Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gesunde reine Populationen von Kleinhirn-Körnerneuronen zu erzeugen und sie genetisch zu manipulieren und verschiedene Mechanismen der neuronalen Schädigung in der Primärkultur in vitro zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der neuronalen Schädigung zu beantworten. Wir verwenden dieses Protokoll, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen von neuronalen Verletzungen nach akuten Hirnschäden und neurogenerativen Erkrankungen zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass wir mit dem Kultursystem verschiedene Mechanismen des Zelltods wie Exzitotoxizität, oxidativen Stress, DNA-Schäden und Entwicklungsereignisse modellieren können. Obwohl diese Methode Einblicke in neuronale Verletzungen liefern kann, kann sie auch mit Kleinhirnneuronen von Ratten verwendet werden, um die neuronale Aktivität und Morphogenese als Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Nebenereignisse zu untersuchen. Um das Gehirn einer sechs bis sieben Tage alten Maus zu extrahieren, greifen Sie mit einer Pinzette nach einem Kopf und schneiden Sie mit einer Mikrodissektionsschere die Haut von vorne zum Kopf hin.

Schiebe die Haut zurück, um den Schädel freizulegen. Als nächstes dringen Sie mit der Spitze der Schere in den Schädel ein und schneiden nach vorne und seitlich. Achten Sie darauf, das Kleinhirn nicht zu beschädigen und die Identifizierung und Entfernung von Hirnhäuten zu erleichtern, und verwenden Sie dann eine Pinzette, um den Schädel zurückzuziehen und das Gehirn freizulegen.

Mit einer Pinzette oder einem Spatel das Gehirn vorsichtig in eine kühle Sezierlösung herauskitzeln. Um das Kleinhirn zu isolieren, legen Sie das Gehirn in die mit Magnesiumsulfat versetzte Sezierlösung und halten Sie die Lösung und das Gehirn auf Eis. Entfernen Sie unter dem Dissektionsmikroskop die Hirnhäute mit einer feinen Pinzette und präparieren Sie dann das Kleinhirn aus dem Gehirn in einer mit Magnesiumsulfat angereicherten Dissektionslösung.

Dies hilft beim Ablösen der verbleibenden Hirnhäute und ermöglicht es einem, zwischen den Schichten zu gehen, um die Kleinhirnfalten zu reinigen. Das Vorhandensein von Hirnhäuten ist eine neuronale Kultur, die zu ungesunden Zellen und schließlich zum Zelltod führt. Daher ist es wichtig, eine vollständige Entfernung der Hirnhäute sicherzustellen, bevor mit der Kultur fortgefahren wird.

Drehen Sie danach das Kleinhirn auf seine ventrale Seite und sorgen Sie für die Entfernung des Plexus choroideus. Ziehen Sie dann das Kleinhirn in eine 35-Millimeter-Schale, die einen Milliliter mit Magnesiumsulfat angereicherte Dissektionslösung enthält. Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke und geben Sie es in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern Magnesiumsulfat-gepufferter Dissektionslösung.

In diesem Schritt zentrifugieren Sie das 15-Milliliter-Röhrchen mit dem gehackten Hirngewebe fünf Minuten lang bei 644 mal g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie danach den Überstand und fügen Sie 10 Milliliter Trypsin-Dissektionslösung hinzu. Schütteln Sie dann den Tisch 15 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie zwei Milliliter Trypsin-Inhibitor-Lösung, einen in das Röhrchen und schaukeln Sie vorsichtig zwei Minuten lang. Anschließend zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 644 mal g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach fünf Minuten den Überstand und fügen Sie zwei Milliliter Trypsin-Inhibitor-Lösung zwei hinzu, bevor Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Zerreiben Sie dann das Gewebe in der 15-Milliliter-Tube, bis die Lösung trüb wird. Lassen Sie es fünf Minuten ruhen. Entfernen Sie dann den klaren Überstand und geben Sie ihn in ein neues Röhrchen, das einen Milliliter Calciumchlorid enthält.

Geben Sie weitere zwei Milliliter Trypsin-Inhibitorlösung zwei auf den Boden des Röhrchens, das das Pellet enthält. Zerreiben Sie es erneut und lassen Sie es fünf Minuten ruhen. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie ihn in das Röhrchen, das den Überstand aus dem vorherigen Schritt enthält.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der größte Teil des Gewebes mechanisch dissoziiert ist. Für jeden Milliliter Überstand werden 0,3 Milliliter mit Calciumchlorid ergänzte Dissektionslösung in die Überstandssammlung gegeben. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens und zentrifugieren Sie es dann fünf Minuten lang bei 644 mal G bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie anschließend den Überstand. Geben Sie 10 Milliliter Frischmedium zum Pellet und mischen Sie. Zählen Sie dann die lebenden Zellen und verdünnen Sie sie auf eine Konzentration von 1,5 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter.

Plattieren Sie die Zellen auf den zuvor vorbereiteten Poly-D-Lysin-Platten. Bei Vier-Well-Platten werden 0,5 Millimiter der Probe mit 7,5 mal 10 Zellen pro Vertiefung abgefüllt. Bei 35-Millimeter-Schalen werden vier Milliliter der Probe mit sechs mal 10 Zellen pro Platte befüllt

Für Deckgläser 0,5 Milliliter mit 7,5 mal 10 Zellen pro Vertiefung auffüllen. Geben Sie nach 24 Stunden AraC in die Platten, um die Kontamination der Gliazellen zu reduzieren. Wenn die Zellen sieben bis acht Tage lang erhalten werden sollen, wiederholen Sie diese Behandlung am dritten Tag und halten Sie die Kulturen in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Für die Kulturen, die länger als fünf Tage aufbewahrt werden, füttern Sie die Kultur ab dem fünften Tag alle zwei Tage mit Glukose. Um eine neuronale Exzitotoxizität mit NMDA zu induzieren, behandeln Sie die Kleinhirn-Körnerneuronen nach sieben Tagen in vitro eine Stunde lang mit 100 mikromolaren NMDA und 10 mikromolarem Glycin. Ersetzen Sie dann das Medium durch konditioniertes Medium aus den Parallelkulturen ohne Behandlung.

Diese Konzentration führt zu einem Zelltod von 50 % 24 Stunden nach der Behandlung. Bei ROS-induziertem Zelltod behandeln Sie die Neuronen fünf Minuten lang mit Wasserstoffperoxid bei 75 bis 100 Mikromolaren. Schalten Sie es nach fünf Minuten auf die konditionierten Medien aus Parallelkulturen um.

Aufgrund der Instabilität von Wasserstoffperoxid muss die Konzentration auf ein Niveau optimiert werden, das nach 24 Stunden einen Zelltod zwischen 50 und 70 % induziert. Diese Konzentration liegt in der Regel zwischen 75 und 100 Mikromolaren. Um den Zelltod durch DNA-Schäden zu induzieren, behandeln Sie die Kleinhirn-Körnerneuronen mit 10 mikromolaren Camptothecin, um innerhalb von 24 Stunden einen Zelltod von mehr als 50% zu induzieren.

Bei kaliumarmer induzierter neuronaler Apoptose in Kleinhirngranulaneuronen wechseln Sie das Medium mit 25 millimolarem Kalium nach sieben Tagen in vitro zu einem kaliumarmen Medium mit fünf millimolaren Kaliummitteln. Neuronen wurden mit Lentiviren für RFP bei einem MOI von drei zum Zeitpunkt der Plattierung transduziert. Fixiert und gefärbt nach sieben Tagen in vitro.

Es wird gezeigt, dass die Co-Lokalisierung des RFP-Signals MAP2 und von Hoechst gesunde Neuronen zeigt, die vollständig von Lentiviren transduziert werden. Die hier gezeigten Bilder stellen Live-Dead-Assay-Analysen von Neuronen dar, die mit verschiedenen MOI von Adenoviren infiziert sind, um die Toxizität zu messen. Kleinhirngranulaneuronen, die mit Adenoviren infiziert sind und LacZ bei einem MOI zwischen 25 und 50 exprimieren, ermöglichen maximale Effizienz bei minimaler Toxizität.

Ein Unterschied von weniger als 1 % im Zellüberleben im Vergleich zur Kontrolle wird bei einer Infektion bei diesem MOI beobachtet. Diese Abbildungen zeigen die Hoechst-Färbung von Kontroll-Kleinhirn-Körnerneuronen und Kleinhirn-Körnerneuronen, die mit NMDA behandelt wurden, um den Zelltod zu induzieren. Beachten Sie die Bildung von pyknotischen Kernen bei der NMDA-Behandlung.

Dies ist ein Hinweis auf den Zelltod und kann 24 Stunden nach der Behandlung mit 100 mikromolaren NMDA und 10 mikromolaren Glycin in etwa 50 % der Kultur beobachtet werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zweieinhalb Stunden mit sechs Maus-Pops durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, bei Bedarf aseptische Techniken und verkettete chirurgische Instrumente zu verwenden, um das Risiko einer Kulturkontamination zu minimieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um die neuronale Entwicklung und neuronale Schädigung in primären Mausneuronen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, zerebelläre granulare Neuronen zu kultivieren, sie mit Viren genetisch zu manipulieren und verschiedene Mechanismen der neuronalen Schädigung zu induzieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Immunfluoreszenz- oder Zellviabilitätsassays durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, z. B. ob ein interessierendes Gen das Überleben der Zellen als Reaktion auf Exzitotoxizität, oxidativen Stress oder DNA-Schäden verbessert.