Hemos desarrollado una base de colágeno en el ensayo in vitro, que promueve la proliferación y la invasión de las muestras de todos los subtipos de cáncer de mama. Tomografía óptica de proyección, una técnica de tres dimensiones se utilizó la microscopía para visualizar y cuantificar la expansión del tumor. Este ensayo puede ser utilizado para cuantificar la respuesta al fármaco de las muestras tumorales individuales.
Artículo de método
A largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección
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Resumen
Resumen
El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad en el mundo occidental. Es bien sabido que la propagación del cáncer de mama, en primer lugar a nivel local y distal más tarde, es un factor importante en el pronóstico del paciente. Sistemas experimentales de cáncer de mama se basan en las líneas celulares derivadas de tumores por lo general primario o derrames pleurales. Dos grandes obstáculos dificultan esta investigación: (i) algunos conocidos subtipos de cáncer de mama (tumores pronóstico notablemente pobre luminal B) no están representadas en colecciones de la línea actual, (ii) la influencia del microambiente tumoral no se suele tener en cuenta.
Se demuestra una técnica de cultivo primario especímenes de cáncer de mama de todos los subtipos. Esto se logra mediante el uso de tres dimensiones (3D) de los sistemas de cultivo en el que pequeños trozos de tumor están incrustados en el colágeno de rata suave que amortigua. El plazo de 2-3 semanas, las células tumorales se propagan en el colágeno y la forma de diversas estructuras similares a los observados en tumours1 humanos. Adipocitos viables, las células epiteliales y fibroblastos en el núcleo original se hicieron evidentes en la histología. Células epiteliales malignos con morfología escamoide se demostró en la invasión de colágeno circundante. Pleomorfismo nuclear fue evidente dentro de estas células, junto con figuras de mitosis y cuerpos apoptóticos.
Hemos empleado la tomografía óptica de proyección (OPT), una tecnología de imagen 3D, con el fin de cuantificar el grado de diseminación del tumor en la cultura. Hemos utilizado OPT para medir el volumen de la masa de la cultura del tumor, un parámetro de una medida rutinaria en el tratamiento neo-adyuvante de pacientes con cáncer de mama para evaluar la respuesta al tratamiento farmacológico.
Aquí, se presenta una oportunidad para los tumores de mama humanos sin cultura sub-tipo de prejuicios y cuantificar la propagación de los ex vivo. Este método podría ser utilizado en el futuro para cuantificar la sensibilidad de la droga en el tumor original. Esto puede proporcionar un modelo más predictivo que las líneas celulares actualmente en uso.
Protocolo
1. La extracción de colágeno de la cola de rata
- Lugar fresco congelado colas de ratas en el 70% de etanol.
- Deglove la piel que recubre los tendones con un bisturí la exposición.
- Franja de los tendones de distancia de la cola y el lugar en el 70% de etanol para esterilizar.
- Pesar los tendones recogida y traslado al ácido acético (tendón de 1g a 250 ml de ácido acético 0,5 M). Mezclar durante 48 horas de grabación a 4 ° C.
- Centrifugar la mezcla de ácido tendón / acético a 10.000 g durante 30 minutos y desechar el sedimento.
- Añadir un volumen igual de 10% (w / v) NaCl al sobrenadante y dejar la mezcla reposar durante la noche a 4 ° C.
- Recoger la capa rica en colágeno, inferior insoluble y centrifugado para 30 minutos más de 10.000 g.
- Resuspender el material rico en colágeno en ácido acético 0,25 M a 4 ° C y dializa contra 1:1000 ácido acético a 4 ° C durante 3 días, cambiando el tampón de diálisis dos veces al día.
- Además esterilizar la solución de colágeno por centrifugación (20.000 g durante 2 h) y se almacenan a 4 ° C.
- Diluir colágeno según sea necesario con la adición de ácido acético 1:1000 estéril a una concentración de 1mg/ml de valores.
2. 3D Creación de ensayo
El ensayo 3D se basa en un ensayo de línea celular, publicó anteriormente con el 2.
- Múltiples biopsias centrales se recolectan de consentir los pacientes en el momento de la resección curativa quirúrgica para el cáncer de mama invasivo.
- A simple vista, se dividen los núcleos con un bisturí en 1 mm 3 fragmentos. Recorte y deseche la grasa macroscópicamente diferentes.
- Sumerja los fragmentos en los medios de comunicación MEGM completa. El tejido se pueden almacenar en este estado durante un máximo de 1 hora.
- Para crear el gel de colágeno, la mezcla de hielo de colágeno de cola de rata 1mg/ml, 1:1000 ácido acético filtrada, 10x DMEM/F12 y NaOH 0.22M en una proporción de 3:5:1:1 para crear una concentración de colágeno final de 0,3 mg / ml.
- Inyectar 1,2 ml de la mezcla de colágeno en los distintos pozos de una placa de 24 pocillos y el lugar en una incubadora a 37 ° C durante 10 minutos para iniciar la gelificación.
- Después de 10 minutos, retire el plato y 24 de la incubadora. Coloque los trozos de tumor en el colágeno de gelificación y suavemente empuje hacia el centro del gel usando una 10μl punta de la pipeta. Devolver la placa y 24 a la incubadora durante 1 hora.
- Para los tumores ER +, suplemento MEGM los medios de comunicación completa con β-estradiol a una concentración de 3.2x10 -10 M. Una vez que los ensayos de gel tienen gel durante 1 hora, introducir con cuidado 1,2 ml de los medios de comunicación complementado en cada pozo. El final de β-estradiol concentración en el ensayo se equilibriate a 1.6x10 -10 M para recapitular los niveles fisiológicos de estrógeno que se encuentra en el tejido mamario 3.
- Ejecutar una punta de pipeta 10μl alrededor del borde interior de cada bien, la liberación de cada gel circunferencialmente, permitiendo así que cada gel a flotar libremente en los medios de comunicación. Devolver la placa y 24 a la incubadora.
- Intercambio complementado los medios de comunicación dos veces por semana hasta la finalización del experimento. Terminar el experimento mediante la eliminación de los medios de comunicación y la adición de un fijador de formol.
3. La tinción de anticuerpos del ensayo en la preparación de la tomografía óptica de proyección
Hemos adoptado un método previamente publicado por 4 todo tinción de las muestras.
- Lávese las muestras fijadas en formol durante 30 minutos en PBS. Deshidratar los geles paso a paso en metanol diluido en PBS que contenía 0,05% de Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% y el 100% de ≥ 15 minutos en cada paso.
- Incubar el tejido recién preparada MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 en una proporción de 02:01:03 (15% v / v de H 2 O 2) a temperatura ambiente durante 24 horas para saciar la autofluorescencia.
- Lávese las muestras dos veces durante 30 minutos en metanol. Congelar las muestras a -80 ° C cinco veces por lo menos 1 hora cada vez y de nuevo a temperatura ambiente (TA) para asegurarse de que los antígenos en las partes más profundas de los tejidos se vuelven accesibles.
- Rehidratar los tejidos de nuevo a 0,05% PBST con metanol como disolvente (33%, 66% y 100% para 15 minutos en cada paso).
- Bloquear el tejido en solución de bloqueo (10% de suero en el 0,05% PBST) para las 24 horas.
- Incubar el tejido con el anticuerpo primario para identificar el contenido del epitelio, de conejo anti-citoqueratina a una concentración de 1:500 diluido en 1,5 ml de solución de bloqueo con 5% de DMSO durante 48 horas de grabación.
- Lávese las muestras de cuatro veces con PBST 0,05% durante 30 minutos cada uno.
- Incubar el tejido con anticuerpos fluorescentes secundaria (1:100 de cabra anti-conejo Alexa555), diluida en solución de 1,5 ml de bloqueo que contienen un 5% de DMSO durante 48 horas de grabación.
- Lavado de las muestras una vez más con PBST 0,05% cuatro veces durante 30 minutos cada uno.
4. Tomografía óptica de proyección
Tomografía por proyección óptica es una técnica de microscopía desarrolladas previamente para producir imágenes de alta resolución en 3D de las muestras biológicas fluorescentes con un espesor de hasta 15 milímetros 5.
- Montar el sgel sostenido de bajo punto de fusión al 1% de agarosa y se deshidratan en el 100% de metanol durante 24 horas. Clara muestra de la solución en Babb (1:2 alcohol bencílico, benzoato de bencilo) para 48 horas de grabación y escanear con el escáner OPT 3001M (Bioptonics).
- Tanto el objetivo como la autofluorescencia se capturaron con el conjunto de filtros Cy3 (excitador 545nm/30 nm, emisor 610/75 nm) y GFP1 conjunto de filtros (excitación 425nm/40 nm, emisor LP475 nm), respectivamente.
5. La reconstrucción y cuantificación 3D
- El conjunto de proyecciones angular adquirida por OPT puede ser reconstruido utilizando NRecon software (SkyScan) para crear una serie de cortes de sección transversal a través de la invasión de ensayo. Este software está disponible para descargar de forma gratuita en http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
- Analizar los datos reconstruidos utilizando el software Volocity (PerkinElmer). Software de demostración gratuita está disponible para su descarga en http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
- Con el fin de cuantificar el volumen epiteliales mediante tinción con citoqueratina, establecer un umbral voxel intensidad mínima para reducir la interferencia de la fluorescencia de fondo en el canal de destino. Hemos definido este umbral empíricamente en 9000 au Usando una lista de parámetros disponibles en la aplicación de medición, hemos cuantificado el volumen de epitelio en continuidad con el núcleo original (demarcada en el canal de autofluorescentes). Esto nos permitió cuantificar los volúmenes de derivación epitelial entre diferentes las muestras tumorales.
6. Los resultados representativos:
Durante el desarrollo de la prueba, un total de cáncer de mama 52 muestras de biopsia con una amplia gama de histopatología se han utilizado. De estos <10% (5 / 52) no ha facilitado al menos un ensayo de invasión viable. El fracaso del ensayo se debe a bacterias o supra-infección o material insuficiente la biopsia del tumor. Por lo tanto la aplicación de la prueba no se limita a un subtipo específico de cáncer de mama.
Ensayos típicos (figura 1) fija después de 20 días en la cultura de colágeno y posteriormente teñidos para citoqueratina. Volocity software es capaz de reconocer tanto la mayor parte del epitelio continuo con el núcleo original y los grupos separados de células invasoras y cuantificar cada volumen por separado.
Figura 1. Invasión ensayos posteriores a la fijación y cuantificación. El ensayo apoya las muestras obtenidas de múltiples subtipos de cáncer de mama: a) ER + b) HER2 + y c) ER-
Discusión
A base de colágeno ensayos para estudiar el comportamiento de líneas celulares de cáncer son ampliamente utilizados 6,7,8. Sin embargo, estos ensayos no han reflejado en su totalidad la complejidad del tumor y su entorno. En este estudio, mostramos que los materiales de cáncer de mama humano puede ser utilizado de una manera similar, ex vivo. Además, OPT es una herramienta útil para caracterizar la expansión 3D de cáncer de mama. Se encontró que la principal limitación de esta técnica es la disponibilidad de materiales tumor (una sola biopsia con aguja gruesa es suficiente para 4-6 ensayos). Otro factor limitante es que la invasión estructural sólo se produce en aproximadamente el 40% de los ensayos. Para superar esto, que regularmente agregar cualquier tratamiento deseado alrededor del día 7 a todos los ensayos con un crecimiento visible.
El uso de los territorios palestinos ocupados podría ampliarse en el futuro para detectar también cambios masivos, ex vivo, que resulta del tratamiento de drogas. Esto a su vez podría facilitar el tratamiento del cáncer más individualizada, independiente de los modelos animales. Actualmente estamos explorando la respuesta de los tumores RE + al tamoxifeno ex vivo.
Divulgaciones
SEW y JF son empleados por MRC Technology, que está comercializando Bioptonics escáneres OPT. Otros autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Damos las gracias a Lorna Renshaw (Unidad de Mama de Edimburgo) por su inestimable ayuda en la obtención de muestras clínicas.
El uso de material tumoral fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Lothian (08/S1101/41) y obtuvo bajo los auspicios de Medicina Experimental del Cáncer Programa de Centros (Edimburgo).
Este trabajo es apoyado por el Consejo Escocés de Financiación. ADL es una señorita Margaret Butters Reekie compañeros de confianza clínica.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Catálogo N º | |
| Completa MEGM | Lonza | CC-3150 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8900 10X1L | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | |
| Conejo anti-citoqueratina | Dako | Z0622 | |
| Cabra anti-conejo Alexa555 | Invitrogen | A21422 |
Todos los reactivos otra norma se obtuvieron de Sigma-Aldrich
Referencias
- Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology. 57, 171-192 (2010).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).
- Dabrosin, C. Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle. J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
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- Katz, E. A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk. Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
Reimpresiones y permisos
