Un enfoque práctico de elaboración de mapas genéticos inducible destino: una guía visual para marcar y rastrear las células En Vivo</em

Resumen

Genéticos inducible destino de asignación (GIFM) las marcas y las células de las pistas con un control preciso espacial y temporal In vivo Y define la forma en las células de un linaje genético específico contribuir al desarrollo y los tejidos adultos. Demostrado aquí son las técnicas necesarias para el destino de embriones de ratón E12.5 mapa para el análisis de epifluorescencia y explante.

Resumen

Los mapas son generados por el destino marcado y seguimiento de las células in vivo para determinar cómo los progenitores contribuyen a estructuras específicas y los tipos de células en el desarrollo y los tejidos adultos. Un avance en este concepto es que G enetic nducible F comió M apping (GIFM), que une la expresión génica, el destino celular, y el comportamiento de células in vivo, para crear mapas de destino basada en el linaje genético.

GIFM explota X-Creer líneas donde X es un gen o un conjunto de elementos reguladores de genes que confieren expresión espacial de una proteína bacteriófagos modificados, la recombinasa Cre (Creer ^T). Creer ^T contiene una modificación e estrogénico r dominio ligando eceptor vinculante que hace Creer ^T secuestrado en el citoplasma en ausencia de la droga tamoxifeno. La unión de tamoxifeno versiones Creer ^T, que se transloca al núcleo y la recombinación media entre las secuencias de ADN flanqueado por sitios loxP. En GIFM, la recombinación se produce normalmente entre un casete loxP flanqueado parada antes de un gen reportero, como las buenas prácticas agrarias.

Los ratones son criados para contener una región o tipo de células específicas Creer y un alelo reportero condicional. Los ratones no tratados no se han marcado por la cinta parada en el Boletín previene la transcripción más del gen reportero. Nosotros administramos el tamoxifeno por sonda oral a tiempo, las mujeres embarazadas, que proporciona un control temporal de la liberación Creer ^T y posterior translocación al núcleo de quitar el cassette parada de la periodista. Después de la recombinación, el alelo periodista es constitutivamente y expresó heritably. Esta serie de eventos marca las células de tal manera que su historia genética está indeleblemente grabada. El periodista recombinados por lo tanto sirve como un marcador de linaje genético de alta fidelidad que, una vez encendido, es desacoplada de la expresión de los genes utilizados inicialmente para conducir ^T CREER.

Aplicamos GIFM en ratón para estudiar el desarrollo normal y la contribución de determinar el linaje genético de los tipos de células y tejidos adultos. También utilizamos GIFM para seguir las células mutantes en las bases genéticas para comprender mejor los fenotipos complejos que imitan características principales de trastornos genéticos humanos.

En este artículo de vídeo guías investigadores a través de métodos experimentales para aplicar con éxito GIFM. Demostramos el método que utiliza nuestro bien caracterizados Wnt1-Creer ^T, los ratones mediante la administración de tamoxifeno mGFP en el día embrionario (E) 8.5 a través de una sonda nasogástrica seguida de disección en E12.5 y análisis por microscopía estereoscópica epifluorescencia. También se muestra cómo micro-disección de dominios destino asignado para la preparación del explante o análisis FACS y diseccionar adultos mapeado destino, los cerebros de toda imagen de montaje fluorescente. En conjunto, estos procedimientos permiten a los investigadores a abordar las cuestiones críticas en la biología del desarrollo y modelos de enfermedades.

Protocolo

El tamoxifeno Preparación y Procedimiento sonda nasogástrica (E8.5)

• Preparar a 20 mg / ml de solución stock de tamoxifeno por disolución de tamoxifeno en el aceite de maíz pre-calentado.
• Incubar la solución a 37 ° C durante 2 horas en un nutator y agitar de forma intermitente.
• Proteger a la población de la luz con tamoxifeno, se almacenan a 4 ° C, y el uso de hasta un mes.
• Para los experimentos de mapeo de destino, establecer un par de crianza que consiste en una hembra Swiss Webster (de tipo salvaje, compró de Taconic) y un macho lleva a la vez un gen específico CREER alelo ^T y un alelo reportero.....

Discusión

El sistema GIFM que hemos demostrado se puede utilizar para responder a una amplia gama de preguntas en una variedad de procesos celulares. Por ejemplo, los ratones diseñados con diferentes conductores de Cre puede ser utilizada para combatir cualquier tipo de célula, tejido o linaje genético de interés. Además, dado que el tamoxifeno puede ser administrada en cualquier punto del tiempo embrionario y postnatal, la recombinación puede dirigirse a cualquiera de las fases de desarrollo correspondientes. El control espacial.......