Células madre pluripotentes inducidas, como células madre embrionarias humanas, pueden diferenciarse en casi cualquier célula en el cuerpo y por lo tanto sostienen la gran promesa en el campo de la medicina regenerativa.
Se obtienen células madre embrionarias humanas, o hESCs, desde antes de la implantación embriones, mientras que completamente diferenciado de las células somáticas se utilizan para generar células madre pluripotentes inducidas, que también se denominan iPSCs.
En este video vas a aprender acerca de los principios básicos detrás de generar iPSCs, un protocolo paso a paso para inducir la pluripotencialidad en células diferenciadas y algunas de las muchas aplicaciones downstream y modificaciones del presente Protocolo.
Vamos a empezar por discutir los principios de generación de iPSCs de tipos de células somáticas.
Las células diferenciadas como células de la piel o las neuronas, son las que cuya suerte se decide. Se han comprometido a realizar una función determinada. Por otro lado, células madre pluripotentes son las cuyo destino está decidido, y pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula.
El proceso de cambiar la identidad de una célula ya diferenciada a un estado pluripotente se denomina reprogramación celular. Se trata de cambiar el patrón de expresión génica en la célula, ya que el número y tipo de proteínas producidas por un juego de celular un papel importante en la definición de identidad de la célula.
Una de las formas para inducir la reprogramación celular es mediante la inducción de la expresión de ciertos factores de transcripción. Factores de transcripción son proteínas que se unen a secuencias reguladoras dentro de un gene. Algunas de estas secuencias se llaman "promotores" y por lo tanto promoción la transcripción de un gen. Algunos factores de transcripción pueden influir en la expresión de numerosos genes, que tiene un gran impacto en la identidad de la célula.
Los cuatro factores de transcripción clásica que se han demostrado para inducir pluripotencia son Oct4, Sox2, cMyc y Klf4. Estos factores también son conocidos como factores de Yamanaka, después el investigador que descubrió los efectos de la reprogramación.
Pueden utilizarse varios métodos para inducir la expresión de estos factores de transcripción. El método más común y eficiente es el uso de un virus modificado para entregar genes factor de la transcripción en el núcleo, donde integrará en el genoma.
En este método, los genes que codifican los cuatro factores de Yamanaka son individualmente empacados en diferentes retrovirus y añadidos a distinguir las células. Cuando las células se exponen a modificado el virus, una pequeña fracción de las células diferenciadas se infectan con todos cuatro transcripción factor-llevar virus. Empiezan a dedifferentiate hasta que se forman grandes grupos esféricos de células madre pluripotentes. La formación de cluster ayuda a iPSCs crear un microambiente que es similar a en vivo las células madre, y por lo tanto ayudarles a mantener su pluripotencia.
Ya que ahora entiendes los principios básicos detrás de la generación de iPSCs, Let ' s go mediante un protocolo general para la inducción de pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs, utilizando un sistema de transducción viral.
Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar a las células en su cuerpo, por lo que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.
Para iniciar el proceso de transfección, se elimina el medio de cultivo de una placa que contiene una alta densidad de MEFs, y las células se lavan con solución tampón. A continuación, se agrega una solución que contiene una enzima de degradación de proteínas, como tripsina, para levantar las células de la parte inferior del plato. Medio de cultivo se agrega luego a la placa, y las células separadas se transfieren a un tubo de centrífuga.
Tras la centrifugación, el sedimento se suspende de nuevo en el medio de cultivo. A continuación, se cuentan las células y la concentración se ajusta de modo que un número óptimo de células puede ser infectado con el virus al día siguiente. Incube las células durante la noche.
Después de que las células se han asentado en su nuevo plato, media vieja se sustituye por medios frescos y virus modificados que contienen los factores de transcripción deseada se agregan a la placa. Entonces se incuban las células con el virus por tiempo suficiente permitir la infección tendrá lugar. Después de la incubación, el medio que contiene virus gratis es eliminado y reemplazado con células madre embrionarias frescas medio.
Para 2-3 semanas siguientes a la transformación, las células deben ser cultivadas a 37 º en una incubadora, y los medios de cultivo deben cambiarse diariamente.
Después de este período de tiempo, colonias de iPSC que se parecen a las colonias de células madre embrionarias deberían ser lo suficientemente grandes como para ser recogidos. Las colonias pueden ser transferidas a una placa fresca que contiene medio con factores de crecimiento apropiados y permitió que creciera más. Para confirmar la pluripotencia, una porción de la población de células se tiñe con marcadores de pluripotencia.
Ahora que has visto cómo generar iPSCs de células diferenciadas, echemos un vistazo a algunas aplicaciones posteriores y modificaciones de este método altamente útil.
Una característica importante de iPSCs es que puede ser utilizados para generar casi cualquier célula en el cuerpo. Este ejemplo muestra la generación de células del músculo del corazón, llamado cardiomiocitos, de iPSCs. Para ello, el iPSCs se transfieren a las placas no adherente que les permiten a cuerpos embryoid forma, que son agregados de células madre pluripotentes. Los cuerpos de embryoid son cultivados en suero que contiene medio especializado y ácido ascórbico, que aumenta la diferenciación cardiaca. La diferenciación exitosa se puede observar fácilmente cuando algunas células comienzan a vencer.
Desde iPSCs potencialmente puede diferenciarse en cualquier tipo de células, también pueden formar un organismo entero, como un ratón. Esto puede hacerse usando un análisis llamado complementación tetraploide. En primer lugar, un embrión tetraploide, un embrión que contiene cuatro juegos de cromosomas, se forma mediante la fusión de dos células de un embrión temprano usando un campo eléctrico. El embrión tetraploide se permite desarrollar a la fase de blastocisto. iPSCs entonces se inyectan en el blastocisto, que luego es trasplantado a un destinatario femenino para la gestación. Las células tetraploides sólo son capaces de formar estructuras extraembrionarias como la placenta, por lo que los animales resultantes de este método se derivan enteramente de iPSCs.
Algunos investigadores modifican el procedimiento de reprogramación para facilitar el proceso de identificar las células reprogramadas con éxito más eficientes. Por ejemplo, en este experimento MEFs con la habilidad de expresar la proteína verde fluorescente bajo la influencia del promotor Oct4 ayudó a los investigadores a identificar fácilmente las células que han adquirido la pluripotencia.
Sólo has visto video de Zeus en la generación de células madre pluripotentes inducidas. Este vídeo repasa los principios detrás de este procedimiento y un protocolo paso a paso para generar iPSCs de células diferenciadas. También repasamos cómo este método podría aplicarse o modificado para experimentos en el laboratorio.
El descubrimiento de iPSCs ha tenido un impacto enorme en el campo de la biología de células madre, ya que tiene un enorme potencial para el desarrollo de terapias que se pueden emplear para tratar los trastornos degenerativos. Aunque se ha progresado mucho con iPSCs, el obstáculo que aún debe ser cruzado es el riesgo asociado de cáncer. Los actuales procedimientos de reprogramación tienen el potencial para resultar en el crecimiento de célula no regulada que puede resultar en cáncer. Por lo tanto, más investigación es necesaria para usar iPSCs clínicamente. ¡Como siempre, gracias por ver!
Células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son las células somáticas que han sido genéticamente reprogramadas para formar células madre no diferenc…
Células madre pluripotentes inducidas, como células madre embrionarias humanas, pueden diferenciarse en casi cualquier célula en el cuerpo y por lo tanto sostienen la gran promesa en el campo de la medicina regenerativa.
Se obtienen células madre embrionarias humanas, o hESCs, desde antes de la implantación embriones, mientras que completamente diferenciado de las células somáticas se utilizan para generar células madre pluripotentes inducidas, que también se denominan iPSCs.
En este video vas a aprender acerca de los principios básicos detrás de generar iPSCs, un protocolo paso a paso para inducir la pluripotencialidad en células diferenciadas y algunas de las muchas aplicaciones downstream y modificaciones del presente Protocolo.
Vamos a empezar por discutir los principios de generación de iPSCs de tipos de células somáticas.
Las células diferenciadas como células de la piel o las neuronas, son las que cuya suerte se decide. Se han comprometido a realizar una función determinada. Por otro lado, células madre pluripotentes son las cuyo destino está decidido, y pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula.
El proceso de cambiar la identidad de una célula ya diferenciada a un estado pluripotente se denomina reprogramación celular. Se trata de cambiar el patrón de expresión génica en la célula, ya que el número y tipo de proteínas producidas por un juego de celular un papel importante en la definición de identidad de la célula.
Una de las formas para inducir la reprogramación celular es mediante la inducción de la expresión de ciertos factores de transcripción. Factores de transcripción son proteínas que se unen a secuencias reguladoras dentro de un gene. Algunas de estas secuencias se llaman "promotores" y por lo tanto promoción la transcripción de un gen. Algunos factores de transcripción pueden influir en la expresión de numerosos genes, que tiene un gran impacto en la identidad de la célula.
Los cuatro factores de transcripción clásica que se han demostrado para inducir pluripotencia son Oct4, Sox2, cMyc y Klf4. Estos factores también son conocidos como factores de Yamanaka, después el investigador que descubrió los efectos de la reprogramación.
Pueden utilizarse varios métodos para inducir la expresión de estos factores de transcripción. El método más común y eficiente es el uso de un virus modificado para entregar genes factor de la transcripción en el núcleo, donde integrará en el genoma.
En este método, los genes que codifican los cuatro factores de Yamanaka son individualmente empacados en diferentes retrovirus y añadidos a distinguir las células. Cuando las células se exponen a modificado el virus, una pequeña fracción de las células diferenciadas se infectan con todos cuatro transcripción factor-llevar virus. Empiezan a dedifferentiate hasta que se forman grandes grupos esféricos de células madre pluripotentes. La formación de cluster ayuda a iPSCs crear un microambiente que es similar a en vivo las células madre, y por lo tanto ayudarles a mantener su pluripotencia.
Ya que ahora entiendes los principios básicos detrás de la generación de iPSCs, Let ' s go mediante un protocolo general para la inducción de pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs, utilizando un sistema de transducción viral.
Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar a las células en su cuerpo, por lo que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.
Para iniciar el proceso de transfección, se elimina el medio de cultivo de una placa que contiene una alta densidad de MEFs, y las células se lavan con solución tampón. A continuación, se agrega una solución que contiene una enzima de degradación de proteínas, como tripsina, para levantar las células de la parte inferior del plato. Medio de cultivo se agrega luego a la placa, y las células separadas se transfieren a un tubo de centrífuga.
Tras la centrifugación, el sedimento se suspende de nuevo en el medio de cultivo. A continuación, se cuentan las células y la concentración se ajusta de modo que un número óptimo de células puede ser infectado con el virus al día siguiente. Incube las células durante la noche.
Después de que las células se han asentado en su nuevo plato, media vieja se sustituye por medios frescos y virus modificados que contienen los factores de transcripción deseada se agregan a la placa. Entonces se incuban las células con el virus por tiempo suficiente permitir la infección tendrá lugar. Después de la incubación, el medio que contiene virus gratis es eliminado y reemplazado con células madre embrionarias frescas medio.
Para 2-3 semanas siguientes a la transformación, las células deben ser cultivadas a 37 º en una incubadora, y los medios de cultivo deben cambiarse diariamente.
Después de este período de tiempo, colonias de iPSC que se parecen a las colonias de células madre embrionarias deberían ser lo suficientemente grandes como para ser recogidos. Las colonias pueden ser transferidas a una placa fresca que contiene medio con factores de crecimiento apropiados y permitió que creciera más. Para confirmar la pluripotencia, una porción de la población de células se tiñe con marcadores de pluripotencia.
Ahora que has visto cómo generar iPSCs de células diferenciadas, echemos un vistazo a algunas aplicaciones posteriores y modificaciones de este método altamente útil.
Una característica importante de iPSCs es que puede ser utilizados para generar casi cualquier célula en el cuerpo. Este ejemplo muestra la generación de células del músculo del corazón, llamado cardiomiocitos, de iPSCs. Para ello, el iPSCs se transfieren a las placas no adherente que les permiten a cuerpos embryoid forma, que son agregados de células madre pluripotentes. Los cuerpos de embryoid son cultivados en suero que contiene medio especializado y ácido ascórbico, que aumenta la diferenciación cardiaca. La diferenciación exitosa se puede observar fácilmente cuando algunas células comienzan a vencer.
Desde iPSCs potencialmente puede diferenciarse en cualquier tipo de células, también pueden formar un organismo entero, como un ratón. Esto puede hacerse usando un análisis llamado complementación tetraploide. En primer lugar, un embrión tetraploide, un embrión que contiene cuatro juegos de cromosomas, se forma mediante la fusión de dos células de un embrión temprano usando un campo eléctrico. El embrión tetraploide se permite desarrollar a la fase de blastocisto. iPSCs entonces se inyectan en el blastocisto, que luego es trasplantado a un destinatario femenino para la gestación. Las células tetraploides sólo son capaces de formar estructuras extraembrionarias como la placenta, por lo que los animales resultantes de este método se derivan enteramente de iPSCs.
Algunos investigadores modifican el procedimiento de reprogramación para facilitar el proceso de identificar las células reprogramadas con éxito más eficientes. Por ejemplo, en este experimento MEFs con la habilidad de expresar la proteína verde fluorescente bajo la influencia del promotor Oct4 ayudó a los investigadores a identificar fácilmente las células que han adquirido la pluripotencia.
Sólo has visto video de Zeus en la generación de células madre pluripotentes inducidas. Este vídeo repasa los principios detrás de este procedimiento y un protocolo paso a paso para generar iPSCs de células diferenciadas. También repasamos cómo este método podría aplicarse o modificado para experimentos en el laboratorio.
El descubrimiento de iPSCs ha tenido un impacto enorme en el campo de la biología de células madre, ya que tiene un enorme potencial para el desarrollo de terapias que se pueden emplear para tratar los trastornos degenerativos. Aunque se ha progresado mucho con iPSCs, el obstáculo que aún debe ser cruzado es el riesgo asociado de cáncer. Los actuales procedimientos de reprogramación tienen el potencial para resultar en el crecimiento de célula no regulada que puede resultar en cáncer. Por lo tanto, más investigación es necesaria para usar iPSCs clínicamente. ¡Como siempre, gracias por ver!
Células madre pluripotentes inducidas, como células madre embrionarias humanas, pueden diferenciarse en casi cualquier célula en el cuerpo y por lo tanto sostienen la gran promesa en el campo de la medicina regenerativa.
Se obtienen células madre embrionarias humanas, o hESCs, desde antes de la implantación embriones, mientras que completamente diferenciado de las células somáticas se utilizan para generar células madre pluripotentes inducidas, que también se denominan iPSCs.
En este video vas a aprender acerca de los principios básicos detrás de generar iPSCs, un protocolo paso a paso para inducir la pluripotencialidad en células diferenciadas y algunas de las muchas aplicaciones downstream y modificaciones del presente Protocolo.
Vamos a empezar por discutir los principios de generación de iPSCs de tipos de células somáticas.
Las células diferenciadas como células de la piel o las neuronas, son las que cuya suerte se decide. Se han comprometido a realizar una función determinada. Por otro lado, células madre pluripotentes son las cuyo destino está decidido, y pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula.
El proceso de cambiar la identidad de una célula ya diferenciada a un estado pluripotente se denomina reprogramación celular. Se trata de cambiar el patrón de expresión génica en la célula, ya que el número y tipo de proteínas producidas por un juego de celular un papel importante en la definición de identidad de la célula.
Una de las formas para inducir la reprogramación celular es mediante la inducción de la expresión de ciertos factores de transcripción. Factores de transcripción son proteínas que se unen a secuencias reguladoras dentro de un gene. Algunas de estas secuencias se llaman "promotores" y por lo tanto promoción la transcripción de un gen. Algunos factores de transcripción pueden influir en la expresión de numerosos genes, que tiene un gran impacto en la identidad de la célula.
Los cuatro factores de transcripción clásica que se han demostrado para inducir pluripotencia son Oct4, Sox2, cMyc y Klf4. Estos factores también son conocidos como factores de Yamanaka, después el investigador que descubrió los efectos de la reprogramación.
Pueden utilizarse varios métodos para inducir la expresión de estos factores de transcripción. El método más común y eficiente es el uso de un virus modificado para entregar genes factor de la transcripción en el núcleo, donde integrará en el genoma.
En este método, los genes que codifican los cuatro factores de Yamanaka son individualmente empacados en diferentes retrovirus y añadidos a distinguir las células. Cuando las células se exponen a modificado el virus, una pequeña fracción de las células diferenciadas se infectan con todos cuatro transcripción factor-llevar virus. Empiezan a dedifferentiate hasta que se forman grandes grupos esféricos de células madre pluripotentes. La formación de cluster ayuda a iPSCs crear un microambiente que es similar a en vivo las células madre, y por lo tanto ayudarles a mantener su pluripotencia.
Ya que ahora entiendes los principios básicos detrás de la generación de iPSCs, Let ' s go mediante un protocolo general para la inducción de pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs, utilizando un sistema de transducción viral.
Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar a las células en su cuerpo, por lo que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.
Para iniciar el proceso de transfección, se elimina el medio de cultivo de una placa que contiene una alta densidad de MEFs, y las células se lavan con solución tampón. A continuación, se agrega una solución que contiene una enzima de degradación de proteínas, como tripsina, para levantar las células de la parte inferior del plato. Medio de cultivo se agrega luego a la placa, y las células separadas se transfieren a un tubo de centrífuga.
Tras la centrifugación, el sedimento se suspende de nuevo en el medio de cultivo. A continuación, se cuentan las células y la concentración se ajusta de modo que un número óptimo de células puede ser infectado con el virus al día siguiente. Incube las células durante la noche.
Después de que las células se han asentado en su nuevo plato, media vieja se sustituye por medios frescos y virus modificados que contienen los factores de transcripción deseada se agregan a la placa. Entonces se incuban las células con el virus por tiempo suficiente permitir la infección tendrá lugar. Después de la incubación, el medio que contiene virus gratis es eliminado y reemplazado con células madre embrionarias frescas medio.
Para 2-3 semanas siguientes a la transformación, las células deben ser cultivadas a 37 º en una incubadora, y los medios de cultivo deben cambiarse diariamente.
Después de este período de tiempo, colonias de iPSC que se parecen a las colonias de células madre embrionarias deberían ser lo suficientemente grandes como para ser recogidos. Las colonias pueden ser transferidas a una placa fresca que contiene medio con factores de crecimiento apropiados y permitió que creciera más. Para confirmar la pluripotencia, una porción de la población de células se tiñe con marcadores de pluripotencia.
Ahora que has visto cómo generar iPSCs de células diferenciadas, echemos un vistazo a algunas aplicaciones posteriores y modificaciones de este método altamente útil.
Una característica importante de iPSCs es que puede ser utilizados para generar casi cualquier célula en el cuerpo. Este ejemplo muestra la generación de células del músculo del corazón, llamado cardiomiocitos, de iPSCs. Para ello, el iPSCs se transfieren a las placas no adherente que les permiten a cuerpos embryoid forma, que son agregados de células madre pluripotentes. Los cuerpos de embryoid son cultivados en suero que contiene medio especializado y ácido ascórbico, que aumenta la diferenciación cardiaca. La diferenciación exitosa se puede observar fácilmente cuando algunas células comienzan a vencer.
Desde iPSCs potencialmente puede diferenciarse en cualquier tipo de células, también pueden formar un organismo entero, como un ratón. Esto puede hacerse usando un análisis llamado complementación tetraploide. En primer lugar, un embrión tetraploide, un embrión que contiene cuatro juegos de cromosomas, se forma mediante la fusión de dos células de un embrión temprano usando un campo eléctrico. El embrión tetraploide se permite desarrollar a la fase de blastocisto. iPSCs entonces se inyectan en el blastocisto, que luego es trasplantado a un destinatario femenino para la gestación. Las células tetraploides sólo son capaces de formar estructuras extraembrionarias como la placenta, por lo que los animales resultantes de este método se derivan enteramente de iPSCs.
Algunos investigadores modifican el procedimiento de reprogramación para facilitar el proceso de identificar las células reprogramadas con éxito más eficientes. Por ejemplo, en este experimento MEFs con la habilidad de expresar la proteína verde fluorescente bajo la influencia del promotor Oct4 ayudó a los investigadores a identificar fácilmente las células que han adquirido la pluripotencia.
Sólo has visto video de Zeus en la generación de células madre pluripotentes inducidas. Este vídeo repasa los principios detrás de este procedimiento y un protocolo paso a paso para generar iPSCs de células diferenciadas. También repasamos cómo este método podría aplicarse o modificado para experimentos en el laboratorio.
El descubrimiento de iPSCs ha tenido un impacto enorme en el campo de la biología de células madre, ya que tiene un enorme potencial para el desarrollo de terapias que se pueden emplear para tratar los trastornos degenerativos. Aunque se ha progresado mucho con iPSCs, el obstáculo que aún debe ser cruzado es el riesgo asociado de cáncer. Los actuales procedimientos de reprogramación tienen el potencial para resultar en el crecimiento de célula no regulada que puede resultar en cáncer. Por lo tanto, más investigación es necesaria para usar iPSCs clínicamente. ¡Como siempre, gracias por ver!
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Q1: What are the four Yamanaka factors and why are they important for creating iPSCs?
The four Yamanaka factors—Oct4, Sox2, cMyc, and Klf4—are transcription factors that induce pluripotency in differentiated cells. These proteins bind to regulatory sequences in genes and influence the expression of numerous genes, fundamentally changing cell identity. Their discovery revolutionized stem cell biology by enabling the reprogramming of somatic cells into pluripotent stem cells without using embryos.
Q2: How does viral transduction deliver reprogramming factors into cells?
Modified retroviruses are engineered to carry genes encoding the four Yamanaka factors. When differentiated cells are exposed to these viruses, a small fraction becomes infected with all four transcription factor-carrying viruses simultaneously. The viral genes integrate into the cell's genome, initiating dedifferentiation and eventually forming large spherical clusters of pluripotent stem cells.
Q3: What is cellular reprogramming and how does it change cell identity?
Cellular reprogramming is the process of converting an already differentiated cell into a pluripotent state by altering its gene expression patterns. Since a cell's identity is determined by the types and amounts of proteins it produces, changing which genes are expressed fundamentally transforms the cell's fate. This allows specialized cells like skin cells to regain the ability to differentiate into any cell type.
Q4: How can iPSCs be differentiated into specific cell types like heart muscle?
iPSCs are transferred to non-adherent plates where they form embryoid bodies—aggregates of pluripotent stem cells. These aggregates are then cultured in specialized medium containing serum and ascorbic acid tailored to the desired cell type. For cardiomyocytes, successful differentiation is confirmed when cells begin to beat, demonstrating functional heart muscle development.
Q5: What is tetraploid complementation and how does it demonstrate iPSC potential?
Tetraploid complementation creates an embryo with four sets of chromosomes by fusing two early embryo cells using an electric field. iPSCs are injected into the resulting blastocyst, which is then transplanted into a recipient female. Since tetraploid cells form only extraembryonic structures like the placenta, the resulting organism develops entirely from iPSCs, proving their ability to generate a complete organism.
Q6: Why do iPSC clusters help maintain pluripotency in culture?
Cluster formation creates a microenvironment similar to in vivo stem cells, which is essential for maintaining pluripotency. The three-dimensional structure and cell-cell interactions within these spherical aggregates provide signals that prevent differentiation and support the undifferentiated state, allowing iPSCs to remain capable of differentiating into any cell type.
Q7: What is the main clinical challenge preventing iPSCs from being used in therapy today?
The primary hurdle is the associated risk of cancer. Current reprogramming procedures can result in unregulated cell growth, potentially leading to malignant transformation. Although iPSCs hold enormous promise for treating degenerative disorders, more research is required to ensure their safety and efficacy before they can be safely employed in clinical practice.
Chapters in this video
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Overview
0:54
Principles of Cellular Reprogramming
3:30
General Protocol
5:45
Applications
7:51
Summary
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