Para cultivar las células troncales de la cresta neural (NCSC) in vitro, un medio especial (NCSCM) es necesario. Parte esencial de NCSCM es el extracto de embrión de pollo (CEE). Se describen las técnicas precisas para producir una cantidad al máximo de calidad en estado puro y de alta CEE, incluyendo detalles como el aislamiento, la maceración, la centrifugación, y los procesos de filtración.
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Artículo de método
La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre
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Resumen
Resumen
La cresta neural nace de la neuro-ectodermo durante la embriogénesis y persiste sólo temporalmente. Los primeros experimentos ya prueba de las células progenitoras pluripotentes a ser una parte integral de la cresta neural 1. Fenotípicamente, las células troncales de la cresta neural (NCSC) se definen por la vez que expresa p75 (bajo afín crecimiento de los nervios del receptor del factor, LNGFR) y SOX10 durante su migración desde la cresta neural, 2,3,4,5. Estas células progenitoras pueden diferenciarse en células musculares lisas, células cromafines, neuronas y células gliales, así como los melanocitos, cartílago y hueso 6,7,8,9. Para cultivar NCSC in vitro, un especial de madre de la cresta neural medio celular (NCSCM) se requiere 10. La parte más compleja de la NCSCM es la preparación del extracto de embrión de pollo (CEE), que representan una fuente esencial de los factores de crecimiento para el NCSC, así como para otros tipos de explantes neural. Otros ingredientes NCSCM lado CEE están disponibles comercialmente. La producción de CCE de laboratorio con equipamiento de serie es de gran importancia para conocer los detalles difíciles como el aislamiento, la maceración, la centrifugación, y los procesos de filtración. En este protocolo se describen las técnicas precisas para producir una cantidad al máximo de calidad en estado puro y de alta CEE.
Protocolo
Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Duisburg-Essen (Alemania).
Parte 1: Configuración (no se muestra en el vídeo)
La elaboración de materiales y soluciones (antes de tomar los huevos de la incubadora)
- Los huevos que se incuban en una incubadora humidificada durante 11 días a 37 ° C (100 ° F).
- 70% de etanol en aerosol, placas limpias, precisas pinzas limpias, 4 ° C (40 ° F) en frío estéril DMEM en hielo y 60 ml jeringas estériles
- Tubos de 50 ml estéril Corning tiene que ser a medio llenar con 4 ° C frío DMEM para mezclar los embriones macerado en una proporción de 1:1 (en masa macerada: DMEM). Tan pronto como los huevos se sacan de la disección de la incubadora de los embriones de pollo tiene que ser iniciado.
- Esterilizar las herramientas de disección en el autoclave o en el día de la disección, sumerja los instrumentos en el 70% de etanol durante 20 minutos.
Parte 2: La disección de los embriones de pollo (demostrado en el vídeo)
- Húmedo los huevos se incuban con un spray de etanol al 70% por lo menos durante 30 segundos y secarlos cuidadosamente con toallas de papel suave, mientras que los huevos no sacudir demasiado.
Nota: Se recomienda la disección no más de 60 embriones de pollo al mismo tiempo. - Abrir los huevos con cuidado por estrellarse contra un borde afilado y sacar el embrión con cuidado de no destruir el saco vitelino del embrión de pollo o de sí mismo.
- Busque el principio de que el cordón umbilical de forma rápida y abrir el envoltorio transparente, sin destruir el saco vitelino o pequeños vasos. A continuación, analizar el cordón umbilical con unas pinzas limpias precisa.
- Tome el embrión fuera del saco vitelino.
Nota: Los embriones deben ser decapitados rápidamente (no se muestra en el video). - Recoger los embriones en medio esencial mínimo a 4 ° C.
Parte 3: Maceración de los embriones de pollo
- Tome el émbolo de una jeringa de 60 mL estéril.
- Transferencia de aproximadamente 10 embriones en una sola jeringa de 60 ml.
- Ponga el émbolo con cuidado en la jeringa con el fin de no arriesgarse a perder el material macerado.
- Macerar por empujando el émbolo.
- Recoger la masa macerada en los tubos preparados Corning llenó medio con DMEM en una proporción de 1:1 (en masa macerada: DMEM). Con 10 embriones de un volumen aproximado de 25 ml se produce.
- Coloque la mezcla en un agitador durante 45 min a 4 ° C.
Parte 4: La centrifugación del embrión de pollo - Suspensión DMEM
- Transferencia de embrión de pollo - DMEM suspensión en los tubos de centrifugación.
- Añadir hialuronidasa estéril a una concentración de 1 mg por cada 25 mg de embrión.
- Tara de los tubos de centrifugación de manera muy precisa.
Nota: Este paso debe realizarse con precaución, ya que la centrifugación se ejecuta en muy alto g-fuerza y el daño material o una centrifugadora, podría ocurrir si se utilizan tubos de desequilibrio. Con una alta precisión de pesaje de la máquina acuerdo con respecto a las tres posiciones después del punto decimal para todos los tubos deben ser recibidos por el ajuste de la cantidad que falta con DMEM. - Reducir la temperatura de la centrífuga a 4 ° C.
Nota: Además, el rotor de centrifugación deben ser almacenados en una cámara de refrigeración o refrigerador durante la noche. - Centrífuga 6 horas por lo menos para 180.000 xgx h. Nota: Para obtener mejores resultados con respecto a la separación de las fases de un solo uso xgx 266.000 h. Si es posible, utilice el ajuste de vacío.
Parte 5: Filtración del extracto de Embrión de Pollo
Después de la centrifugación de tres fases se puede notar: La fase superior de líquido sucio con fragmentos de grasa, la fase líquida en el centro y el sedimento en el fondo del tubo de centrifugación. Nota: Temblor o movimiento rápido de la mezcla se centrifuga tiene que ser estrictamente evitados, ya que esto destruiría el resultado de la etapa de centrifugación por la pérdida de la fase líquida y clara central.
Nota: Todos los pasos siguientes deben llevarse a cabo en condiciones asépticas utilizando un banco de flujo laminar de aire:
- Pipeta de la fase líquida en un sistema de filtros con poros de 0,45 micras. A continuación, encienda la bomba de vacío conectada.
Nota: No toque la bolita en la parte inferior. Esto daría lugar a una contaminación de la extracción y un bloqueo del sistema de filtro. - Transferir el extracto pre-en un sistema de filtros con poros de 0,22 micras y el interruptor de la bomba de vacío conectada de nuevo.
- Alícuota del extracto obtenido de embrión de polloen tubos estériles de 15 ml Corning.
- Rápidamente almacenar las alícuotas a -80 ° C (-62 ° F). Nota: La duración de hasta dos años de Europa central y oriental, si se almacena a -80 ° C.
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Discusión
Este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han descrito en el pasado 10,11. Además de las publicaciones anteriores que aquí muestran los distintos pasos diferentes del proceso de ampliación más. Esto apoya el experimentador con detalles importantes asegurando los procedimientos correctos y los resultados fiables. Además, como el proceso de disección es una parte esencial de la extracción de Europa central y oriental se describe el procedimiento de toma de los embriones fuera del sac...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El apoyo y asesoramiento de Markus Pajtler Bohrer y Robert fueron de gran valor para la visualización de este protocolo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Huevos de pollo incubados durante 11 días | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Espray desinfectante alcohólico | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Jeringa estéril (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubos estériles (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Puntas de pipeta estériles | Starlab GmbH | ||
| Hialuronidasa tipo IV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups estériles (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipetas estériles (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrífuga L5-50 | Tipo de rotor Ti-45 |
Referencias
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
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Reimpresiones y permisos
