Digital microscopía intravital epifluorescencia de vénulas post-capilares de la microcirculación cremastérico es un método conveniente para obtener información sobre la interacción leucocito-endotelio En vivo En la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) de músculo estriado. Estamos aquí proporcionar un protocolo detallado para realizar con seguridad la técnica y discutir sus aplicaciones y limitaciones.
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Artículo de método
En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata
En este artículo
Resumen
Resumen
La isquemia-reperfusión (IRI) ha sido implicado en una gran variedad de condiciones patológicas tales como accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, isquemia intestinal, así como seguir. Trasplante y cirugía cardiovascular una reperfusión del tejido previamente isquémico, aunque es esencial para la prevención de la irreversible las lesiones de tejidos, provoca inflamación excesiva del tejido afectado. Adyacente a la producción de especies reactivas del oxígeno, la activación del sistema del complemento y el aumento de la permeabilidad microvascular, la activación de los leucocitos es uno de los principales actores en la cascada patológica de la lesión tisular inflamatoria durante la reperfusión. 2, 3 activación de leucocitos es un proceso de varias fases que consiste de material, la adhesión firme y la transmigración y está mediada por una compleja interacción entre las moléculas de adhesión en respuesta a factores quimiotácticos como factores del complemento, quimiocinas, o el factor activador de plaquetas. 4 <p class = "jove_content"> Mientras rodadura de leucocitos en las vénulas postcapilares está predominantemente mediado por la interacción de selectinas 5 con sus ligandos de venta libre, la adhesión firme de los leucocitos al endotelio es selectina-controlado a través de la unión a las moléculas de adhesión intercelular (ICAM) y celulares vasculares las moléculas de adhesión (VCAM). 6, 7
Estándar de oro para el estudio in vivo de leucocitos del endotelio interacción es la técnica de microscopía intravital, describió por primera vez en 1968. 8
Aunque varios modelos de IRI (isquemia-reperfusión) se han descrito para diversos órganos, 9-12 sólo unos pocos son adecuadas para la visualización directa de reclutamiento de leucocitos en el lecho microvascular en un alto nivel de calidad de imagen. 8
Estamos aquí, promover el digital de microscopía intravital epifluorescencia de la vénula postcapilares en la microcirculación cremastéricode la rata 13 como un método práctico para analizar cualitativa y cuantitativamente el reclutamiento de leucocitos por el IRI de investigación en el tejido muscular estriado y proporcionar un manual detallado para llevar a cabo la técnica. Nos ilustran aún más las trampas más comunes y proporcionar consejos útiles que deberían permitir al lector a apreciar de verdad, y con seguridad realizar el método.
En un paso a paso el protocolo que describen cómo empezar con anestesia respiración controlada bajo vigilancia suficiente para evitar que el animal anestesiado con firmeza durante períodos más largos de tiempo. A continuación, describen la preparación cremastérico como una delgada lámina plana para la resolución óptica excepcional y proporcionar un protocolo para obtener imágenes de leucocitos en el IRI que ha sido bien establecido en nuestros laboratorios.
Protocolo
1. Anestesia y Vigilancia
- Apropiadas éticos nacionales e institucionales deben estar en su lugar antes de realizar experimentos con animales. Tras la aprobación de los comités de ética de anestesiar ratas macho Sprague Dawley con un peso desde 120 hasta 180 g. Entrega 2 a 3% en volumen isoflurano a una caja de plexiglás a través de vaporizador de isoflurano y coloque el interior de la rata.
- Tan pronto como el nivel adecuado de anestesia se consigue (falta de reacción a los pies o pellizco cola) a la rata se pondera y afeitado en la zona cervical ventral.
- Colocar la rata en decúbito dorsal sobre una almohadilla de calentamiento para mant....
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Discusión
Leucocitos del endotelio interacción, la producción de especies reactivas del oxígeno y la activación del sistema del complemento son las principales características de la disfunción del tejido inducido por el IRI. 26 La microcirculación del tejido afectado es considerado como el sitio integral para el inicio inflamatoria. Aparte de los experimentos ex vivo, como los ensayos de la cámara de flujo 27, 28, es obligatorio proporcionar modelos bien establecidos de imagen intravital para seguir.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" a SU Eisenhardt (IE 866/1-1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del equipo: | Empresa: | Artículo número: | Comentarios: |
| Forene 100% (V / V) | Abad | B506 | API de isoflurano |
| Terylene sutura | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Bellas Diámetro tubo de polietileno | Smiths Medical | 800/100/100 | 0,28 mm de diámetro interior |
| 0,9% de solución salina | Fresinus Kabi | 808771 | |
| -A cambio de punta de lujo kit de cauterio | Bovie Medical | Del1 | |
| Abbocath-T 14G | Venisystems | G713- A01 | utilizado como tubo de lente |
| Servo 900C Ventilador | Maquet | utilizada como ventialtor animales | |
| Transductor de presión lógico | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor de | Siemens | ||
| ABL 700 Analizador de mesa | Radiómetro | para la medición de gases en sangre | |
| Almohadilla eléctrica | Effenberger | 8319 | |
| Aluminio fase | ALFUN | AW7022 | |
| Microscopio quirúrgico OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microcirugía de los instrumentos de laboratorio de set | S & T | 767 | |
| Biemer clip de buques | Diener | 64.562 | |
| La aplicación de fórceps | Diener | 64.568 | para el clip de buques Biemer |
| Rodamina 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaselina blanca DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cubreobjetos | 32x32 mm | ||
| Configuración intravital | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | microscopio de epifluorescencia |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fuente de luz fluorescente |
| 2 Sistema de Colibri | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | objetivo de inmersión en el agua |
| AxioCam MRM Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | cámara digital de alta resolución |
| Axio LE software de la visión | Carl Zeis | 410130 | utilizar para análisis fuera de línea |
Referencias
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N.
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Reimpresiones y permisos
