Bioreaktor-Assemblierung für die kontinuierliche Kultivierung komplexer Stuhlgemeinschaften

Dieses Protokoll beschreibt den Zusammenbau von Mini-Bioreaktor-Arrays, die für die kontinuierliche Durchflusskultur komplexer Stuhlgemeinschaften unter anaeroben Bedingungen verwendet werden sollen. Wir besprechen auch die Methoden für den Zusammenbau, die Inokulation und die Probenahme der Reaktoren für die weitere Analyse.

Wir untersuchen die Interaktionen zwischen Wirtsbakterien und wie intrinsische und extrinsische Faktoren die Gesundheit beeinflussen, wobei wir uns auf bakterielle Effekte auf die Entstehung, das Fortschreiten und das Ansprechen auf die Behandlung von Krebs konzentrieren. Wir untersuchten Anti-PD-1-Immun-Checkpoint-Inhibitoren in Bakteriengemeinschaften und stellten fest, dass bakterielle Metaboliten die Wirksamkeit der Anti-PD-1-Therapie verbessern.

Die Isolierung des Einflusses von Wirtsfaktoren auf das Mikrobiom in vivo ist aufgrund mehrerer Einflüsse eine Herausforderung. Das Mikrobioreaktor-Array ermöglicht die kontrollierte Untersuchung spezifischer Prozesse und klärt deren direkte Auswirkungen auf mikrobielle Gemeinschaften. Dieses Protokoll bietet eine kostengünstige Methode, um Stuhlgemeinschaften unter kontrollierten Bedingungen zu kultivieren und ermöglicht es den Forschern, Experimente relativ schnell parallel durchzuführen.

[Dozent] Besorgen Sie sich zunächst ein 3D-gedrucktes Sechs-Well-Reaktorarray. Schneiden Sie zwölf 25-Millimeter-Streifen aus 1/8 Zoll PTFE-Schlauch ab und rasieren Sie die Enden mit einem Rasiermesser. Führen Sie ein Ende jedes Streifens in die Schraubgewindeöffnung eines Luer-Außengewindes mit einer Verschraubung mit 25 bis 28 Gewinden ein. Schrauben Sie die Fittings sicher in die dafür vorgesehenen Abfall- und Probenöffnungen des Arrays. Setzen Sie nun in jede Reaktorvertiefung einen Mikrorührstab ein. Schrauben Sie ein Außengewinde 1/4-28 in die Quelllöcher jeder Reaktorvertiefung. Schrauben Sie die weiblichen Luer-Schlauchstangen-Adapteranschlüsse in die Gewindeanschlüsse für die Abfall- und Quellanschlüsse jeder Reaktorvertiefung. Schrauben Sie dann weibliche Luer X an 3-32/2-Zoll-Schlauchtüllen in die 1/4-28-Gewindeanschlüsse für die Probenanschlüsse. Legen Sie ein Gummiseptum über die Schlauchtüllenadapter und klappen Sie die Oberseite um. Schneiden Sie als Nächstes zwei Sätze E-LFL 2,06 Millimeter Schläuche für die Abfall- und Quellleitungen ab. Verwenden Sie heißes Wasser, um den Schlauch weicher zu machen und die Befestigung zu erleichtern. Befestigen Sie den Schlauch an den weiblichen Luer X auf 1/8 Zoll Schlauchtülle Adapter für die Quell- und Abfallanschlüsse. Befestigen Sie nun einen männlichen Luer mit einem Sicherungsring X an einem 1/8-Zoll-Schlauchtüllenadapter, der am anderen Ende des Schlauchs angebracht ist. Schrauben Sie eine weibliche Luer X auf 1/16 Zoll Schlauchtülle ein. Verbinden Sie den Zwei-Stopp-Schlauch der entsprechenden Größe mit den entsprechenden Quellen- und Abfallanschlüssen. Befestigen Sie dann einen weiteren weiblichen Luer X an einem 1/16-Zoll-Schlauchtülle, der am anderen Ende des Schlauchs angebracht ist. Nachdem Sie dies für alle Quell- und Abfallarmaturen wiederholt haben, setzen Sie einen männlichen Luer mit Sicherungsring X auf 1/8 Zoll Schlauchtülle Adapter an ein Stück E-LFL 2-Schlauch an. Befestigen Sie ein Ende an der freien Luer-X-auf-1/16-Zoll-Schlauchtülle an der Buchse am Ende jedes Zwei-Stopp-Schlauchabschnitts für alle Teile. Nachdem Sie dies für alle Quellen- und Abfallarmaturen wiederholt haben, verbinden Sie den E-LFL 2,06-Millimeter-Schlauch für die Quellleitungen der Reaktorvertiefungen eins und zwei mit den gegenüberliegenden Enden eines weiblichen Luer T. Befestigen Sie dann ein fünf Zentimeter langes Schlauchstück mit männlichem Luer mit Sicherungsring X an 1/8-Zoll-Adapteranschlüssen an jedem Ende am mittleren Auslass des T, was zu einer zweiten T-Verbindung führt. Verbinden Sie nun den E-LFL 2,06 Millimeter Quellschlauch für den dritten Reaktor mit der gegenüberliegenden Seite des zweiten T. Befestigen Sie ein weiteres fünf Zentimeter langes Schlauchsegment mit einem männlichen Luer mit Sicherungsring X auf 1/8 Zoll Adapter an einem Ende und einem weiblichen Luer mit Sicherungsring X auf 1/8 Zoll Adapter am anderen Ende. Befestigen Sie als Nächstes einen männlichen Luer mit Sicherungsring X an einem 1/8-Zoll-Schlauchtüllenadapter, der an einem Ende eines 25 Zentimeter langen E-LFL-Schlauchs mit einem Durchmesser von 2,06 Millimetern befestigt ist. Befestigen Sie eine Luer-X-Buchse an einem 1/8-Zoll-Schlauchtülle, der am anderen Ende angebracht ist, und verschließen Sie ihn mit Aluminiumfolie. Um die Abfallsammelflasche zusammenzubauen, befestigen Sie einen Zwei-Loch-Verschluss locker auf einer Zwei-Liter-Flasche. Setzen Sie die Außengewindeanschlüsse mit 1/4-28 Gewinde in beide Löcher der Kappe ein. Befestigen Sie dann eine Luer-Buchse mit 1/8-Zoll-Schlauchtülle an der Außengewindeverschraubung, die nicht mit dem vormontierten PTFE-Schlauch in der Kappe verbunden ist. Verbinden Sie ein fünf Zentimeter langes Stück E-LFL 2,06 Millimeter Schlauch mit dem Schlauchtüllenadapter an der Flasche. Befestigen Sie einen männlichen Luer mit Sicherungsring X an einem 1/8-Zoll-Schlauchtüllenadapter am anderen Ende des Schlauchs, bevor Sie ihn mit Folie abdecken. Decken Sie zum Schluss den gesamten Flaschenverschluss mit Alufolie ab, bevor Sie ihn 45 Minuten lang bei 121 Grad Celsius und 15 psi autoklavieren. Sobald das Autoklavieren abgeschlossen ist, ziehen Sie die Fittings und Foliendichtungen fest und stellen Sie die Reaktoren vor der Verwendung 48 Stunden lang in eine anaerobe Kammer. Richten Sie das Reaktorarray in der anaeroben Kammer über einer magnetischen Rührplatte aus, die auf 1.600 U/min eingestellt ist. Setzen Sie dann die Zwei-Stopp-Schläuche sowohl für die Quell- als auch für die Abwasserleitung in die Klemmen der entsprechenden Schlauchpumpen ein. Verriegeln Sie die Klemmen, wenn dies weniger als 25 Stunden vor dem Gebrauch erfolgt. Andernfalls lassen Sie es locker, um den Verschleiß der Schläuche zu reduzieren. Entfernen Sie nun die Folienkappe von der Quellflasche. Schrauben Sie die Verschraubungen in den Luer-Außengewinde auf 1/4-28 Gewindeverschraubungen und stellen Sie sicher, dass diese Öffnungen mit dem internen PTFE-Schlauch verbunden sind. Entfernen Sie die Folienkappen und befestigen Sie einen 0,22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter an der fünf Zentimeter langen Entlüftungsöffnung sowohl der Quellflasche als auch der Abfallflasche. Beginnen Sie den Durchfluss mit einer moderaten Geschwindigkeit, um mit dem Befüllen des Reaktors zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass die Gürtelschläuche in jeder Reaktorvertiefung tiefer als die Quellrohre positioniert sind, um eine Überfüllung oder die vollständige Entleerung jeder Vertiefung zu verhindern. Wenn sich die Reaktoren zu füllen beginnen, überprüfen Sie, ob alle Bohrlöcher das gleiche Volumen erreichen und dass das Medium in die Hüfte fließt, bevor Sie die Reaktoren über Nacht entgasen lassen. Beginnen Sie damit, die experimentellen Materialien für 24 Stunden in die anaerobe Kammer zu bringen. Nachdem Sie die benötigte Menge an Stuhlinokulum berechnet haben, übertragen Sie die konservierten Stuhlproben in kryogenen Fläschchen in die anaerobe Kammer und lassen Sie sie 15 Minuten lang auftauen. Übertragen Sie das Fäkalien mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung aus Kryofläschchen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Das verschlossene Röhrchen wird fünf Minuten lang bei 200 g zentrifugiert, um die Partikel abzusetzen. Übertragen Sie die Schläuche zurück in die anaerobe Kammer. Entfernen Sie dann den Überstand. Verwenden Sie einen Laborspatel im Autoklaven, um die 5,7 Gramm der Stuhlfeststoffe in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Geben Sie 17,1 Milliliter anaerobe sterile Kochsalzlösung in das Röhrchen und verschließen Sie es fest. Drehen Sie nun das Röhrchen fünf Minuten lang, bevor Sie es zentrifugieren, wie bereits gezeigt. Verwenden Sie ein Labortuch mit 10 % Bleichmittel, um die Septen auf jedem Reaktor mindestens zwei Minuten lang zu sterilisieren. Nachdem Sie die Proben wieder in die anaerobe Kammer zurückgeführt haben, pipettieren Sie den Überstand in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen aus. Übertragen Sie nun 3,8 Milliliter Fäkalschlammüberstand in sechs separate Fünf-Milliliter-Spritzen, die mit 16-Gauge-1,5-Zoll-Nadeln ausgestattet sind. Entfernen Sie das Bleichtuch von den Reaktorsepten. Führen Sie dann die Nadel durch das Septum und injizieren Sie langsam 3,8 Milliliter Fäkalschlamm in jeden Reaktor, bevor Sie die Reaktoren über Nacht stehen lassen. Nach einer 16- bis 18-stündigen Inkubation wird der Fluss zum Reaktor gestartet. Stellen Sie die magnetische Rührplatte sofort nach dem Einspritzen der Fäkaliengülle auf maximale Drehzahl. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in beiden Replikatreaktoren veränderte sich im Laufe der Zeit, wobei verschiedene Spezies über Tage hinweg eine unterschiedliche relative Häufigkeit zeigten. Anspruchsvolle anaerobe Bakterien, wie z. B. Clostridium-Gattungen, wurden in jedem Reaktor zu jedem Zeitpunkt konsistent nachgewiesen.