Cuantificación de los niveles de ARN VIH-1 en plasma y la secuencia única de VIH-1 genomas de las personas con cargas virales por debajo del límite de detección (50-75 copias / ml) es difícil. Aquí se describe cómo extraer y cuantificar el ARN viral en plasma utilizando un ensayo de PCR en tiempo real que mide de manera fiable ARN VIH-1 a partir de 0,3 copias / ml y la forma de amplificar el genoma viral mediante secuenciación del genoma individual, a partir de muestras con cargas virales muy bajas.
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Artículo de método
Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos
En este artículo
Resumen
Resumen
Amplificación de los genes virales y la cuantificación de VIH-1 ARN del VIH-1 las personas infectadas con cargas virales por debajo del límite de detección de los ensayos estándar (por debajo de 50-75 copias / ml) es necesario para comprender mejor la dinámica viral y la interacción virus de acogida en los pacientes que naturalmente, el control de la infección y los que están en tratamiento antirretroviral combinado (TARC).
A continuación se describe la forma de amplificar el genoma viral por la secuenciación del genoma único (el protocolo de SGS) 13, 19 y la forma de cuantificar con precisión ARN VIH-1 en pacientes con baja carga viral (la copia de un solo ensayo (SCA) de protocolo) 12, 20.
El ensayo de una sola copia es un ensayo de PCR en tiempo real con la sensibilidad en función del volumen de plasma que se analizaron. Si un solo genoma del virus se detecta en 7 ml de plasma, entonces el número de copias de ARN se informó de que 0,3 copias / ml. El ensayo tiene una prueba de control interno para la eficiencia de la extracción de RNA, y los controles para la amplificación de ADN o posible contaminación. Muestras de los pacientes se midieron por triplicado.
La secuenciación del genoma de un solo ensayo (SGS), muy utilizado y se considera que no mano de obra 3, 7, 12, 14, 15, es un ensayo de dilución límite, en qué extremo diluida cDNA producto se distribuye en un 96-así plato. De acuerdo con una distribución de Poisson, cuando menos de 1 / 3 de los pozos de dar un producto, hay una probabilidad del 80% de la resultante del producto de PCR de la amplificación es de una sola molécula de ADNc. SGS tiene la ventaja sobre la clonación de no ser sometida a muestreo y de no ser sesgado por PCR a introducir recombinación 19. Sin embargo, el éxito de la amplificación del SCA y SGS dependen de diseño de la cartilla. Ambos ensayos fueron desarrollados para el VIH-1 subtipo B, pero puede ser adaptado para otros subtipos y en otras regiones del genoma de los cebadores cambio, las sondas, y las normas.
Protocolo
1. La extracción de RNA a partir de grandes volúmenes de plasma
Una visión general de la prueba de copia única (SCA) y el único protocolo de secuenciación del genoma (SGS) se proporcionan en las Figuras 1 y 2.
- Para obtener 7 ml de plasma, giro de aproximadamente 14 ml de sangre recogidas en 15 ml de EDTA (no heparina) en tubos de recogida de 2.600 g durante 15 minutos sin freno. Pipeta de plasma (asegurándose de evitar la capa leucocitaria) en tubos de 15 ml.
- Si el ARN se extrae para el ensayo de copia única (SCA), pico del plasma con 30.000 copias del control del virus del sarcoma de Rous virión interna (RCA). El vir....
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Discusión
VIH-1 en individuos infectados en el tratamiento antirretroviral combinado (TARC) o que, naturalmente, el control de la infección tienen cargas virales muy bajas, por lo general alrededor de 1 copia por mililitro de plasma 4, 11, 12, 17, 18. La carga viral en pacientes con un control natural, a menudo fluctúan alrededor de un conjunto individual de 1, 2, 17. La sensibilidad de los ensayos descritos en este documento depende en gran medida el volumen de entrada de plasma. En general, hemos estado tr.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los pacientes que participaron en los numerosos estudios de VIH-1.
JMC fue profesor de Investigación de la Sociedad Americana del Cáncer con el apoyo de la Fundación FM Kirby.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Hexámeros aleatorios (500 ug / ml) | Promega | C118A | |
| Taqman tampón A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNasin (40 U / ul) | Promega | N211B | |
| RT enzima (200 U / ul) | Strategene | 600107-51 | |
| AmpliTaq Gold ADN polimerasa | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | viene con la enzima |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | viene con la enzima |
| 1M Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superíndice III enzima transcriptasa inversa, 200 U / ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superíndice III buffer 10X | Invitrogen | viene con la enzima | |
| TDT 100 mM | Invitrogen | viene con la enzima | |
| Platinum Taq ADN polimerasa de alta fidelidad de 5 U / ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X de alta fidelidad PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | viene con la enzima |
| Proteinasa K 20 mg / ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinio 6M solución de tiocianato | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glucógeno 20 mg / ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Etanol al 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Agua de grado molecular | Gibco / Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol cada uno) | Bioline | BIO-39025 |
| Nombre del Euipment | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de centrífuga fácil Sello (16x73mm) | Seaton Científico | 6041 | |
| Blanco Delrin coronas | Seaton Científico | 4020 | Tapones para los tubos de sello sencillo |
| Gradilla para Optiseal Bell-Tubos de tapón, 8.9 ml | Beckman | 361642 | |
| Destornillador hexagonal de ½ apertura inc | Seaton Científico | 4013 | |
| tapa tupe la eliminación | Seaton Científico | 4014 | |
| 5 pipetas serológicas ml | Costar | 4051 | |
| PIPETBOY | cualquier | ||
| 15 ml pipetas de transferencia | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5,8 ml pipetas de transferencia Dispossable, punta fina | VWR | 14670-329 | |
| 15 tubos de centrifugación ml | Halcón | ||
| 1 ml tubos de centrifugación | cualquier | ||
| Tris buffer salino tabletas | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifugación y el rotor | Sorval | 90SE y T-1270- | |
| 96 y placas de PCR | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml depósito de reactivos | Costar | 4870 | |
| Microamperios óptica de 96 pocillos de la placa de reacción | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Placa óptica cubre | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp almohadilla de compresión óptica | Applied Biosystems | 4312639 | |
| MicrosealUna película | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml tubos de centrifugación | Cualquier | ||
| 1% en geles de agarosa (E-gel, Invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA colección de tubos de cualquier marca
Referencias
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F.
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Reimpresiones y permisos
