Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gesunde, reine Populationen von Kleinhirn-Granulaneuronen zu erzeugen, diese genetisch zu verändern und verschiedene Mechanismen neuronaler Schädigungen in primären Zellkulturen in vitro zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der neuronalen Schädigung zu beantworten. Mithilfe dieses Protokolls untersuchen wir die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen von Nervenverletzungen nach akutem Hirnschaden und neurodegenerativen Erkrankungen.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass wir mithilfe des Kultursystems verschiedene Mechanismen des Zelltods wie Exzitotoxizität, oxidativen Stress, DNA-Schäden und Entwicklungsvorgänge modellieren können. Obwohl diese Methode Einblicke in neuronale Verletzungen ermöglicht, kann sie auch mit Zerebellarneuronen von Ratten verwendet werden, um neuronale Aktivität und Morphogenese als Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Begleiterscheinungen zu untersuchen. Um das Gehirn einer sechs bis sieben Tage alten Maus zu entnehmen, verwenden Sie eine Pinzette, um den Kopf zu fassen, und schneiden Sie mit Mikro-Dissektionscheren die Haut von vorne in Richtung Kopf.

Schieben Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen. Durchtrennen Sie anschließend mit der Schere Spitze den Schädel und schneiden Sie nach vorne und seitlich. Achten Sie darauf, das Kleinhirn nicht zu beschädigen, und erleichtern Sie die Identifizierung und Entfernung der Hirnhäute, indem Sie mit einer Pinzette den Schädel zurückklappen, um das Gehirn freizulegen.

Mit einer Pinzette oder Spatel das Gehirn vorsichtig in kalte Schnittlösung hineinlockern. Um das Kleinhirn zu isolieren, das Gehirn in Schnittlösung, die mit Magnesiumsulfat angereichert ist, geben und die Lösung sowie das Gehirn auf Eis lagern. Unter dem Schnittmikroskop die Hirnhäute mit feiner Pinzette entfernen und anschließend das Kleinhirn in der mit Magnesiumsulfat angereicherten Schnittlösung aus dem Gehirn herausschneiden.

Dies erleichtert das Abziehen der verbleibenden Hirnhäute und ermöglicht es, zwischen die Schichten zu gelangen, um die Kleinhirnfalten zu reinigen. Das Vorhandensein von Hirnhäuten in neuronalen Kulturen führt zu ungesunden Zellen und letztlich zum Zelltod. Daher ist es wichtig, vor der Kultivierung eine vollständige Entfernung der Hirnhäute sicherzustellen.

Danach das Kleinhirn auf seine ventrale Seite drehen und sicherstellen, dass der Plexus choroideus entfernt wird. Anschließend die Kleinhirne in eine 35-Millimeter-Schale mit einem Milliliter dissektionslösung, die mit Magnesiumsulfat angereichert ist, überführen. Das Gewebe in kleine Stücke zerschneiden und in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Milliliter Magnesiumsulfat-gepufferter Dissektionslösung überführen.

Zentrifugieren Sie in diesem Schritt das 15-Milliliter-Röhrchen mit dem zerkleinerten Hirngewebe fünf Minuten bei 644 × g und 4 °C. Danach entfernen Sie den Überstand und geben 10 Milliliter Trypsin-Dissektionslösung hinzu. Schütteln Sie anschließend den Tisch bei hoher Geschwindigkeit 15 Minuten lang bei 37 °C.

Geben Sie zwei Milliliter Trypsininhibitor-Lösung eins in das Reagenzglas und schwenken Sie vorsichtig für zwei Minuten. Anschließend zentrifugieren Sie das Reagenzglas fünf Minuten bei 644 ×g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach fünf Minuten den Überstand und geben Sie zwei Milliliter Trypsininhibitoren-Lösung zwei hinzu, bevor Sie die Probe in ein 15-Milliliter-Reagenzglas überführen.

Anschließend das Gewebe in dem 15-Milliliter-Röhrchen so lange zerkleinern, bis die Lösung trüb wird. Fünf Minuten ruhen lassen. Danach den klaren Überstand abheben und in ein neues Röhrchen überführen, das ein Milliliter kalziumchloridhaltige Pufferlösung für die Dissektion enthält.

Geben Sie weitere zwei Milliliter Trypsininhibitorlösung 2 auf den Boden des Röhrchens mit dem Pellet. Pipettieren Sie erneut auf und ab und lassen Sie die Probe fünf Minuten lang stehen. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie ihn zu dem Röhrchen mit dem Überstand aus dem vorherigen Schritt.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das meiste Gewebe mechanisch dissoziiert ist. Geben Sie für jedes Milliliter Überstand 0,3 Milliliter kalziumchloridhaltige Schnittlösung zur Überstandsammlung hinzu. Mischen Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes und zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten bei 644 × g bei Raumtemperatur.

Danach entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 10 Milliliter frisches Medium zum Pellet und mischen Sie es. Anschließend zählen Sie die lebenden Zellen und verdünnen sie auf eine Konzentration von 1,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.

Die Zellen auf zuvor vorbereitete Poly-D-Lysin-Platten ausplattieren. Für Vier-Well-Platten 0,5 Milliliter der Probe ausplattieren, was 7,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung ergibt. Für 35-Millimeter-Schalen 4 Milliliter der Probe ausplattieren, was 6 × 10⁶ Zellen pro Schale entspricht.

Für Deckgläser 0,5 Milliliter ansäen, was 7,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung ergibt. Nach 24 Stunden AraC zu den Platten hinzufügen, um eine Gliazellkontamination zu verringern. Falls die Zellen sieben bis acht Tage lang kultiviert werden sollen, diese Behandlung am dritten Tag wiederholen und die Kulturen in einem Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C weiterkultivieren.

Für Kulturen, die länger als fünf Tage gepflegt werden, die Kultur ab dem fünften Tag alle zwei Tage mit Glukose versorgen. Um eine neuronale exzitotoxische Wirkung mit NMDA zu induzieren, nach sieben Tagen in vitro die Kleinhirn-Granulumneurone eine Stunde lang mit 100 Mikromolar NMDA und 10 Mikromolar Glycin behandeln. Danach das Medium durch konditioniertes Medium aus parallelen Kulturen ohne Behandlung ersetzen.

Diese Konzentration führt 24 Stunden nach der Behandlung zu einem Zelltod von 50 %. Für die durch ROS induzierte Zelllyse behandeln Sie die Neuronen fünf Minuten lang mit Wasserstoffperoxid in einer Konzentration von 75 bis 100 Mikromolar. Wechseln Sie nach fünf Minuten auf das konditionierte Medium aus parallelen Kulturen.

Aufgrund der Instabilität von Wasserstoffperoxid muss die Konzentration auf ein Niveau optimiert werden, das nach 24 Stunden einen Zelltod zwischen 50 und 70 % induziert. Diese Konzentration liegt üblicherweise zwischen 75 und 100 Mikromolar. Um Zelltod durch DNA-Schäden zu induzieren, behandeln Sie die körnigen Kleinhirnneurone mit 10 Mikromolar Camptothecin, um innerhalb von 24 Stunden mehr als 50 % Zelltod zu erzielen.

Um eine neuronale Apoptose durch niedrigen Kaliumgehalt in Cerebellumgranulumneuronen auszulösen, wechseln Sie nach sieben Tagen in vitro das Medium, das 25 Millimolar Kalium enthält, zu einem Kalium-armen Medium mit fünf Millimolar Kalium. Die Neuronen wurden zum Zeitpunkt des Ansätzens mit Lentivirus für RFP bei einem MOI von drei transduziert. Fixierung und Färbung erfolgten nach sieben Tagen in vitro.

Die Kolokalisation des RFP-Signals mit MAP2 und Hoechst wird gezeigt, um gesunde Neuronen zu demonstrieren, die vollständig durch Lentiviren transduziert wurden. Die hier gezeigten Bilder stellen Analysen von Live-Dead-Assays von Neuronen dar, die mit unterschiedlichen MOIs von Adenovirus infiziert wurden, um die Toxizität zu messen. Cerebelläre Granulumneuronen, die mit einem Adenovirus infiziert wurden, das LacZ bei einem MOI zwischen 25 und 50 exprimiert, ermöglichen eine maximale Effizienz bei gleichzeitig minimaler Toxizität.

Bei der Infektion mit diesem MOI wird weniger als ein 1%-Unterschied in der Zellüberlebensrate im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Diese Abbildungen zeigen die Hoechst-Färbung von Kontroll-Zellen der körnigen Zellen des Kleinhirns und von körnigen Zellen des Kleinhirns, die mit NMDA behandelt wurden, um den Zelltod auszulösen. Beachten Sie die Bildung pyknotischer Kerne nach Behandlung mit NMDA.

Dies ist ein Hinweis auf Zelltod und kann etwa 24 Stunden nach der Behandlung mit 100 Mikromolar NMDA und 10 Mikromolar Glycin in ungefähr 50 % der Kultur beobachtet werden. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zweieinhalb Stunden mit sechs Mausgehirnen durchgeführt werden. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig, aseptische Techniken und, falls erforderlich, verkettete chirurgische Instrumente zu verwenden, um das Risiko einer Kulturkontamination zu minimieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die neuronale Entwicklung und neuronale Verletzungen in primären Mausneuronen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, zerebelläre Granulumneuronen zu kultivieren, sie genetisch mittels Viren zu verändern und unterschiedliche Mechanismen neuronaler Schädigung auszulösen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunfluoreszenz oder Zellviabilitätsassays durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise ob ein Gen des Interesses die Zellüberlebensfähigkeit als Reaktion auf Exzitotoxizität, oxidativen Stress oder DNS-Schäden verbessert.