Aktualisiertes Protokoll für den Aufbau und die Verwendung des Minibioreaktor-Arrays (MBRA)

Unsere Forschung konzentriert sich daher auf das Darmmikrobiom, insbesondere darauf, wie es so manipuliert werden kann, dass es die Besiedlung durch schädliche Krankheitserreger verhindert. Gleichzeitig sind wir auch daran interessiert, die ökologischen Regeln und Mechanismen hinter diesem Kolonisationswiderstand zu verstehen. Technologien wie Next Generation Sequencing, fortschrittliche Bioinformatik, keimfreie Mäuse und In-vitro-Darmmodelle verändern die Art und Weise, wie wir mikrobielle Gemeinschaften und ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit untersuchen.

Eine der größten Herausforderungen bei In-vitro-Darmmodellen besteht darin, sie mit hohem Durchsatz zu betreiben. Was wir brauchen, sind Systeme, die die funktionelle Abfrage mikrobieller Gemeinschaften in großem Maßstab ermöglichen. Das Minibioreaktor-Array ist ein kontinuierliches Durchflusskultursystem, das entwickelt wurde, um den Mangel an Durchsatzkapazität in anderen Systemen zu beheben.

Es ermöglicht uns, Experimente zu skalieren und gleichzeitig komplexes und reproduzierbares Verhalten der mikrobiellen Gemeinschaft zu erfassen. Stellen Sie zunächst sicher, dass die Minibioreaktor-Array-Streifen 3D-gedruckt sind und sechs unabhängige Bioreaktorkammern enthalten. Ordnen Sie alle für die Montage benötigten Komponenten an.

Verwendung eines 1/4-Zoll-Fraktionsgewindebohrers 28 NF mit einem T-Griff-Windeisenschlüssel. Fädeln Sie die drei 1/4-Zoll-Anschlüsse in jede Kammer ein, um die Anschlüsse einzusetzen. Nachdem Sie die Kammer mit Wasser gewaschen haben, legen Sie einen 10 x 3 Millimeter großen Magnetrührstab in jede Kammer und fügen Sie einen Milliliter destilliertes Wasser hinzu.

Positionieren Sie dann eine Gummischeibe auf jedem Anschluss des Bioreaktors. Schrauben Sie für jede Kammer einen männlichen Köder mit Medienstrohhalm, einen männlichen Köder mit Gewinde und einen männlichen Köder mit leerem Gewinde in die Öffnungen. Stecken Sie nun sechs Gummisepten auf die 3/32-Zoll-Widerhaken des weiblichen Köders und klappen Sie die obere Hülse jedes Septums nach unten, um den Hals zu bedecken.

Befestigen Sie diese an den dafür vorgesehenen Anschlüssen jeder Kammer. Schneiden Sie C-Flex-Schlauchstreifen in der gewünschten Länge und Anzahl zu. Befestigen Sie an einem Ende einen 1/8-Zoll-weiblichen Köderwiderhaken und am gegenüberliegenden Ende jedes Schlauchs einen männlichen Köderschloss-Anschluss.

Führen Sie dann einen 1/16-Zoll-Köderwiderhaken in jedes Ende des roten E-Lab-Schlauchs mit zwei Stopps mit einem Innendurchmesser von 1,14 Millimetern und des orangefarbenen E-Lab-Schlauchs mit zwei Stopps mit einem Innendurchmesser von 0,89 Millimetern ein. Verbinden Sie den vorbereiteten E-Lab-Schlauch mit dem C-Flex-Schlauch und stellen Sie sicher, dass jede der sechs C-Flex-Schlauchlängen über weibliche Köder mit einer roten und einer orangefarbenen E-Lab-Leitung verbunden ist. Schneiden Sie anschließend den C-Flex-Schlauch je nach Bedarf auf unterschiedliche Längen zu.

Befestigen Sie einen 1/8-Zoll-weiblichen Köderwiderhaken und einen männlichen Köderschloss-Anschluss an beiden Enden eines 3-Zoll-Stücks und des 12-Zoll-Stücks C-Flex-Schlauch. Befestigen Sie die männlichen Köderschloss-Konnektoren an beiden Enden der restlichen Teile. Bauen Sie den Abfalllinienbaum gemäß dem 3D-Diagramm zusammen.

Befestigen Sie die freiliegenden Enden des roten E-Lab-Schlauchs mit zwei Stopps an den terminalen männlichen Köderschlössern am Abfallleitungsbaum in aufsteigender Reihenfolge, basierend auf der Länge des C-Flex-Schlauchs. Verbinden Sie dann den 3-Zoll-C-Flex-Schlauch mit dem 1/8-Zoll-weiblichen Köderwiderhaken und dem männlichen Köderschloss-Anschluss mit der Spitze des Abfallleinenbaums. Bauen Sie den Zuleitungsbaum gemäß dem 3D-Diagramm zusammen.

Überbrücken Sie die freiliegenden Enden des orangefarbenen E-Lab-Schlauchs mit zwei Stopps in aufsteigender Reihenfolge basierend auf der Länge des C-Flex-Schlauchs mit den terminalen männlichen Köderschlössern am Feed-Schnurbaum und befestigen Sie den 12-Zoll-C-Flex-Schlauch am oberen Ende des Feed-Schnurbaums. Befestigen Sie die C-Flex-Schläuche mit variabler Länge am Ende des Zuleitungsbaums am Bioreaktor und ordnen Sie sie in aufsteigender Reihenfolge von der kürzesten Leitung links bis zur längsten rechts an. Befestigen Sie den C-Flex-Schlauch mit variabler Länge am Ende des Abfallleitungsbaums in absteigender Reihenfolge mit der längsten Leitung links und der kürzesten rechts am Bioreaktorstreifen, um die Platzierung der Pumpe zu ermöglichen.

Bündeln Sie alle C-flex Zuleitungen auf der linken Seite des Bandes und sichern Sie sie mit einem Drehbinder. Bilden Sie mit dem orangefarbenen E-Lab-Schlauch mit zwei Stopps eine Schlaufe zwischen den C-Flex-Leitungen, befestigen Sie die Schlaufe mit Autoklavenband und wiederholen Sie den Vorgang für den roten E-Lab-Schlauch mit zwei Stopps auf der Abfallseite des Bioreaktorstreifens. Decken Sie den weiblichen Köder am Ende des Abfalls ab und füttern Sie die Bäume mit Folie, um eine Kontamination zu vermeiden.

Lösen Sie die Köder mit Außengewinde und Septen an jeder Bioreaktorkammer, damit der Dampf während des Autoklavierens entweichen kann. Nachdem Sie die Baugruppe in einen Autoklavbehälter gelegt haben, strecken Sie die Zuführ- und Abfallleitungsbäume in separate Behälter aus, die an den Behälter mit den MBRA-Streifen angrenzen. Um das System an den Pumpen zu befestigen, entfernen Sie das Autoklavenband, mit dem die E-Lab-Schläuche sowohl für die Abfall- als auch für die Zuleitungen befestigt sind, und lösen Sie die Bündel der C-Flex-Schläuche.

Positionieren Sie den MBRA zwischen den beiden Pumpen auf der Rührplatte. Klemmen Sie es mit den 3D-gedruckten Halterungen fest und richten Sie es an den markierten Rührpositionen auf der Platte aus. Befestigen Sie nun den E-Lab-Schlauch der Zuleitung an den Kartuschen der Peristaltikpumpe und positionieren Sie die Schlauchanschläge in den Kartuschenschlitzen.

Wiederholen Sie den Vorgang für die E-Lab-Schläuche der Abfallleitung an der Pumpe, die sich rechts von der Rührplatte befindet. Verriegeln Sie dann die Patronen der Schlauchpumpe in der Pumpe. Ordnen Sie die C-Flex-Schläuche mit den 3D-gedruckten Schlauchhaltern ordentlich an.

Verbinden Sie das Ende des Abfallleitungsbaums mit dem Schlauch, der mit den Abfallbehältern verbunden ist. Befestigen Sie als Nächstes den weiblichen Köder am Einführungsschlauch der Zuleitung an den männlichen Anschluss des 12-Zoll-Schlauchs vom Medienflaschenverschluss. Schalten Sie beide Pumpen ein, um den Medienfluss zu starten, und stellen Sie sicher, dass beide Pumpen auf Rechtsdrehung eingestellt sind, wenn sich der Abfall rechts von den Pumpen befindet.

Beobachten Sie die Tröpfchengröße und -kadenz in jeder Bioreaktorkammer. Wenn eine Variabilität oder Anomalie festgestellt wird, ersetzen Sie den orangefarbenen E-Lab-Schlauch mit zwei Stopps, der mit der betroffenen Kammer verbunden ist, um die Variation der Durchflussrate zu reduzieren. Sobald die Kammern voll sind, schalten Sie beide Pumpen ab und lassen Sie die Bioreaktoren 24 bis 48 Stunden lang stehen, um sie auf Kontamination zu überprüfen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.

Schalten Sie den Medieneingang auf einen Ein-Liter-Behälter mit 10 % Bleiche in entionisiertem Wasser um und erhöhen Sie die Durchflussmenge an beiden Pumpen auf maximal, um den Inhalt der Bioreaktorkammern mit Bleiche zu verdrängen. Sobald die Kammern frei von Medien sind, drehen Sie den MBRA um, um ihn fünf Minuten lang oberhalb der Fülllinie zu desinfizieren. Richten Sie das System nach fünf Minuten wieder ein und warten Sie weitere fünf Minuten auf die Sterilisation.

Nachdem die Kammern von Medien befreit und 10 Minuten lang sterilisiert wurden, ersetzen Sie das Bleichmittel durch einen Liter entionisiertes Wasser und spülen Sie das System, bis das Wasser durchgelaufen ist. Trennen Sie dann die E-Lab-Schläuche des Bioreaktors von den Pumpen und entfernen Sie die MBRAs. Entfernen Sie die gebrauchten Septen aus dem Bioreaktor und entleeren Sie jede Kammer, bis nur noch ein Milliliter Wasser übrig ist.

Ersetzen Sie die Septen, den orangefarbenen E-Lab-Schlauch mit zwei Stopps, und autoklavieren Sie den vollständig montierten Streifen, wie zuvor gezeigt. Führen Sie nach drei Zyklen der Wiederverwendung die folgenden Schritte aus. Eine menschliche Stuhlprobe wurde vorbereitet und im MBRA-System gezüchtet.

Nach vier Tagen kontinuierlichen Flusses wurde die mikrobielle Gemeinschaft in allen neun Bioreaktoren von 18 Bakteriengattungen dominiert, von denen jede mindestens 2 % der relativen Häufigkeit in einem Replikat ausmachte. 22 der 65 nachgewiesenen Gattungen waren in allen neun Bioreaktorreplikaten vorhanden, was eine hohe Reproduzierbarkeit zeigt. Die Alpha-Diversitätsanalyse zeigte eine minimale Variation zwischen den Replikaten sowohl in den beobachteten operationellen taxonomischen Einheiten als auch im Shannon-Diversitätsindex.