere Kammer garantiert die Erhaltung der RPE-Zellverbindungen und ermöglicht die Untersuchung der RPE-Morphometrie auf dem gesamten Flatmount. Darüber hinaus haben wir eine auf künstlicher Intelligenz (KI) basierende Software entwickelt, die fluoreszenzmarkierte RPE-Zellgrenzen erkennt und segmentiert, 30 verschiedene Formmetriken quantifiziert und Heatmaps jeder Metrik für die Visualisierung 5,6 erstellt.

<table><tbody><tr><td>Biopsiestanze 1,5 mm&nbsp;</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P1525</td><td></td></tr><tr><td>Rinderalbumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 50 x 75 mm, #1,5 Dicke&nbsp;</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>5075-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Gebogener Spatel</td><td>Katena</td><td>K3-6600</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x mit Ca2+ und Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger 50 x 75 x 1,2 mm</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>5075</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln 21 G x 1-1/2" subkutan</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln 27 G x 1-1/4" subkutan</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305136</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>PAL (Personna)</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen mit rundem Boden 50 mL</td><td>Newegg</td><td>9SIA4SR9M88854</td><td></td></tr><tr><td>Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Quadratisches Wägeschiffchen (81 mm x 81 mm x 25 mm)</td><td>Sigma</td><td>W2876</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Vitrektomiesystem</td><td>BD Visitrec</td><td>585100</td><td>optional</td></tr><tr><td>Spritze 1 mL</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td>Autofluoreszenz-Quencher&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Affymetrix</td><td>20605</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere - 3 mm Schneide</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente und konsistente generierung von retinalen pigmentepithel-/aderhaut-flatmounts aus dem menschlichen auge für die histologische analyse

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

Das retinale Pigmentepithel (RPE) und die Netzhaut sind funktionell und strukturell verbundene Gewebe, die zusammenarbeiten, um die Lichtwahrnehmung und das Sehen zu regulieren. Proteine auf der apikalen RPE-Oberfläche sind eng mit Proteinen auf der Oberfläche des äußeren Segments des Photorezeptors verbunden, was es schwierig macht, das RPE konsequent von den Photorezeptoren / der Netzhaut zu trennen. Wir haben eine Methode entwickelt, um die Netzhaut effizient vom RPE des menschlichen Auges zu trennen, um vollständige RPE/Aderhaut- und Netzhaut-Flatmounts für die separate zelluläre Analyse der Photorezeptoren und RPE-Zellen zu erzeugen. Eine intravitreale Injektion einer hochosmolaren Lösung von D-Mannitol, einem Zucker, der nicht vom RPE transportiert wird, induzierte die Trennung von RPE und Netzhaut über die gesamte hintere Kammer, ohne die RPE-Zellübergänge zu schädigen. Es wurden keine RPE-Pflaster an der Netzhaut beobachtet. Die Phalloidin-Markierung von Aktin zeigte eine RPE-Formerhaltung und ermöglichte eine morphometrische Analyse des gesamten Epithels. Eine auf künstlicher Intelligenz (KI) basierende Software wurde entwickelt, um die RPE-Zellgrenzen genau zu erkennen und zu segmentieren und 30 verschiedene Formmetriken zu quantifizieren. Diese Präpariermethode ist sehr reproduzierbar und kann leicht auf andere Tiermodelle ausgedehnt werden.

Dieses Protokoll führt zu einem einstufigen Bild eines Flatmounts, in dem die Zellposition und 30 Formmetriken für jede korrekt identifizierte RPE-Zelle gemessen werden (Abbildung 2). Ein Ordner mit dem Namen "Processed" wird automatisch im Eingabeverzeichnis generiert. Dieser Ordner enthält vier Unterverzeichnisse mit den Namen "Analyse", "Farbcoded", "Kombinierte Dateien" und "Segmentierte Bilder" sowie einige temporäre Dateien, die während der Analyse generiert werden. Der Ordner "Kombinierte Dateien" enthält eine Tabelle mit allen Formmaßen und eine Tabelle mit den Häufigkeiten der Zellennachbarn aller Dateien kombiniert. Der Ordner "Analyse" enthält eine Tabelle mit allen Formmaßen und eine Tabelle mit den Häufigkeiten der Zellnachbarn für jedes Bild separat. Das Verzeichnis "Segmented Images" enthält die endgültigen binären Masken der RPE-Zellengrenzen. Es kann verwendet werden, um die Qualität der Segmentierung zu bewerten. Das Verzeichnis "Color Coded" enthält Heatmaps für jede Formmessung, um die Formmuster in jedem Bild zu visualisieren. Die Definitionen und Abkürzungen der Formmetrik finden Sie in Tabelle 1.
Manchmal können RPE-Flatmounts Reststücke der Netzhaut enthalten, die nicht sauber entfernt wurden, insbesondere im Bereich des Sehnervs. Die Phalloidin-Färbung der Probe führt zu einem starken Signal von der Netzhaut, was zu Problemen bei der RPE-Zellgrenzsegmentierung führen kann. Einige Kacheln werden vollständig schwarz angezeigt, während die umgebenden Kacheln eine normale Segmentierung aufweisen. Andere helle Objekte, die im Bild vorhanden sein können, verursachen ebenfalls die Erzeugung schwarzer Kacheln (Abbildung 3). In diesen Fällen wird durch die Auswahl einer der Filteroptionen (Schwach, Normal, Stark) im Dropdown-Menü Arti-Filter die Bildung schwarzer Kacheln verhindert.
REShAPE verwendet 8-Bit- oder 16-Bit-Graustufenbilder als Eingabe, aber keine RGB-Bilder. Die Verwendung von RGB-Bildern für die REShAPE-Analyse erzeugt vollständig schwarze Binärbilder. In diesem Fall werden durch die Konvertierung der RGB-Bilder in Graustufen korrekt segmentierte Binärbilder erzeugt (Abbildung 4). In einigen Fällen, in denen die RPE-Ränder nicht korrekt erkannt werden, z. B. wenn die Färbung nicht optimal ist oder wenn die Probe durch einen Kratzer beschädigt ist (Abbildung 5A), können große Zellklumpen als eine einzige sehr große Zelle identifiziert werden (Abbildung 5B). In diesem Fall können große Objekte von der Analyse ausgeschlossen werden, indem der Schwellenwert für die Zellgröße reduziert wird (Abbildung 5C). Dies kann erreicht werden, indem Sie einen niedrigeren Wert in das Textfeld Obere Zellengröße einfügen. Dies führt jedoch zu einer Änderung der Reichweite der Heatmap. Wenn sich ein Forscher dafür entscheidet, ist es auch möglich, den ursprünglichen Heatmap-Bereich (Abbildung 5D) beizubehalten, indem er das Kontrollkästchen Ja in der Funktion "Manuelle Grenzwerte verwenden?" aktiviert. Anschließend muss der Forscher mit der linken Maustaste auf die Schaltfläche Grenzwerte festlegen klicken und die gewünschten Werte in die Textfelder einfügen, um die manuellen Grenzwerte festzulegen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig02.jpg"> Abbildung 2: Vollständige morphometrische Analyse einer gesamten menschlichen RPE-Monoschicht. (A) Eine Ansicht mit geringer Vergrößerung eines gesamten menschlichen RPE/Aderhaut-Flatmounts (Magenta: Phalloidin). (B) Eine vergrößerte Ansicht von Phalloidin-gefärbten RPE-Zellen. (C) REShAPE-generierte Segmentierung der RPE-Zellgrenzen für ein gesamtes menschliches RPE/Aderhaut-Flatmount und (D) die entsprechende vergrößerte Ansicht. (E) Eine softwaregenerierte Heatmap, die die Zellfläche der einzelnen RPE-Zellen im gesamten menschlichen Flatmount veranschaulicht. Die thermische Skala in der oberen linken Ecke zeigt den Bereich der verwendeten Werte an. (F) Die entsprechende vergrößerte Ansicht, in der einzelne RPE-Zellen nach Fläche gefärbt angezeigt werden. Maßstabsbalken = (B,D,F) 50 μm, (A,C,E) 5 mm. Abkürzung: RPE = retinales Pigmentepithel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig03.jpg"> Abbildung 3: Filterung von hellen Artefakten. (A) Ein menschliches RPE-Flatmount, das auf Zellränder gefärbt ist (Magenta: Phalloidin), kann helle Bereiche (grüne Rechtecke darstellen), die die Segmentierung stören. (B) Die RPE-Zellenrandsegmentierung des gesamten Flatmounts enthält drei komplett schwarze Kacheln (grüne Pfeile), die hellen Fluoreszenzbereichen entsprechen. (C,E) Zwei der schwarzen Kacheln entsprechen Bereichen, die helle Punkte enthalten, bei denen es sich möglicherweise um Trümmer handelt. (D) Eine der schwarzen Kacheln wurde durch ein Stück neuronaler Netzhaut um den Sehnerv herum erzeugt, das nicht korrekt entfernt wurde. Die Teile der neuronalen Netzhaut sind wesentlich heller als die RPE-Schicht und behindern die Zellsegmentierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig04.jpg"> Abbildung 4: Eingabebild erforderlich. Die RPE-Zellen, die für die Zellränder gefärbt wurden, wurden als (A) RGB- oder (B) Graustufen-16-Bit-Bilder für die REShAPE-Analyse gespeichert. (C) Das Ergebnis der RBG-Bildanalyse ist ein schwarzes Binärbild, (D) während die Analyse des Graustufenbildes eine korrekt segmentierte Binärdatei der Zellenränder erzeugt. REShAPE kann nur 8-Bit- oder 16-Bit-Graustufenbilder analysieren. Maßstabsbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64761/64761fig05v2.jpg"> Abbildung 5: Suboptimale Ergebnisse . (A) Ein Bild eines Teils der RPE-Monoschicht, in dem die mit Phalloidin gefärbten Zellen versehentlich zerkratzt wurden. (B) Eine Heatmap von RPE-Zellen, die nach der Dimension der Zellfläche eingefärbt sind. Ein großer Schwellenwert für die obere Zellengröße schließt große Objekte in die Analyse ein. (C) Eine Heatmap der Zellfläche, in der ein kleinerer Schwellenwert für die obere Zellengröße gewählt wurde, um große Objekte von der Analyse auszuschließen. (D) Eine Heatmap für den Zellbereich, in der ein kleinerer Schwellenwert für die obere Zellengröße gewählt und manuelle Grenzwerte festgelegt wurden, um den ursprünglich verwendeten Heatmap-Bereich beizubehalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761fig05largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1: REShAPE-Parameter. Die Tabelle enthält die Definition der einzelnen Parameter und die Abkürzungen, die in den Rohtabellenkalkulationen ("_Data.csv"-Dateien) und für die Heatmaps verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64761/64761_Table-1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Wir beschreiben eine Methode, um retinales Pigmentepithel (RPE) effizient von der Netzhaut im menschlichen Auge zu trennen und ganze RPE/Aderhaut-Flatmounts für histologische und morphometrische Analysen des RPE zu generieren.

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Diese Methode hilft, phänotypische Unterschiede von RP-Zellen über die gesamte menschliche Netzhaut hinweg zu verstehen. Die von Davide Ortolan entwickelte Dissektionstechnik ist sehr reproduzierbar, um eine Ablösung zwischen RP und Netzhaut zu erzeugen. Und die REShAPE-Software ist wirklich bemerkenswert bei der Analyse großer Bilder von RP-Flachhalterungen.Die Methode, die Davide entwickelt hat, kann verwendet werden, um regionale Unterschiede im RP-Phänotyp von Patienten mit verschiedenen Arten von degenerativen Netzhauterkrankungen zu untersuchen. Schneiden Sie zunächst das konische 50-Milliliter-Röhrchen etwas unter die 5-Milliliter-Marke. Befestigen Sie die Schlauchspitze mit Heißkleber am Boden des Wiegeboots.Mischen Sie dann die beiden Komponenten des Silikonelastomer-Kits im Verhältnis 10 zu 1, um Lufteinschlüsse zu vermeiden. Gießen Sie die Mischung in das Wiegeboot, das dieses kugelförmige Stück des runden Bodenrohrs enthält. Das Silikon über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.Entfernen Sie das Wiegegefäß und das Rundrohr aus der ausgehärteten Silikonform. Füllen Sie zuerst eine 1-Milliliter-Spritze mit 1700 Millimol D-Mannitol-Lösung und befestigen Sie sie an einer 21-Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel durch die Pars plana ein, um eine Punktion der Vorderkammer des Auges zu vermeiden, und injizieren Sie 400 Mikroliter der Lösung in den Glaskörper.Lassen Sie das Auge 45 Minuten bei Raumtemperatur. Mit einer feinen Schere und einer Pinzette die Vorderkammer auf Höhe der Pars plana aufschneiden. Füllen Sie die hintere Augenkammer mit kalzium- und magnesiumhaltigem DPBS.Lokalisieren Sie unter dem Stereomikroskop die Makula, die als gelber Fleck auf der Netzhaut visualisiert wird. Schneiden Sie das Auge in Quadranten, nämlich nasal, temporal, superior und inferior, und stellen Sie sicher, dass die Makularegion erhalten bleibt. Entfernen Sie die Nadeln, wenn sie im Weg sind.Übertragen Sie den Schmetterling in die hintere Augenkammer in eine 100-Millimeter-Petrischale, die DPBS mit Kalzium und Magnesium enthält. Bevor Sie die Netzhaut entfernen, markieren Sie das Blütenblatt, das die Makula enthält, indem Sie einen V-förmigen Schnitt im Ziliarand machen. Heben und schneiden Sie den gesamten Glaskörper, der auf der Netzhaut liegt.Schneiden Sie die Netzhaut von den Ziliarändern in allen Blütenblättern ab, um sicherzustellen, dass das RPE nicht zerkratzt wird. Legen Sie das Gewebe in 4% PFA und inkubieren Sie es für eine Stunde. Dreimal mit kalzium- und magnesiumhaltigem DPBS waschen.Füllen Sie das Gewebe in einen mit dem gleichen Puffer gefüllten Behälter und lagern Sie es bei 4 Grad Celsius. Als nächstes überführen Sie die Probe in eine 100-Millimeter-Petrischale, die DPBS mit Kalzium und Magnesium enthält. Stanzen Sie den Sehnervenkopf mit einem 1,5-Millimeter-Biopsiestempel aus.Sammeln Sie die Netzhaut und lagern Sie sie im selben Puffer bei 4 Grad Celsius. Um die Sklera aus der RPE-Aderhaut zu entfernen, heben Sie die RPE-Aderhautschicht vorsichtig von der Peripherie ab. Schneiden Sie dann mit einer Vannas-Federschere die Aderhautgefäße und das Bindegewebe ab, die sich zwischen der Sklera und dem RPE befinden.Nach vollständiger Trennung von der Sklera sammeln Sie die RPE-Aderhautschicht. Das Gewebe in einen mit Kalzium und Magnesium gefüllten Behälter überführen und bei 4 Grad Celsius lagern. Übertragen Sie die RPE-Aderhaut in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.Blockieren und permeabilisieren Sie die Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur mit Phalloidin, das mit 647-Fluorophor in einer Verdünnung von 1 bis 250 im Permeabilisierungspuffer konjugiert ist. Dreimal in kalzium- und magnesiumhaltigen DPBS waschen.Übertragen Sie die RPE-Aderhautprobe auf einen 50 x 75 Millimeter großen Glasobjektträger und glätten Sie ihn. Schneiden Sie jedes Blütenblatt in zwei Teile, um die Probe flacher zu machen. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift eine Kontur der flachen Halterung.Um die Lipofuszin-Autofluoreszenz zu löschen, fügen Sie 500 Mikroliter der Autofluoreszenzlöschlösung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Gründlich in kalzium- und magnesiumhaltigem DPBS waschen. Entfernen Sie den DPBS und fügen Sie das Einhängemedium hinzu.Legen Sie ein Deckglas auf die flache Halterung und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Öffnen Sie die Software. Wählen Sie auf der Registerkarte "Verzeichnisse" die Eingabe- und Ausgabeordner aus.Lassen Sie die Software im Ausgabeverzeichnis automatisch den Pfad zum Eingabeverzeichnis oder Prozess ändern. Alternativ können Sie das Ausgabeverzeichnis auch manuell ändern. Um Heatmaps zu erstellen, wählen Sie alle aus dem Dropdown-Menü auf der Registerkarte Farbbilder erstellen.Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Nein" in der Funktion "Manuelle Grenzwerte verwenden", damit die Software die in jedem Bild erkannten Minimal- und Maximalwerte verwenden kann. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Ja, um den Wertebereich für jede Shape-Metrik-Heatmap manuell anzupassen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Grenzwerte festlegen und fügen Sie Werte in die Textfelder ein, um Bereiche für die einzelnen Parameter auszuwählen.Nachdem Sie die gewünschten Werte geändert haben, klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie auf niedrige Standardwerte, um alle Grenzwerte zurückzusetzen. Wenn Sie einen Schwellenwert für die Zellengröße in einer niedrigeren Zellengröße auswählen möchten, fügen Sie die Größe der kleinsten Zelle ein, die in die Analyse einbezogen werden soll.Fügen Sie in die obere Zellengröße die Größe der größten Zelle ein, die eingeschlossen werden soll. Aktivieren Sie unter Konvertieren von Pixeln in reelle Einheiten das Kontrollkästchen Nein, um die Analyse in Pixeleinheiten auszuführen, und aktivieren Sie Ja, um die Analyse in Mikrometern auszuführen. Geben Sie unter Länge der Maßstabsbalkenpixel den Pixelwert in das Textfeld ein.Geben Sie in Länge des Maßstabsbalkens Mikrometer den entsprechenden Abstand in Mikrometern ein. Um die Analyse zu starten, klicken Sie auf Go. Dieses Protokoll führt zu einem einstufigen Bild einer flachen Halterung, bei dem die Zellposition durch REShAPE-generierte Segmentierung der RPE-Zellgrenzen identifiziert wird.Außerdem werden 30 Formmetriken, einschließlich der Zellfläche der einzelnen RPE-Zellen, für jede korrekt identifizierte RPE-Zelle gemessen. Schwarze Kacheln, die von Resten der Netzhaut oder anderen hellen Objekten stammen, können entfernt werden, indem Sie eine der Filteroptionen auswählen, die im Dropdown-Menü RT-Filter verfügbar sind. Die Verwendung von RBG-Bildern für die Reshape-Analyse erzeugt vollständig schwarze Binärbilder.In diesem Fall werden durch die Konvertierung der RGB-Bilder in Graustufen korrekt segmentierte Binärbilder erzeugt. Wenn die Färbung nicht optimal ist oder wenn die Probe durch einen Kratzer beschädigt ist, können große Zellklumpen als eine einzige sehr große Zelle identifiziert werden. In diesem Fall können große Objekte von der Analyse ausgeschlossen werden, indem der Schwellenwert für die Zellengröße geändert wird.Um ein flaches Gewebe zu erhalten, müssen RP und Aderhaut von der Sklera getrennt werden, auch wenn diese Schritte lange dauern können. Nach der Generierung der RP-Flachhalterung ist es möglich, zusätzliche RPE-Marker zu färben, so dass Sie verschiedene Bereiche der RP-Monoschicht untersuchen können. Mit dieser Methode haben wir fünf verschiedene RP-Populationen entdeckt, die unterschiedlich empfindlich auf verschiedene degenerative Netzhauterkrankungen reagieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir bieten eine reproduzierbare Methode zur Kultivierung konfluente Monolayer von menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen (hfRPE) Zellen, die Morphologie, Physiologie, Polarität und Protein-und Genexpression von adulten nativen Gewebe aufweisen. Diese Arbeit hat zu einem Tiermodell verschiedener Augenerkrankungen erweitert worden.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren die Kultivierung der retinalen Pigment (RPE) Epithelzellen auf Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran. Diese Methode ist geeignet, RPE Zellen Verhalten auf einem kompromittierten extrazelluläre Matrix zu studieren.

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Diese Studie zielt darauf ab, ein neuartiges humanes organotypisches Netzhautkulturmodell (HORC) zu entwickeln, das eine Beeinträchtigung der Netzhautintegrität während der Behandlung mit Explanten verhindert. Dies wird erreicht, indem die Netzhaut mit dem darüber liegenden Glaskörper und dem darunter liegenden retinalen Pigmentepithel-Choroid (RPE-Choroid) und Sklera kultiviert wird.

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.

Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfeld-Cluster und zur Erzeugung neuro-retinaler Organoide unter Verwendung vereinfachter Kulturbedingungen, die sowohl adhärente als auch Suspensionskultursysteme umfassen. Auch andere Augenzelltypen, wie das RPE und das Hornhautepithel, können aus reifen Augenfeldern in Netzhautkulturen isoliert werden.

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

In dieser Arbeit wird ein alternatives Flatmount-Retina-Präparat vorgestellt, bei dem die Entfernung von Photorezeptor-Zellkörpern eine schnellere Antikörperdiffusion und einen verbesserten Patch-Pipettenzugang zu inneren Netzhautneuronen für Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Split Retina als verbessertes Flatmount-Präparat zur Untersuchung von Neuronen der inneren Kernschicht in der Netzhaut von Wirbeltieren

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Lernen Sie eine reproduzierbare Präparationstechnik zur Trennung von retinalem Pigmentepithel und Netzhaut aus menschlichen Augen für histologische Analysen. Diese Methode ermöglicht morphometrische Untersuchungen mit REShAPE-Software.

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse (Video) | JoVE Journal

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

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