En este video se demuestra la técnica de la litografía blanda, con polidimetilsiloxano (PDMS) que utilizamos para farbricate un dispositivo de microfluidos para el cultivo de neuronas.
Artículo de método
Fabricación de un dispositivo de microfluidos para la compartimentación de las neuronas y los axones Soma
En este artículo
Resumen
Resumen
En este vídeo, se demuestra la técnica de la litografía blanda, con polidimetilsiloxano (PDMS), que se utiliza para la fabricación de un dispositivo de microfluidos para el cultivo de neuronas. Anteriormente, una oblea de silicio fue modelado con el diseño del dispositivo de microfluidos con las neuronas SU-8 y la fotolitografía para crear un molde maestro, o lo que nos referimos simplemente como un "maestro". A continuación, se vierte el polímero de silicio PDMS en la parte superior de la maestra, que se cura por calentamiento de la PDMS a 80 ° C durante 1 hora. El PDMS forma un molde negativo del dispositivo. El PDMS es cuidadosamente cortado y levantado del maestro. Los agujeros son perforados en los yacimientos y será el exceso de PDMS recortada desde el dispositivo. El nitrógeno es utilizado para vencer a los residuos restantes del dispositivo. En este punto, los dispositivos están listos para su uso y puede unido a Corning cubierta de vidrio N º 1 con un esterilizador de plasma / limpiador o puede ser unida reversiblemente a la cubierta de cristal con sólo colocar el dispositivo en la parte superior de la cubierta de vidrio. La unión reversible del dispositivo de vidrio está cubierto en un video por separado y requiere en primer lugar que el dispositivo se esterilizan con el 70% de etanol o en autoclave. Plasma esteriliza el tratamiento de los dispositivos por lo que no se requiere tratamiento adicional. Es, sin embargo, importante, cuando se plasma el tratamiento de los dispositivos, para añadir líquidos a los dispositivos a los 10 minutos del tratamiento de plasma, mientras que las superficies están todavía hidrofílico. Esperando más de 10 minutos para añadir líquidos en el dispositivo hace que sea difícil que el líquido entre en el dispositivo. Los dispositivos de las neuronas suelen plasma con destino a la cubierta de vidrio y 0,5 mg / ml de poli-L-lisina (PLL) en tampón borato pH 8,5 se añade inmediatamente el dispositivo. Después de un mínimo de 3 horas de incubación con PLL, los dispositivos se lavan con agua dH2O un mínimo de 3 veces con al menos 15 minutos entre cada lavado. A continuación, se elimina el agua y los medios de comunicación fresca se agrega al dispositivo. En este punto, el dispositivo está listo para su uso. Es importante recordar en este punto para no eliminar todos los medios de comunicación del dispositivo. Siempre dejan los medios de comunicación en el canal principal.
Protocolo
Parte 1: Preparar el dispositivo de microfluidos neurona
- A 3 "oblea de silicio con un patrón de hechos de SU-8 mediante fotolitografía se utiliza para convertir el polidimetilsiloxano (PDMS) molde de microfluidos. Nos referimos a la SU-8 de obleas de silicio estampado como moldes del amo, o" maestros ".
- PDMS se mezcla con el agente de curado en w / w proporción de 10:1, es decir, por 10 gramos de PDMS, 1 gramo de catalizador se añade a la misma.
- El PDMS se mezcla bien y se vierte sobre la oblea de silicio. La oblea de silicio se encuentra a unos 10 cm de poliestireno plato de Petri. Se tarda aproximadamente 12 a 15 g de PDMS para cubrir el principal con un espesor de aproximadamente 4 mm.
- El maestro con el PDMS se coloca en un desecador de vacío con la tapa de la placa de Petri, y el vacío se aplica. Esto se hace para ayudar a eliminar las burbujas de la PDMS que se introdujeron durante la agitación en el del agente de curado. Se tarda aproximadamente 15 minutos para que las burbujas de aire que ser eliminado.
- El maestro con PDMS se quita de en el desecador. Una pistola de aire con un filtro de 0,45 um se utiliza para eliminar las burbujas restantes.
- El maestro se coloca sobre una placa de 80 ° C caliente durante 1 hora de curar.
Nota: Si un desecador de vacío no está disponible, el maestro puede dejarse a temperatura ambiente durante varias horas. Las burbujas de aire con el tiempo se disipará por sí mismos. Si un plato caliente no está disponible, el PDMS se cura a temperatura ambiente, después de 24 horas.
Nota: También es importante asegurarse de que el maestro es el nivel durante el proceso de curado.
Parte 2: Cortar el dispositivo de microfluidos neurona
- Una vez que el PDMS se cura en el maestro, que es llevado a una campana de limpieza.
- Usando una hoja de bisturí, un círculo se corta en todo el perímetro de los dispositivos. Cuando uno inserta el disco en el PDMS, es importante ponerse en contacto con la oblea de silicio, pero no poner demasiada presión sobre la lámina, de lo contrario el maestro se agrieta.
- Con un círculo de cortar todo el camino alrededor de los dispositivos (hay 4 equipos por cada 3 "Maestro de silicio), el PDMS es cuidadosamente levantado del maestro. Este se puede iniciar girando suavemente la hoja de bisturí, ya que se inserta en la corte antes de .
- A continuación, los embalses están perforados en el dispositivo mediante un 8 mm de tejido biopsia en sacabocados.
- Los dispositivos están en cuartos y luego el exceso de PDMS recorta de modo que el dispositivo se encaja perfectamente en la cubierta del cristal de Corning (N º 1) 24 mm x 40 mm. El nitrógeno se utiliza aire para soplar los residuos restantes. Restos obstinada también se pueden eliminar con la marca 3M Scotch 471 cinta de vinilo.
Parte 3: Plasma unión de los dispositivos de cubreobjetos de vidrio.
- Limpiador de plasma se utiliza para unir una Harrick los dispositivos de neurona a la cubierta se desliza. En pocas palabras, los productos se colocan en el filtro de plasma y una bomba de vacío se utiliza para evacuar el aire de la cámara.
- Después de la presión de vacío ha alcanzado los 300 miliTorr, se activa la alimentación de la bobina eléctrica y establece en alto.
- La bobina eléctrica crea plasma, "un gas parcialmente ionizado compuesto de electrones, iones y átomos neutros o moléculas" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , de las moléculas de aire que queda a la izquierda en la cámara. El plasma genera especies reactivas en la superficie del vidrio y el dispositivo, que cuando se colocan juntos formarán una unión permanente. El plasma también convierte las superficies hidrófilas, que ayuda a facilitar la incorporación de líquidos. Además, el filtro de plasma esteriliza los dispositivos.
La superficie del dispositivo de PDMS que contiene el dispositivo de microfluidos se coloca boca arriba en el filtro de plasma junto con las diapositivas de cristal.
Las superficies de los tratados con plasma de la copa y el dispositivo de microfluidos son ensambladas en contacto unos con otros en una mesa de trabajo limpia y luego se colocan en placas de 60 mm estériles. Las superficies tratadas formar un vínculo estrecho irreversible. - A 10 minutos de plasma de unión de los dispositivos de cristal, poli-L-lisina (PLL) se añade al dispositivo. Después de 10 minutos, la hidrofilia del dispositivo se reducirá por lo que es difícil para el PLL para entrar en el dispositivo.
Nota: Es importante para comprobar si las burbujas de aire en el dispositivo después de la adición de PLL. Las burbujas de aire en el canal principal no son deseables, ya que se oxidan las células. Un método fácil para eliminar las burbujas de aire existente es utilizar una pipeta P200 lleno de 150 ul de líquido (en este caso PLL), coloque la punta directamente en la apertura del canal principal, y presione el P200 con fuerza. Esto puede ser necesario repetir varias veces, pero finalmente la fuerza de la pipeta impulsará las burbujas. - Los dispositivos que contienen PLL se dejan incubar durante la noche en un estándar de cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Al día siguiente, el devicios se lavan dos veces rápidamente con autoclave dH2O. Durante este proceso, el líquido nunca es totalmente eliminado de los canales principales, sólo a partir de los embalses. La eliminación de líquidos de los principales canales se introducen burbujas. Después de dos lavados rápidos, los dispositivos están llenos de autoclave dH2O y volver a colocar en la incubadora durante un mínimo de 3 horas, o toda la noche.
- Al día siguiente, los dispositivos son una vez más, lavados 2 veces rápidamente con autoclave dH2O. Entonces, los medios de comunicación neural basal, con los suplementos necesarios B27 y glutamax para el cultivo de neuronas de rata primaria, se añade a los dispositivos. Los dispositivos se colocan de nuevo en la incubadora para su uso futuro. Los dispositivos ya están listos para la siembra de las neuronas.
Discusión
En este video nos han demostrado cómo hacer y preparar un dispositivo de microfluidos PDMS que utilizamos para las neuronas cultura pulg El dispositivo nos permite obtener una fracción pura axonal separados por microsurcos del compartimiento que contiene una mezcla de cuerpos celulares, dendritas y los axones . Estos dispositivos permiten al investigador para estudiar los efectos de distintos tratamientos, así como ofrecer una plataforma para llevar a cabo una lesión física en los axones y observar los efectos que estos tratamientos tienen sobre las neuronas. El dispositivo también ofrece un nivel de orden a las neuronas de cultivo que ayuda a facilitar los estudios de transporte. Además, los microsurcos, que separan el compartimiento de cultivo de células desde el compartimiento de los axones, permite el aislamiento de fluidos entre los dos compartimentos por lo que es posible tratar a un lado del dispositivo sin afectar al otro lado del dispositivo directamente con el tratamiento. Esta característica permite que el investigador para estudiar los efectos tales como la transducción de señales y el transporte que el resultado del tratamiento.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | Reactivo | Dow Corning | Sylgard 184 con agente de curado. Consulte a Dow Corning para encontrar un distribuidor cercano | |
| Limpiador de plasma | Herramienta | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Medio basal neural | Reactivo | Invitrogen | 21103-049 | El medio basal neural se obtiene de Invitrogen dentro de su línea Gibco de reactivos para cultivo celular. |
| B27 | Reactivo | Invitrogen | 17504-044 | B27 es un suplemento comercial disponible a través de Invitrogen dentro de su línea Gibco de reactivos para cultivo celular. |
| Glutamax | Reactivo | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax está disponible a través de Invitrogen dentro de su línea Gibco de reactivos para cultivo celular. |
| Vidrio cubreobjetos Corning No. 1 | vidrio cubreobjetos | Corning | Corning No. X2935 244 | Disponible a través de Fisher Scientific, número de catálogo de Fisher 12-531D |
| Placa de Petri de 60 mm | Herramienta | Fisher Scientific | 08-757-13A | Se utilizan placas de Petri estériles de poliestireno de 60 mm para alojar el dispositivo unido al vidrio. |
| Tubo BD Falcon de 50 ml | Herramienta | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Disponible a través del número de catálogo de Fisher Scientific 14-959-49A |
| Tubo BD Falcon de 15 ml | Herramienta | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Disponible a través del número de catálogo de Fisher Scientific 14-959-70C |
| Polilisina | Reactivo | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| Elemento nuevo |
Referencias
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
Reimpresiones y permisos
