En este vídeo, que muestran las técnicas experimentales utilizadas para la fabricación de cumplimiento, la matriz extracelular (ECM) sustratos recubiertos adecuadas para el cultivo celular, y que son susceptibles de microscopía de fuerza de tracción y observando los efectos de la rigidez de ECM en el comportamiento celular.
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Artículo de método
Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular
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Resumen
Resumen
La regulación de la adhesión celular a la matriz extracelular (MEC) es esencial para la migración celular y la remodelación de ECM. Adhesiones focales son conjuntos macromoleculares que la pareja contráctil F-actina del citoesqueleto a la matriz extracelular. Esta conexión permite la transmisión intracelular de las fuerzas mecánicas a través de la membrana celular al sustrato subyacente. Trabajos recientes han demostrado las propiedades mecánicas de la ECM regular de adhesión focal y la morfología de la F-actina, así como numerosos procesos fisiológicos, como la diferenciación celular, la división, proliferación y migración. Por lo tanto, el uso de sustratos de cultivo celular se ha convertido en un método cada vez más frecuente para controlar con precisión y modulan las propiedades mecánicas de ECM.
Para cuantificar las fuerzas de tracción en las adhesiones focales en células adherentes, sustratos compatibles se utilizan en combinación con imágenes de alta resolución y las técnicas de cómputo en un método llamado microscopio de fuerza de tracción (TFM). Esta técnica se basa en la medición de la magnitud local y dirección de las deformaciones inducidas por la contracción del sustrato celular. En combinación con la alta resolución de la microscopía de fluorescencia de las proteínas de marcado con fluorescencia, es posible correlacionar la organización del citoesqueleto y remodelación con las fuerzas de tracción.
Aquí se presenta un protocolo experimental detallado para la preparación de dos dimensiones, matrices cumplen con el propósito de crear un sustrato de cultivo de células con un bien caracterizado, la rigidez mecánica ajustable, lo que es adecuado para medir la contracción celular. Estos protocolos incluyen la fabricación de hidrogeles de poliacrilamida, capa de proteínas ECM en tales geles, las células de revestimiento de gel, de alta resolución y microscopía confocal utilizando una cámara de perfusión. Además, ofrecemos una muestra representativa de los datos que demuestran la ubicación y magnitud de las fuerzas celular utilizando protocolos citados TFM.
Protocolo
1. La activación de la superficie cubreobjetos
- Cubreobjetos (# 1.5, 22x40 mm) se limpian con una serie de lavados de jabón y el etanol en un protocolo previamente descrito (Waterman-Storer, 1998) para limpiar y quitar el polvo.
- Cubreobjetos lugar en un estante de acero inoxidable de soporte, de tal manera que cubreobjetos están separados y sin tocarse.
- En campana para vapores químicos (guantes de nitrilo y gafas de protección recomendado), diluir la fuerza total de 3 aminopropiltrimetoxisilano en isopropanol para una concentración final de 2% (2 ml de silano / 100 ml de isopropanol) para llenar un recipiente de vidrio cuadrados (~ 350 m....
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Discusión
El procedimiento descrito aquí para la instalación de un microscopio de fuerza de tracción (TFM) experimento, junto con la implementación de rutinas de seguimiento de cálculo (Sabass et al., 2008), permite la cuantificación de las fuerzas de celulares con escala micrométrica resolución espacial. Para optimizar el protocolo experimental, es fundamental para formar un sustrato de gel puro y uniforme con capa uniforme de ligando ECM. Se discuten posibles escollos a continuación:
No unifor.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias al laboratorio de Ulrich Schwarz para el software de seguimiento de cálculo utilizados en la cuantificación de las fuerzas de tracción celular (Sabass et al., 2008). Este trabajo fue apoyado por una concesión de carrera Burroughs Wellcome y el premio el director del NIH de Pioneer (DP10D00354) a ML Gardel y Médico Investigador Científico del Premio Nacional de Servicio (5 T32 GM07281) de invierno SP.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3-aminopropiltrimetoxisilano | Aldrich | 28, 177-8 | |
| Acrylamida al 40% | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Bis-acrylamida al 2% | Fisher Scientific | BP1404 | |
| TEMED | Fisher Scientific | BP 150-20 | |
| Persulfato de amonio | Fisher Scientific | BP179 | |
| Microesferas fluorescentes de 40 nm | Invitrogen | F8789 | |
| Sulfo-SANPAH | Pierce, Thermo Scientific | 22589 | |
| Cámara de imagen confocal (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | |
| Centrifugadora para cubreobjetos | Hecho en casa | NA | |
| Lámpara ultravioleta CL1000 | UVP Inc. | 95-0228-01 | |
| Estantería de acero inoxidable | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | |
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | |
| Hidrazina hidratada | Sigma-Aldrich | 225819 | |
| Meta-periodato de sodio | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20504 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Colágeno | BD Biosciences | 354236 | |
| Cubreobjetos (#1.5) | Corning | 2940‐224 | |
| Glutaraldehído | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | |
| Ácido acético | Acros Organics | 64-19-7 |
Referencias
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer
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