Debido a la simplicidad de la cirugía y el resultado del comportamiento robusto, constricción crónica del nervio ciático es uno de los modelos animales de pre-eminentes de dolor neuropático. Dentro de las 24 horas siguientes a la cirugía, la hipersensibilidad del dolor se establece y se puede medir cuantitativamente utilizando una de von Frey aesthesiometer (ensayos mecánicos) y el medidor de la analgesia plantar (ensayo térmico).
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La constricción crónica del nervio ciático y pruebas de hipersensibilidad dolor en ratas
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Resumen
Resumen
El dolor neuropático crónico, como resultado del daño al sistema nervioso central o periférico, es una enfermedad prevalente y debilitante, que afecta a 18.7% de la población de 1,2. Los síntomas incluyen espontánea (hormigueo, ardor, una descarga eléctrica al igual que) el dolor, disestesias, parestesias, alodinia (dolor debido a que normalmente no dolorosos estímulos) y la hiperalgesia (una mayor respuesta a estímulos dolorosos). Los síntomas sensoriales son co-mórbida con discapacidades de comportamiento, tales como el insomnio y la depresión. Para estudiar el dolor neuropático crónico varios modelos animales que simulan lesiones de nervios periféricos han sido desarrollados, uno de los más utilizados es Bennett y (1988) lesión unilateral del nervio ciático Xie constricción crónica (ICC) 3 (Figura 1). Aquí presentamos un método para realizar pruebas de hipersensibilidad CCI y el dolor.
ICC se realiza bajo anestesia, con el nervio ciático, por un lado expuesto por decisiones comoincisión de los familiares, y el corte a través del tejido conectivo entre los glúteos y los músculos superficial de bíceps femoral. Cuatro ligaduras catgut crómico se atan libremente alrededor del nervio ciático a intervalos de 1 mm, para ocluir solo, pero no detener el flujo de sangre epineural. La herida se cierra con suturas en el músculo y grapas en la piel. El animal se deja entonces recuperarse de la cirugía durante 24 horas antes de la prueba dolor hipersensibilidad comienza.
Para las pruebas de comportamiento, las ratas se colocan en el aparato de ensayo y se les permite habituar al procedimiento de prueba. El área de pruebas es la mitad de la superficie plantar de la pata trasera (Figura 2), que cae dentro de la distribución del nervio ciático. Umbral de retirada mecánica se evaluó mediante la estimulación mecánica ambas patas traseras lesionados y no lesionados con una dinámica electrónica plantar von Frey aesthesiometer o manual de von Frey pelos 4. El umbral de retirada mecánica es la presión máxima ejercida(En gramos) que desencadena la retirada de la pata. Para la medición de latencia térmica retirada, primero descrito por Hargreaves et al (1988), la pata trasera está expuesto a un haz de calor radiante a través de una superficie de vidrio transparente con un plantar metros analgesia 5,6. La latencia de retirada de los estímulos de calor se registra como el tiempo de retirada de la pata en las dos patas traseras lesionados y no lesionados. Tras ICC, umbral de retirada mecánica, así como la retirada de latencia térmica en la pata lesionada son significativamente reducido, en comparación con las mediciones de referencia y la pata no lesionado (Figura 3). El ICC modelo de lesión del nervio periférico junto con las pruebas de hipersensibilidad dolor proporciona un sistema modelo para investigar la eficacia de los agentes terapéuticos potenciales para modificar el dolor neuropático crónico. En nuestro laboratorio, utilizamos ICC junto con la sensibilidad térmica y mecánica de las patas traseras para investigar el papel de las interacciones neuro-inmune en la patogénesisy el tratamiento del dolor neuropático.
Protocolo
1. La constricción del nervio ciático crónica
Técnicas asépticas debe ser utilizado para el procedimiento quirúrgico. Desinfectar la superficie de trabajo quirúrgico con 70% de etanol y preparar los instrumentos estériles por adelantado (por ejemplo, tijeras, pinzas finas y retractores), gasas, grapas y los hisopos en autoclave. Para múltiples cirugías, limpieza y re-esterilizar instrumentos con etanol al 70% o un esterilizador seco cordón entre las ratas. Una máscara quirúrgica, sombrero de pelo y guantes estériles deben ser usados.
Para la constricción del nervio, preparar la sutura intestino crómico cortándolo en trozos pequeños de aproximadamente 3 cm de longitud sumergido en solución salina estéril, para evitar el secado. Para cerrar la herida, uso de suturas estériles disponibles en el mercado de la seda.
- Anestesiar la rata en una cámara de inducción con isoflurano en un 5% de O 2, y luego entregar isoflurano 2% de O 2 a través de un encargo a la mascarilla, y vigilar el animal anestesiado durante el procedimiento. Comunes anestésicos alternativos son inhalados halotano o sodio pentobarbital intraperitoneal. La ketamina, como un antagonista del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), debe evitarse ya que estos receptores son importantes en el desarrollo del dolor neuropático.
- Afeitado de la pierna izquierda trasera de la rata. Luego, coloque el animal en una rejilla de calefacción termo-regulado a 37 ° C y aplique una pomada oftálmica lubricante para los ojos.
- Esterilizar la zona afeitada con tres aplicaciones alternas de 70% de alcohol isopropílico y solución de yodo.
- Con la rata acostada en su pecho / tórax, eleve la pierna trasera izquierda y mantener en posición con el Femor a 90 ° de la columna vertebral utilizando cinta adhesiva en el pie.
- Hacer una incisión en la piel paralelo, pero 3-4 mm por debajo de la Femor, y libre de la piel del músculo que rodea la incisión cortando a través del tejido conectivo.
- Usando tijeras de punta roma, cortados a través del tejido conectivo entre los glúteos y bíceps superficial de losfemoris músculos.
- Utilice un retractor para ampliar la brecha entre los dos músculos, lo que permite una clara visualización del nervio ciático.
- Utilizando curvas de punta roma pinzas y tijeras microempresas, con suavidad libre de aproximadamente 10 mm del nervio ciático (proximal a la trifurcación ciática) del tejido conectivo circundante.
- Bajo el microscopio y una buena fuente de luz, atar cuatro ligamentos (crómico intestino 4.0, Ethicon, EE.UU.) con un nudo doble, 1 mm de distancia, próximo a la trifurcación del nervio ciático. Para cada ligadura, comenzar con una sola vuelta suelta, y sujete los dos extremos cercanos al bucle y apretar hasta que el bucle está apenas ajustado y la ligadura no se desliza a lo largo del nervio. Para mantener el bucle en su posición correcta, colocar un segundo bucle en la parte superior de la primera para completar el nudo. Por último, cortar los cabos sueltos de la ligadura a alrededor de 1 mm. La constricción del nervio debe ser mínima, y se detuvo de inmediato si una contracción breve se observa, para evitar la detención de THe flujo sanguíneo epineural. Si se aprieta demasiado las ligaduras conduce a axotomía y autotomía (automutilación), ambos efectos secundarios no deseados que se opongan a las pruebas de hipersensibilidad con éxito el dolor.
- Use suturas (5,0 Mersilk, Ethicon) para cerrar la capa muscular y grapas (autoclip, 9 mm) para sujetar la piel. A continuación, utilice una solución de yodo (Riodine) para esterilizar la herida.
- Tenga en cuenta que la rata de cerca durante el período de recuperación de la anestesia, y permite que se recupere en una jaula por separado con ropa de cama plana de papel (no en la ropa de cama de la cría de animales de serie), con el fin de evitar que el animal está inconsciente asfixia.
Antes de dar cualquier investigación de la analgesia postoperatoria debe considerar el hecho de que esto puede interferir con las pruebas de dolor de hipersensibilidad. De hecho, hay evidencia de que la aplicación local de anestésico, lidocaína, en el momento de la lesión puede alterar el desarrollo del dolor neuropático, y disminuir el grado de hiperalgesia en las semanas anteriores 7. Para una mayor discusión sobre este mAtter ver la revisión de Bennett et al 8.
2. Las mediciones de conductas de dolor
- La manipulación diaria de las ratas durante varios días antes de iniciar el experimento, se recomienda con el fin de acostumbrar a las ratas a su manejador, reducir el estrés y el riesgo de morder.
- Antes de las pruebas de comportamiento, las ratas que se habituaron al procedimiento de prueba y el recinto para animales. El entorno de prueba debe mantenerse tranquila y bien controlada, con una temperatura constante y los niveles de humedad, y lleva a cabo a la misma hora del día de cada sesión de pruebas.
- El dolor de pruebas de hipersensibilidad se debe realizar varias veces antes de ICC (basal) y en diferentes puntos temporales después de ICC, según se desee.
3. Umbral de retirada mecánica
- En el día de la prueba, las ratas lugar en la jaula con piso de malla de pruebas elevada 15-30 minutos antes de medir los umbrales de retirada, permitiendo jaula exploración y Grooming actividades de cese y las ratas se vuelvan más frágiles y estacionarios.
- Utilizando una dinámica plantar von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Italia), la posición de la unidad de estimulador táctil con el filamento directamente debajo de la superficie a mediados de plantar de la pata trasera, evitando la malla de metal, y pulse la tecla de inicio. Esto levanta el filamento para estimular mecánicamente la superficie plantar de la pata trasera con una fuerza cada vez mayor.
Manual von Frey pelos son una serie de filamentos de diámetro creciente que están calibradas para inducir una fuerza específica cuando se aplica a la piel. Se pueden utilizar como una alternativa a una electrónica dinámica plantar aesthesiometer von Frey para la medición de umbral retirada de la pata, como se ha descrito previamente 4. También hay varios fabricantes alternativos de electrónica de von Frey aesthesiometers (por ejemplo, CITI, EE.UU. y Somedic, Suecia).
- Registre el umbral de retirada mecánica de hindpa tanto lesionados y no lesionadosws, en un orden alternado. Este dispositivo se aplica presión a la pata y sobre la reacción de abstinencia, el sistema automáticamente registra y muestra la fuerza máxima aplicada (en gramos). Si una respuesta ambigua se produce (es decir, en el caso de deambulación o aseo), repetir el estímulo y registrar el umbral de nuevo. Lamer o temblor de la pata trasera después de la estimulación es un signo de comportamiento asociado con el dolor.
- Repita el estímulo mecánico 3 veces con un intervalo de unos 5 minutos entre los estímulos, los umbrales de grabar, y luego calcular la media de los umbrales de retirada de la pata.
4. Latencia de retirada térmica
El infrarrojo (IR) la intensidad del calor de la prueba plantar instrumento debe ser ajustado antes de iniciar el experimento. En nuestro laboratorio, ajustar la intensidad de IR para dar una latencia de retirada de la pata media de unos 10 segundos en ratas ingenuas, y nos pusimos en la latencia de corte de 20 segundos para evitar daños del tejidoedad en caso de no retirar una pata.
- En el día de la prueba, las ratas lugar en la jaula de vidrio pruebas piso de 15-30 minutos antes de medir la latencia, permitiendo exploración jaula y acicalamiento actividades de cesar y ratas para convertirse relajado y estacionario.
- El uso de un instrumento de la analgesia térmica plantar (Ugo Basile, Italia), la posición de la fuente de luz infrarroja directamente debajo de la superficie a mediados de plantar de la pata trasera, y pulse la tecla de inicio. Esto expone la superficie plantar de la pata trasera de un haz de calor radiante a través de una superficie de vidrio transparente. También hay fabricantes alternativos de instrumentos térmicos analgesia plantares (por ejemplo, CITI, EE.UU. y Stoelting, EE.UU.).
- Registre la latencia de retirada de las patas traseras, tanto lesionados y no lesionados, en un orden alternado. Este dispositivo registra automáticamente el tiempo necesario (en segundos) desde el inicio del estímulo térmico para retirada de la pata de la fuente de calor. Si una respuesta ambigua se produce (es decir, en el caso de deambulaciónción o de aseo), repita el estímulo y registrar la latencia de nuevo. Lamer o temblor de la pata trasera después de la estimulación es un signo de comportamiento asociado con el dolor.
- Repita el estímulo de calor por lo menos 3 veces con un intervalo de unos 5 minutos entre los estímulos, las latencias de grabar, y luego calcular la media de las latencias de retirada de la pata.
4. Los resultados representativos
Un ejemplo de umbral de retirada mecánica y térmica de latencia de retirada en las patas ipsilaterales (lesionado) y contralateral (sano) de ratas Wistar se muestra antes (basal) y 2-12 días después de la CCI en la figura 3A, y la Figura 3B. A partir de estas figuras puede verse que CCI provoca una reducción significativa en ambos umbrales de retirada mecánicas y térmicas latencias de retirada de la pata trasera ipsolateral, indicando la presencia de hipersensibilidad dolor mecánico y térmico, ambas características del dolor crónico neuropático .
Figura 1. Un esquemático que ilustra el posicionamiento de las ligaduras en el modelo de CCI. Este modelo animal de dolor neuropático implica la colocación de cuatro sueltas del intestino crómico-ligaduras en el nervio ciático, a nivel de la mitad del muslo. Es el resultado de que sólo daña una porción de las fibras aferentes que van a la hipersensibilidad dolor de pie y subsiguientes de la pata trasera.
Figura 2. Diagrama de la zona de pata trasera utilizado para la prueba de dolor. La superficie a mediados de plantar justo por detrás de las almohadillas, como se indica por el círculo de puntos de color rojo, se utiliza para la prueba de dolor. Esta área está inervada principalmente por las ramas terminales del nervio ciático. El talón y las almohadillas se deben evitar debido a la sensibilidad diferencial de la piel.
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Figura 3. El dolor de hipersensibilidad después de la constricción crónica del nervio ciático en ratas. Después de ICC, hay una reducción significativa en el umbral de retirada de la pata a estímulos mecánicos (A) y la latencia retirada de la pata a los estímulos térmicos (B) en el lesionado (ipsilateral) en comparación con la pata trasera no lesionado (contralateral) pata trasera (P <0,01 medidas repetidas 2 -way ANOVA). Los datos muestran la media ± SEM, n = 7 ratas Wistar.
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Discusión
CCI es un modelo ampliamente utilizado lesión del nervio periférico del dolor neuropático crónico. Es relativamente fácil de realizar, y produce hipersensibilidad dolor robusta y estable durante al menos un mes después de la lesión. Después de CCI, las ratas muestran una postura anormal de la pata trasera heridos (dedos de los pies unidos y flexión plantar y eversión de la pata), así como repetidos temblores, vigilancia y lamido de la pata trasera lesionado sugiere la presencia de dolor espontáneo 9. Además d...
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Divulgaciones
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el Comité de Ética de la Universidad de New South Wales, Australia, y siguieron las directrices emitidas por la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la descripción original de la ICC modelo de Bennett y Xie (1988).
Este trabajo fue parcialmente financiado por subvenciones de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (ID # 568637) y la Oficina de NSW para la Ciencia y la Investigación Médica a la hora GMT.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Crómico intestino | Ethicon | T-211 | Espesor de 4-0 |
| El isoflurano | Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW | n / a | |
| Mersilk | Ethicon | W-580 | 5-0 de espesor |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427631 | 9 mm de acero inoxidable |
| Riodine | Orión | R1000802F | 1% w / v yodo |
| Instrumento de la analgesia térmica plantar | Ugo Basile | 37370 | |
| Aesthesiometer plantar dinámica | Ugo Basile | 37400 |
Referencias
- Bouhassira, D., Lanteri-Minet, M., Attal, N., Laurent, B., Touboul, C. Prevalence of chronic pain with neuropathic characteristics in the general population. Pain. 136, 380-387 (2008).
- Toth, C., Lander, J., Wiebe, S. The prevalence and impact of chronic pain with neuropathic pain symptoms in the general population. Pain Med. 10, 918-929 (2009).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32, 77-88 (1988).
- Yeomans, D. C., Proudfit, H. K. Characterization of the foot withdrawal response to noxious radiant heat in the rat. Pain. 59, 85-94 (1994).
- Dougherty, P. M., Garrison, C. J., Carlton, S. M. Differential influence of local anesthetic upon two models of experimentally induced peripheral mononeuropathy in the rat. Brain Research. 570, 109-115 (1992).
- Bennett, G. J., Chung, J. M., Honore, M., Seltzer, Z. Models of neuropathic pain in the rat. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, (2003).
- Attal, N., Jazat, F., Kayser, V., Guilbaud, G. Further evidence for 'pain-related' behaviours in a model of unilateral peripheral mononeuropathy. Pain. 41, 235-251 (1990).
- Hu, B., Doods, H., Treede, R. -D., Ceci, A. Depression-like behaviour in rats with mononeuropathy is reduced by the CB2-selective agonist GW405833. Pain. 143, 206-212 (2009).
- Jesse, C., Wilhelm, E., Nogueira, C. Depression-like behavior and mechanical allodynia are reduced by bis selenide treatment in mice with chronic constriction injury: a comparison with fluoxetine, amitriptyline, and bupropion. Psychopharmacology. 212, 513-522 (2010).
- Monassi, C. R., Bandler, R., Keay, K. A. A subpopulation of rats show social and sleep-waking changes typical of chronic neuropathic pain following peripheral nerve injury. Eur. J. Neurosci. 17, 1907-1920 (2003).
- Roeska, K., Doods, H., Arndt, K., Treede, R. D., Ceci, A. Anxiety-like behaviour in rats with mononeuropathy is reduced by the analgesic drugs morphine and gabapentin. Pain. 139, 349-357 (2008).
- Kontinen, V. K., Kauppila, T., Paananen, S., Pertovaara, A., Kalso, E. Behavioural measures of depression and anxiety in rats with spinal nerve ligation-induced neuropathy. Pain. 80, 341-346 (1999).
- Urban, R., Scherrer, G., Goulding, E. H., Tecott, L. H., Basbaum, A. I. Behavioral indices of ongoing pain are largely unchanged in male mice with tissue or nerve injury-induced mechanical hypersensitivity. Pain. 152, 990-1000 (2011).
- Myers, R. R., Yamamoto, T., Yaksh, T. L., Powell, H. C. The role of focal nerve ischemia and Wallerian degeneration in peripheral nerve injury producing hyperesthesia. Anesthesiology. 78, 308-316 (1993).
- Grace, P. M., Hutchinson, M. R., Manavis, J., Somogyi, A. A., Rolan, P. E. A novel animal model of graded neuropathic pain: utility to investigate mechanisms of population heterogeneity. J. Neurosci. Methods. 193, 47-53 (2010).
- Kajander, K. C., Pollock, C. H., Berg, H. Evaluation of hindpaw position in rats during chronic constriction injury (CCI) produced with different suture materials. Somatosens Mot. Res. 13, 95-101 (1996).
- Xu, J., Pollock, C. H., Kajander, K. C. Chromic gut suture reduces calcitonin-gene-related peptide and substance P levels in the spinal cord following chronic constriction injury in the rat. Pain. 64, 503-509 (1996).
- Sommer, C., Schafers, M. Painful mononeuropathy in C57BL/Wld mice with delayed wallerian degeneration: differential effects of cytokine production and nerve regeneration on thermal and mechanical hypersensitivity. Brain. Res. 784, 154-162 (1998).
- Walczak, J. S., Beaulieu, P. Comparison of three models of neuropathic pain in mice using a new method to assess cold allodynia: the double plate technique. Neurosci. Lett. 399, 240-244 (2006).
- Maves, T. J., Pechman, P. S., Gebhart, G. F., Meller, S. T. Possible chemical contribution from chromic gut sutures produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 54, 57-69 (1993).
- Tall, J. M., Stuesse, S. L., Cruce, W. L., Crisp, T. Gender and the behavioral manifestations of neuropathic pain. Pharmacol Biochem. Behav. 68, 99-104 (2001).
- Chung, J. M., Choi, Y., Yoon, Y. W., Na, H. S. Effects of age on behavioral signs of neuropathic pain in an experimental rat model. Neurosci. Lett. 183, 54-57 (1995).
- Tanck, E. N., Kroin, J. S., McCarthy, R. J., Penn, R. D., Ivankovich, A. D. Effects of age and size on development of allodynia in a chronic pain model produced by sciatic nerve ligation in rats. Pain. 51, 313-316 (1992).
- Shir, Y., Sheth, R., Campbell, J. N., Raja, S. N., Seltzer, Z. Soy-containing diet suppresses chronic neuropathic sensory disorders in rats. Anesth. Analg. 92, 1029-1034 (2001).
- Yoon, Y. W., Lee, D. H., Lee, B. H., Chung, K., Chung, J. M. Different strains and substrains of rats show different levels of neuropathic pain behaviors. Experimental Brain Research. 129, 167-171 (1999).
- Mogil, J. S., Davis, K. D., Derbyshire, S. W. The necessity of animal models in pain research. Pain. 151, 12-17 (2010).
- Mogil, J. S. Animal models of pain: progress and challenges. Nat. Rev. Neurosci. 10, 283-294 (2009).
- Langford, D. J. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat. Methods. 7, 447-449 (2010).
- Austin, P. J., Moalem-Taylor, G. The neuro-immune balance in neuropathic pain: involvement of inflammatory immune cells, immune-like glial cells and cytokines. J. Neuroimmunol. 229, 26-50 (2010).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
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