Das Stroke Preclinical Assessment Network Multi-Labormodell des thromboembolischen Schlaganfalls mit Thrombolyse: TE-MCAo

Der Umfang unserer Forschung ist die Entwicklung eines thromboembolischen Schlaganfallmodells mit kontrollierter Thrombolyse für den Einsatz in rigorosen, multilaboratorischen präklinischen Therapietests. Unser Protokoll berücksichtigt das Fehlen eines einfachen, reproduzierbaren thromboembolischen Schlaganfallmodells, das klinische Thrombolyse nachahmen und multizentrische präklinische Studien unterstützt. Um zu beginnen, ein PE-50-Rohr stumpf zu machen, indem man das Ende in einem abgeschrägten Winkel abschneidet.

Schneiden Sie die Spitze der Fasenspitze mit einer Mikroschere ab. Nach der Vorbereitung der betäubten Ratte auf die Operation wird ein vertikaler Schnitt an der Innenseite des Oberschenkels von etwa 1,5 bis zwei Zentimetern Länge entlang der natürlichen Falte des Leistenschnitts mit dem Bein gemacht. Der Schnitt sollte orthogonal zum erwarteten anatomischen Verlauf der Oberschenkelarterie liegen.

Mit stumpfer Dissektion seziert man vorsichtig bis zu den Oberschenkelgefäßen. Dann trennen Sie die Oberschenkelarterie von der Vene und dem Nerv, die im selben Bündel verlaufen. Skelettisieren Sie die Femoralarterie so weit wie möglich proximal und verfolgen Sie die Arterie zu ihrem retroperitonealen Ursprung.

Führe locker eine 5-0-Seidenschlaufe um die Oberschenkelarterie und benutze die Schwänze, um sanfte Spannung am proximalen Ende der Arterie zu erzeugen. Anschließend wird die Oberschenkelarterie distal mit einer 5-0-Seidenligatur verschlossen und mit den Enden der Naht distal mit hämostatischen Klemmen leichte Spannung erzeugt. Etwa zwei Drittel der Entfernung von der proximalen Nahtschleife legt man ein Stück Seidennaht unter die Arterie und führt mit einer Mikroschere eine kleine Arteriotomie distal zur losen Naht durch.

Mit scharfer Pinzette hebt man die obere Öffnung der Arteriotomie an und führt den stumpfen, abgeschrägten PE-50-Katheter in die Öffnung ein. Schieben Sie den Katheter so weit wie möglich proximal vor, sodass die lose Schleife beim Anziehen den Katheter umschließt. Ziehen Sie die Naht vorsichtig fest, damit sie den Katheter nicht verstopft und nicht auf dem Fasen sitzt.

Löse die gummibeschuhte Klemme. Der Katheter sollte sich sofort mit Blut füllen. Füllen Sie drei 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.

Sobald die Eileiter gefüllt sind, entfern Sie den PE-50-Katheter aus der Oberschenkelarterie, ligatizieren Sie das proximale Ende und schließen Sie den Schnitt mit unterbrochenen 5-0-Prolenen-Nähten. Um den Thrombus vorzubereiten, werden 500 Mikroliter frisch entnommenes oder gelagertes Spenderblut in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen und ein Milliliter Calciumchlorid zur Antikoagulationsumkehrung hinzugefügt. Dann wird das Blut sofort aus dem Mikrozentrifugenrohr in einen 100 Zentimeter langen PE-50-Schlauch mit sanfter Absaugung eingesaugt und der aufgewickelte Schlauch in vorgewärmtem PBS bei 37 Grad Celsius zwei Stunden lang in einem Tischofen inkubiert.

Nachdem Sie den Thrombus in eine Petrischale mit PBS ausgestoßen haben, schneiden Sie ihn mit einer Rasierklinge in Abschnitte von etwa sechs Zentimetern. Ziehen Sie jeden Thrombus vorsichtig in einen PE-50-Katheter und geben Sie ihn fünfmal vollständig aus, um ihn zu waschen. Waschen Sie den Thrombus erneut, indem Sie ihn vorsichtig in einen PE-10-Katheter ziehen und 15 Mal vollständig ausstoßen.

Füge 200 Mikroliter 4%Evans Blue in eine Petrischale mit 10 Millilitern PBS hinzu, um Verdünnung Nummer 1 zu erzeugen. Dann pipettieren Sie 400 Mikroliter Verdünnung Nummer 1 in eine separate Petrischale mit 20 Millilitern PBS, um Verdünnung Nummer 2 zu erzeugen. Geben Sie das Gerinnsel für eine Sekunde in die konzentriertere Evans blaue Petrischallösung und geben Sie es dann in die verdünnte Evans blaue Petrischale.

Laden Sie einen gewaschenen Thrombus in vorgefertigte Mikrokatheter ohne Luftembolien mit der Nass-zu-Nass-Methode. Sobald der Thrombus vollständig geladen ist, extrudieren Sie genügend Thrombus, sodass genau fünf Zentimeter im Mikrokatheter verbleiben. Schneiden Sie den Überschuss mit einer Rasierklinge ab.

Markieren Sie den Mikrokatheter 16 Millimeter von der Spitze entfernt, um den Umfang des Katheters zu markieren, der intraluminal vorgeschoben werden soll. Die vorgeladenen Thromboemboli wurden in die innere Halsschlagader von 135 Probanden in sechs Forschungslaboren injiziert, um die Machbarkeit des thromboembolischen Okklusionsmodells der mittleren Gehirnarterie zu testen. Die Magnetresonanztomographie wurde nach drei Tagen bei 102 Tieren durchgeführt, was auf eine Scan-Abschlussrate von 75 % hindeutet.

Der Tierverlust vor der Bildgebung war in allen sechs Laboren konstant. Das mittlere Läsionsvolumen an allen Standorten betrug 13 % der ipsilateralen Hemisphäre, mit einigen Variationen zwischen den sechs Laboren. Unser Protokoll ahmt menschliche Thrombus und Thrombolyse nach, reduziert den Einsatz bei Tieren, standardisiert Operationen und erreicht eine zuverlässige multizentrische Reproduzierbarkeit.

Als bedeutendes Ergebnis unserer Forschung haben wir ein skalierbares, reproduzierbares TE-MCAo-Modell entwickelt, das in mehreren Laboren mit konsistenten Ergebnissen und strukturierter Qualitätskontrolle nutzbar ist. Dieses Modell kann sowohl in Einzel- als auch in Multilabor-Schlaganfallstudien konsequent eingesetzt werden, verbessert das therapeutische Screening und beschleunigt die Translation von potenziellen zerebralen Schutzbehandlungen.