Name: Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Erfahren Sie Calcium-Bildgebung in primären sensorischen Neuronen von Pirt-GCaMP3-Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung von bis zu 1.800 Neuronen gleichzeitig.

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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants R01DE026677 und R01DE031477 (an Y.S.K.), UTHSCSA Startup Fund (Y.S.K.) und einen Rising STAR Award der University of Texas System (Y.S.K.) unterstützt.

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<li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cytoNet%3A+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).</li>
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<li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li>
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<li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li>
<li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li>
<li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Anhaltende Schmerzen treten bei einer Vielzahl von Erkrankungen auf und beeinträchtigen und/oder verringern die Lebensqualität von etwa 8 % der Menschen29. Primäre sensorische Neuronen erkennen schädliche Reize auf der Haut, und ihre Plastizität trägt zu anhaltenden Schmerzen bei8. Während Neuronen in Zellkulturen und Explantaten untersucht werden können, werden sie dadurch aus ihrem normalen physiologischen Kontext entfernt. Die chirurgische Exposition des DRG, gefolgt von...

Primäre sensorische Neuronen innervieren direkt die Haut und leiten somatosensorische Informationen zurück an das zentrale Nervensystem 1,2. Dorsale Wurzelganglien (DRGs) sind Zellkörpercluster von 10.000-15.000 primären sensorischen Neuronen 3,4. DRG-Neuronen weisen unterschiedliche Größe, Myelinisierungsgrade sowie Gen- und Rezeptorexpressionsmuster auf. Neuronen mit kleinerem Durchmesser umfassen schmerzempfindliche Neuronen, und Neuronen mit größerem Durchmesser reagieren typischerweise auf nicht-schmerzhafte mechanische Reize 5,6. Störungen in den primären sensorischen Neuronen wie Verletzungen, chronische Entzündungen und periphere Neuropathien können diese Neuronen für verschiedene Reize sensibilisieren und zu chronischen Schmerzen, Allodynie und Schmerzüberempfindlichkeit beitragen 7,8. Daher ist die Untersuchung von DRG-Neuronen wichtig, um sowohl die Somatosensibilität im Allgemeinen als auch viele Schmerz- und Juckreizerkrankungen zu verstehen.
Neuronen, die in vivo feuern, sind für die Somatosensibilität unerlässlich, aber bis vor kurzem waren Werkzeuge zur Untersuchung intakter Ganglien in vivo auf eine relativ kleine Anzahl von Zellen beschränkt 9. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige Methode, um die Aktionspotentiale oder Aktivitäten von Neuronen auf Populationsebene in vivo als Ensemble zu untersuchen. Die Methode verwendet Bildgebung, die auf der zytoplasmatischen Ca2+-Dynamik basiert. Die Ca 2+ empfindlichen Fluoreszenzindikatoren sind aufgrund der normalerweise niedrigen Konzentration von zytoplasmatischem Ca2+ gute Proxies für die Messung der zellulären Aktivität. Diese Indikatoren ermöglichten die gleichzeitige Überwachung von Hunderten bis mehreren Tausend primären sensorischen Neuronen bei Mäusen 9,10,11,12,13,14,15,16 und Ratten 17. Die in dieser Studie beschriebene Methode der In-vivo-Ca2+-Bildgebung kann verwendet werden, um Reaktionen auf Populationsebene auf mechanische, kalte, thermische und chemische Reize direkt zu beobachten.
Das Phosphoinositid-bindende Membranprotein Pirt wird in fast allen (>95%) primären sensorischen Neuronen in hohen Konzentrationen exprimiert18,19 und kann verwendet werden, um die Expression desCa2+-Sensors GCaMP3 zu steuern, um die Neuronenaktivität in vivozu überwachen 20. In diesem Protokoll werden Techniken zur Durchführung von In-vivo-DRG-Operationen, Ca2+-Bildgebung und Analyse im DRG der rechten Lendenwirbelsäule 5 (L5) von Pirt-GCaMP3-Mäusen14 unter Verwendung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Anased Injection (Xylazin)</td><td>Covetrus, Akorn</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>C Epiplan-Apochromat 10x/0,4 DIC</td><td>Cal Zeiss</td><td>422642-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Applikatoren mit Baumwollspitze</td><td>McKesson</td><td>24-106-1S Gebogener</td><td></td></tr><tr><td>Hämostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperaturregler</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperaturregler Heizkissen</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Keramikbeschichtete Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>FHC DC Temperaturregler</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso (Isofluran)</td><td>MWI Animal Health, Piramal Group</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (Ketamin)</td><td>Zoetis</td><td>KET-00002R2</td><td></td></tr><tr><td>Lumineszierendes grünes Bühnenband</td><td>JSITON/ Amazon</td><td>B803YW8ZWL</td><td></td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 Isofluran Vaporizer</td><td>Midmark</td><td>91305430</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierfeder Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierfederschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Mini Rektale Thermistorsonde</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Betriebsschere</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J Mäuse</td><td>Johns Hopkins University</td><td>N/A</td><td>Beide Geschlechter können gleich gut abgebildet werden. Mäuse sollten mindestens 8 Wochen alt sein, da der Pirt-Promotor bei jüngeren Mäusen schwach oder intermittierend exprimiert wird.</td></tr><tr><td>SMALGO Algometer für Kleintiere</td><td>Bioseb In vivo Research Instruments</td><td>BIO-SMALGO</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Kopf Modell 923-B</td><td>923-B</td><td></td></tr><tr><td>td-Tomato C57BL/6J Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>Top Plate, 6 in x 10 in</td><td>Newport</td><td>290-TP</td><td></td></tr><tr><td>TrpV1-Cre C57BL/6J Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>17769</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 800 Konfokalmikroskop</td><td>Cal Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zen (Blue Edition) 2.6</td><td></td></tr></tbody></table>

im lebenden organismus calcium-bildgebung neuronaler ensembles in netzwerken primärer sensorischer neurone in intakten dorsalen wurzelganglien

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Die Ca 2+-Bildgebung kann als Proxy für die zelluläre Aktivität verwendet werden, einschließlich Aktionspotentialen und verschiedener Signalmechanismen, die den Eintritt von Ca 2+ in das Zytoplasma oder die Freisetzung intrazellulärer Ca 2+-Speicher beinhalten. Die Pirt-GCaMP3-basierte Ca2+ Bildgebung von primären sensorischen Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) in Mäusen bietet den Vorteil der gleichzeitigen Messung einer großen Anzahl von Zellen. Bis zu 1.800 Neuronen können überwacht werden, so dass neuronale Netzwerke und somatosensorische Prozesse als Ensemble in ihrem normalen physiologischen Kontext auf Populationsebene in vivo untersucht werden können. Die große Anzahl der überwachten Neuronen ermöglicht die Erkennung von Aktivitätsmustern, die mit anderen Methoden nur schwer zu erkennen wären. Stimuli können auf die Hinterpfote der Maus angewendet werden, so dass die direkten Auswirkungen von Stimuli auf das DRG-Neuronenensemble untersucht werden können. Die Anzahl der Neuronen, die Ca 2+-Transienten produzieren, sowie die Amplitude der Ca2+-Transienten weisen auf eine Sensitivität gegenüber bestimmten sensorischen Modalitäten hin. Der Durchmesser der Neuronen gibt Aufschluss über aktivierte Fasertypen (nicht-schädliche Mechano- vs. schädliche Schmerzfasern, Aβ-, Aδ- und C-Fasern). Neurone, die spezifische Rezeptoren exprimieren, können genetisch mit td-Tomato und spezifischen Cre-Rekombinasen zusammen mit Pirt-GCaMP markiert werden. Daher bietet die Pirt-GCaMP3 Ca2+ Bildgebung von DRG ein leistungsfähiges Werkzeug und Modell für die Analyse spezifischer sensorischer Modalitäten und Neuronensubtypen, die als Ensemble auf Populationsebene fungieren, um Schmerz, Juckreiz, Berührung und andere somatosensorische Signale zu untersuchen.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Bilder von L5 dorsalen Wurzelganglien von Pirt-GCaMP3 Mäusen. (A,D) Hochauflösende Einzelbildscans von L5 dorsalen Wurzelganglien von Pirt-GCaMP3 Mäusen werden gezeigt. (B,E) . Durchschnittliche Intensitätsprojektionen von 15 Bildern von Pirt-GCaMP3 L5 DRG-Ganglien aus Pa...

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Die Anzahl der Neuronen, die mit dieser Methode überwacht werden, ermöglicht die Erfassung von Neuronennetzwerkdaten, die mit älteren oder anderen Methoden nicht möglich wären. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, fast 2.000 primäre sensorische Neuronen gleichzeitig zu überwachen und direkt auf Reize zu reagieren, die auf die Hinterpfote angewendet werden. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut, um therapeutische Interventionen bei peripherer Allodynie und Schmerzüberempfindlichkeit zu untersuchen.Diese Methode kann für die Untersuchung von Trigeminus- oder Genikulatganglien angepasst oder mit genetisch kodierten Sensoren für Spannungs- oder Zellsignalmoleküle, wie z. B. zyklisches AMP, verwendet werden. Es braucht Übung, um diese Operation durchzuführen. Sie können an bis zu sechs dorsalen Wurzelganglien an einem einzigen Tier üben.Die Prozedur wird von mir selbst demonstriert, mit Unterstützung von John Shannonhouse und Mr. Ruben Gomez. Legen Sie die Maus zunächst auf ein beheiztes Pad, um die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten. Lokalisieren Sie die Vergrößerung der Lendenwirbelsäule, indem Sie den Beckenknochen der Maus abtasten.Rasieren Sie dann

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Research

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Neuroscience

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Quelle: Shannonhouse, J., et al. In vivo Kalzium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Spinalganglien. J. Vis. Exp. (2023). Das Video zeigt eine in vivo Calcium-Bildgebungstechnik zur Überwachung der neuronalen Aktivität in den Spinalganglien (DRG) einer transgenen Maus. DRG-Neuronen exprimieren einen Kalziumindikator, der die Fluoreszenzintensität bei Bindung an Kalzium erhöht. Mechanische oder thermische Reize, die auf eine Hinterpfote...

In vivo Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in den intakten Spinalwurzelganglien einer Maus

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Wir beschreiben ein experimentelles Verfahren zur Messung der neuronalen Aktivität durch dual optische Fenster über bilaterale primären somatosensorischen Corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene Mäuse mit 2-Photonen (2P) Mikroskopie in Vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

Das vorliegende Protokoll beschreibt in vivo Calcium-Bildgebung zur Messung der Reaktionen von Ensembles von lumbal-6 DRG-Neuronen auf somatische und viszerale Reize. Neuronen, die auf unterschiedliche Reize reagieren, lassen sich gründlich vergleichen. Dieses Protokoll ist wertvoll für die Untersuchung von Mechanismen des viszeralen Schmerzes und der somatischen Stimulation, wie z. B. der Akupunktur.

im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung der Reaktion von Neuronen der Spinalganglien auf somatische und viszerale Reize

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Diese Studie stellt eine chirurgische Manipulation vor, um das T-DRG in anästhesierten Mäusen für die in vivo Kalziumbildgebung freizulegen, zusammen mit synchronen EKG-Aufzeichnungen. Diese Methode stellt ein hochmodernes Werkzeug dar, um die periphere elektrische Nervenstimulation und die Eingänge der thorakalen viszeralen Organe sowie deren Wechselwirkungen auf der primären sensorischen Ebene zu untersuchen.

In-vivo-Calcium-Bildgebung und EKG-Aufzeichnung von thorakalen dorsalen Wurzelganglien (DRG) zur Untersuchung der peripheren Nervenstimulation

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die GCaMP-Kalziumbildgebung von intakten Trigeminusganglien (TG)-Neuronen. Diese Beschreibung umfasst TG-Expositionsoperationen, konfokale In-vivo-Mikroskopie-Bildgebung von TG-Neuronen, Anwendung somatischer Stimuli während der mikroskopischen Bildgebung von TG-Neuronen und Analyse von in vivo GCaMP-Calcium-Bildgebungsdaten.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Spontane Aktivitäten zu entwickeln neuronalen Netzen kann mit Hilfe AM-Ester Formen von Calcium-sensitiven Indikator Farbstoffe werden. Änderungen der intrazellulären Calcium, was darauf hinweist neuronale Aktivierung, werden als vorübergehende Veränderungen in Indikator Fluoreszenz mit ein-oder Zwei-Photonen-Imaging nachgewiesen werden. Dieses Protokoll kann für eine Reihe von entwicklungs-abhängige neuronale Netze angepasst...

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

In diesem Artikel stellen wir schnell Mikro-Iontophorese von Neurotransmittern als eine Technik, um die Integration von postsynaptischen Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu untersuchen.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

Die Implantation organisiert Arrays von Mikrodrähten für den Einsatz in Single-Unit-elektrophysiologischen Ableitungen präsentiert eine Reihe von technischen Herausforderungen. Verfahren zum Durchführen dieses Verfahrens und die notwendige Ausrüstung beschrieben. Auch ist der wirtschaftliche Einsatz der organisierten Mikroarrays aus unterschiedlichen neuronalen Teilbereiche mit hoher räumlicher Selektivität aufzeichnen diskutiert.

Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

Erfahren Sie Calcium-Bildgebung in primären sensorischen Neuronen von Pirt-GCaMP3-Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung von bis zu 1.800 Neuronen gleichzeitig.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien (Video) | JoVE Journal

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

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