Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

Unsere Arbeit kartiert dysfunktionale Protein-Protein-Interaktionen direkt aus nativen Zellen und Geweben und zeigt auf, wie Krankheiten zelluläre Netzwerke neu verdrahten. Im Gegensatz zu den meisten interatomaren Methoden erfordert dfPPI keine genetische Manipulation und keine Fähigkeiten für Patientenkohorten, wobei pro Probe eine Multiplexaufnahme verwendet wird. Zu Beginn bereiten Sie einen Proteinextraktionspuffer vor, der 20 millimolare Tris, 20 millimolare Kaliumchlorid, 5 millimolare Magnesiumchlorid und 0,01 % Nb-40 enthält.

Fügen Sie Protease- und Phosphataseinhibitoren unmittelbar vor der Anwendung hinzu und lassen Sie den Puffer auf Eis. Legen Sie die gefrorene Gewebeprobe in ein Mikrogewebe-Homogenisierungsrohr, das mit einem Stößel versehen ist. Füge 500–700 Mikroliter des nativen Lysis-Puffers hinzu und passe das Volumen entsprechend der Gewebekompaktheit und der Homogenisierung an.

Anschließend homogenisiert man die Probe auf Eis, indem der Stößel sanft auf und ab und gegen die Schleifwände bewegt wird, bis eine gleichmäßige Suspension erreicht ist. Inkubieren Sie die Lysate bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten, indem Sie das Fläschchen auf eine Rotationseinheit stellen. Mischen Sie die Proben während der Inkubation vorsichtig durch die Rotation.

Mit einer Werkstischzentrifuge wird die Proben bei 13.000 G für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Sammeln Sie die Supernatanten sorgfältig ein und geben Sie sie in durchsichtige 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren um. Bestimmen Sie die gesamte Proteinkonzentration im Supernatant mit dem BCA-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Als Nächstes nehmen Sie ein Aliquot Polyurethanperlen direkt aus dem Isopropanol-Schaft. Lassen Sie die Perlen absinken, um das Aufbewahrungslösungsmittel zu entfernen. Saugen Sie das Isopropanol vorsichtig ab, fügen Sie dann einen Native-Lysis-Puffer hinzu und suspendieren Sie die Perlen vollständig durch sanftes Pipettern oder Inversion.

Um die Perlen zu waschen und auszugleichen, wirbeln Sie das Rohr vortex und zentrifugieren Sie es. Danach aspirieren Sie das Überdachungsmittel mit einer Vakuumleitung, die mit einer Pipettenspitze versehen ist, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Fügen Sie den gewaschenen Perlen in gleichmäßigem Verhältnis einen Bindungspuffer hinzu, um eine gleichmäßige Arbeitsperlenschlamm zu erzeugen.

Aliquot 40 Mikroliter Polyurethanperlenschlamm in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren mit einer geschnittenen Pipettenspitze für eine glatte Dosierung. Wasche dann die Perlen dreimal mit einem nativen Lysepuffer, indem du jedem Rohr 1 Milliliter Puffer hinzufügst. Wirbeln Sie das Rohr vor, um die Perlen wieder aufzuhängen, zentrifugieren Sie dann bei 10.000 G für 1 Minute und entsorgen Sie den Überstandsstoff durch Aspiration.

Nach der letzten Wäsche entferne du den Großteil der verbleibenden Flüssigkeit aus den Rohren, damit die Perlenkugel unberührt bleibt. Fügen Sie die normalisierten Proteinextrakte zu einzelnen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren mit 40 Mikrolitern Kontrollperlenschlamm hinzu. Stellen Sie das Endvolumen auf 250 Mikroliter ein, indem Sie die entsprechende Menge natives Lysis-Puffers hinzufügen.

Inkubieren Sie die Proben bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten und drehen Sie sie auf einem Runddrehmotor mit 10–15 Umdrehungen pro Minute. Zentrifugieren Sie die Röhren bei 10.000 G für 1 Minute bei 4 Grad Celsius, um die Kontrollperlen zusammen mit aggregierten oder unlöslichen Proteinen zu pelletieren. Sammeln Sie das Supernatant vorsichtig mit einer 1-Milliliter-Pipette aus den Kontrollperlen und übertragen Sie es in frische 1,5-Milliliter-Röhren mit 40 Mikrolitern gewaschener Polyurethanperlenschlamm.

Inkubieren Sie die Proben bei 4 Grad Celsius für 3 Stunden mit Rotation auf einem Rund-über-End-Rotator. Nach vorsichtiger Zentrifugierung der Röhren wird das Übersetzungsmittel eingesaugt und die Perlen viermal gewaschen, wie zuvor gezeigt. Entfernen Sie alle Reste von PBS aus dem Tube.

Die gewaschenen Perlen werden in 80 Mikrolitern frisch in 50 millimolaren Ammoniumbicarbonat bei pH-Wert 8,5 durch Pipetten oder kurzes Vortexen wieder aufgehängt. Anschließend wird Dithiothreitol hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1 Millimolar zu erreichen. Nach dem Abdecken des Rohrs inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie mit 1.100 Umdrehungen pro Minute auf einem erhitzten Orbitalshaker.

Fügen Sie Iodoacetamid hinzu, um eine Endkonzentration von 3,67 Millimolar zu erreichen. Inkubieren Sie die Röhren im Dunkeln bei Raumtemperatur 45 Minuten lang und schütteln Sie sie mit 1.100 Umdrehungen pro Minute. Fügen Sie nun zusätzliches Dithiothreitol hinzu, um unreagierte Jodoacetamid zu löschen, um eine Endkonzentration von 3,67 Millimolaren sicherzustellen, und mischen Sie vorsichtig durch Pipetten.

Fügen Sie der Probe 750 Nanogramm 0,5 Milligramm pro Milliliter Massenspektrometrie-Lys-C-Protease hinzu. Die Mischung 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und mit 1.150 Umdrehungen pro Minute schütteln. Als Nächstes fügen Sie der Probe 750 Nanogramm frisch zubereiteter 0,5 Milligramm pro Milliliter Sequenzierungs-Tripsin hinzu.

Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 37 Grad Celsius mit einem Schütteln von 1.150 Umdrehungen pro Minute. Am folgenden Tag wird die Probe bei 1.000–5.000 G für 1–5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Übertragen Sie vorsichtig den Überstandsstoff mit einer Pipette in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und entsorgen Sie die Perlen.

Stellen Sie den pH-Wert der Verdauung auf unter 3 ein, indem Sie 50 % Trifluoressigsäure tropfweise hinzufügen. Überprüfen Sie den pH-Wert mit Indikatorstreifen. PU-Perlen erfassten HSP90, HSC70 und heiße Proteine stark aus dem Epichaperom-Hochlysat mit minimalem Signal vom Epichaperom-Niedriglysat, was die biologische Spezifität der Sonde bestätigte.

Das Frachtprofil der PU-Perle zeigte ein reichhaltiges, hochmolekulares Signal in der PU-Perlen-Spur und minimalen Hintergrund in der Kontroll-Perlenbahn, was die erfolgreiche Sondenaktivität bestätigte. Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gele zeigten eine konsistente Bandverteilung über vier im Gel verarbeitete Proben und bestätigten damit eine erfolgreiche Anreicherung von Proteinkomplexen aus nativen Lysaten vor der Massenspektrometrie. Die technische Reproduzierbarkeit wurde durch die Analyse der Hauptkomponenten bestätigt, bei der Replikationsproben eng gruppiert wurden, während verschiedene Proben sauber getrennt wurden.

Vorläuferionenintensitätsverteilungen zeigten, dass die meisten Merkmale Variationskoeffizienten unter 20 % aufwiesen, mit Medianwerten zwischen 9,7 % und 11,9 % über die Proben hinweg, was eine konsistente Peptiddetektion und -wiederherstellung bestätigte. Die hierarchische Clusterung log-transformierter Proteinhäufigkeiten zeigte eine starke Probentrennung und erhaltene Variation zwischen den Proben mit Proteinintensitäten, die von niedriger bis zu hoch angereicherten Proteinen reichten. Die Analyse der Pfadanreicherung zeigte eine breite Annotationsabdeckung über mehrere Ontologien hinweg, einschließlich Genontologiekategorien und kuratierter Datenbanken wie Reactome, KEGG und WikiPathways.

dfPPI ermöglichte es uns, mechanistische und therapeutische Erkenntnisse zu gewinnen, die andere Ansätze einfach nicht erreichen können. dfPPI bringt die Interomik auf die Ebene realer Krankheitskohorten und der natürlichen Bedingungen und ermöglicht so präzise mechanistische und therapeutische Hypothesen. Wir erweitern nun das dfPPI, um Netzwerkniveau-Veränderungen bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson zu kartieren.