Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im sensorischen Forschungsbereich zu beantworten, wie z. B. periphere Nozieption. Der Hauptvorteil dieser technischen ist, dass die Untersuchung des zellulären Mechanismus der sensorischen Neuronen mit dem Modell, das am meisten simuliert physiologischen Zustand. Sammeln Sie die lenbale Dorsalwurzel ganglia aus dem Stamm einer zwei bis drei Wochen alten Ratte.

Beginnen Sie mit zwei Schnitten an den Seiten der Wirbelsäule und einem seitlichen Schnitt, um die rostrale Ausdehnung der Lendenwirbelsäule zu markieren. Verwenden Sie dann KnochenschneidenZange, um die Rückenmuskulatur der Wirbelsäule zu entfernen. Als nächstes entfernen Sie den dorsalen Teil der Wirbel und setzen Sie das Rückenmark frei.

Verwenden Sie dann eine Sezierschere und Zange, um das Rückenmark zu entfernen. Identifizieren Sie die Lendenwirbel DRG, indem Sie Wirbel aus der letzten Rippe zählen. Dieses Diagramm zeigt die Wirbelpositionen.

Verwenden Sie Mikroschere, um die 12 bilaterale Lenden-DRG von L1 bis L6 zu sammeln. Entfernen Sie alle angeschlossenen neuronalen Fasern, um die Reinheit der Kultur zu verbessern. Jede Lendenwirbel-DRG auf ein 35-Millimeter-Kulturgericht mit zwei Millilitereiskaltem Serum-freien Medium übertragen. Die DRG-haltige 35-Millimeter-Schale in eine laminare Haube geben und das DRG dreimal per Pipette mit serumfreiem Medium waschen.

Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die DRGs auf eine neue 35-Millimeter-Kulturschale zu verschieben, die zwei Milliliter steriler Kollagennase Typ 1A enthält. Legen Sie das Gewebe in Kollagenase-Lösung in der 37 Grad Celsius Gewebekultur Inkubator für 30 Minuten zu beginnen Dissoziation der Zellen. Nach der Inkubation die Kollagenaselösung entfernen und das DRG dreimal in zwei Millilitern von Hanks ausgewogener Salzlösung waschen.

Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmte 0,05%Trypsin EDTA in die Schale, und verdauen Sie die DRG im Inkubator für 30 Minuten wie zuvor. Nach der Verdauung verwenden Sie eine Glaspipette, um die zwei Milliliter DRG-haltige Lösung auf ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu übertragen. Die DRG könnte an der Glaspipette kleben, so dass dieser Schritt mit Vorsicht durchgeführt werden sollte.

Der tatsächliche Verlust kann vermieden werden, indem die DRG-haltige Lösung im Kegelende der Glaspipette gehalten und die Lösung langsam, aber ohne Pause in das Zentrifugenrohr übertragen wird. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 290 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren den Überstand entfernen und weitere zwei Milliliter serumfreies Medium hinzufügen, um das DRG wieder auszusetzen.

Wiederholen Sie die Wäsche zweimal, mit zwei Millilitern vorgewärmten Kulturmedium, um das Gewebe nach der letzten Zentrifugation wieder auszusetzen. Verwenden Sie die zuvor vorbereitete sterile flammpolierte Pipette, um das DRG etwa 60 Mal manuell zu trituieren. Als nächstes entfernen Sie eine poly-L-Lysin beschichtete 24-Well-Platte, die einen Milliliter Kulturmedium pro Brunnen pro Brunnen enthält, aus dem CO2-Inkubator.

Aspirieren Sie das inkubierte Kulturmedium aus dem Gericht. Säen Sie die DRG-Zellen von einer Ratte in vier der Brunnen. Dies ergibt eine Saatdichte von etwa 500.000 Zellen pro Brunnen.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das Kulturmedium durch ein Medium, das mit 10 Mikromolaren AraC und 100 Nanogramm pro Milliliter NGF ergänzt wird. Am dritten Tag nach der Zellbeschichtung das Medium auf 0,5 Milliliter vorgewärmtes serumfreies Medium ändern und eine Stunde lang inkubieren. Während der Inkubation 50 Millimolar siRNA in einem Mikroliter RNase-freiem Wasser zu 12,5 Mikroliter serumfreies Medium pro Transfektion hinzufügen.

Dann Pipette 2,5 Mikroliter Transfektionreagenz in 10 Mikroliter serumfreies Medium für jede Transfektion. Mischen Sie beide Lösungen durch Pipetten, und inkubieren Sie diese gemischte Transfektionslösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten die Transfektionslösung in die Brunnen der DRG-haltigen 24-Well-Platte geben und durch sanftes Schütteln mischen.

Nach einer sechsstündigen Inkubation, fügen Sie 0,5 Milliliter Kulturmedium mit 20%FBS, 10 Mikromolar AraC, und 100 Nanogramm pro Milliliter NGF in jeden Brunnen der Zellen. Schließlich inkubieren Sie die DRG in einem 37 Grad Celsius CO2-Inkubator für weitere 66 Stunden. Am sechsten Tag nach der Beschichtung und 72 Stunden nach der siRNA-Transfektion ändern Sie das Kulturmedium auf 200 Mikroliter serumfreies Medium.

Nach einer 30-minütigen Inkubation einen Mikroliter der Stimulationschemikalie hinzufügen und sanft durch Pipettieren mischen. Hier kommen der NPFFR2-Agonist, dNPA und das entsprechende Fahrzeug zum Einsatz. Nach der Inkubation für den gewünschten Zeitraum, sammeln Sie das Kulturmedium aus dem Kulturgericht, und Zentrifuge bei 5000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um alle ausgesetzten Verunreinigungen zu entfernen.

Den Überstand aus der Zentrifugation sammeln und bei Bedarf mit phosphatgepufferter Saline verdünnen. Assay die Ebenen der Neurotransmitter mit handelsüblichen Enzym-Immunoassay-Kits. Am ersten Tag wurde der Zellkörper eines einzelnen Neurons, der durch den Pfeil angezeigt wurde, an der Unterseite einer Schale befestigt.

Eine Gliazelle, die durch eine Pfeilspitze angezeigt wird, ist ebenfalls vorhanden. Die Gliazellen duplizierten und erweiterten Prozesse, um den Zellkörper des sensorischen Neurons am zweiten Tag zu umgeben, ein Prozess, der am dritten Tag noch stärker in den Vordergrund gerückt war. In einer anderen Kultur wurde CGRP-Protein gefärbt, um die Form von Neuronen zu offenbaren.

CGRP-Proteinfärbung erscheint im Zytoplasma und Axonen sensorischer Neuronen. Die kerntechnischen Morphologien von Neuronen und Gliazellen sind deutlich, wenn sie mit DAPI gefärbt werden. Die Neuronen haben einen größeren und abgerundeteren Kern als Gliazellen.

Im Vergleich dazu sind die Kerne von Glial ovaler. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zweieinhalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das dorsale Wurzelganglion sezieren und kulturieren können, und es als Werkzeug verwenden, um die zugrunde liegenden physiologischen Funktionen zu untersuchen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Primärzellen viel schwieriger sein kann als die Arbeit mit regulären Zelllinien, und sanft zu sein ist immer der beste Weg, wenn Sie diesen Eingriff durchführen.