La Citrobacter rodentium Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

Resumen

Citrobacter infección rodentium ofrece un valioso modelo para estudiar las infecciones bacterianas entéricas, así como respuestas inmunes del huésped y la colitis en ratones. Este protocolo describe la medición de la integridad de la barrera, la carga de patógenos y el daño histológico que permita la caracterización detallada de las contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa murino.

Resumen

Este protocolo describe los pasos necesarios para producir un modelo robusto de enfermedades infecciosas y colitis, así como los métodos usados ​​para caracterizar la infección por Citrobacter rodentium en ratones. C. rodentium es un gram negativo, murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con la importancia clínica humana enteropatógena patógenos E. coli y E. enterohemorrágica coli. Tras la infección con C. ratones inmunocompetentes rodentium, sufren de pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Histológicamente, el alargamiento de cripta intestinal, infiltración de células inmunes, y la depleción de células caliciformes se observó. Aclaramiento de la infección se logra después de 3 a 4 semanas. La medición de la integridad de la barrera epitelial intestinal, la carga bacteriana, y daño histológico en diferentes puntos temporales después de la infección, permiten la caracterización de cepas de ratón sensibles a la infección.

El mecanismo de virulencias por el cual las bacterias patógenas colonizan el tracto intestinal de los anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos. Por lo tanto el C. rodentium modelo de infección bacteriana entérica sirve como una herramienta valiosa para ayudar en la comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Se ha planteado la hipótesis de que las respuestas inflamatorias crónicas inadaptadas observados en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas. Por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa ofrece un potencial significativo para la definición de las respuestas potencialmente patógenas de acogida a bacterias entéricas. C. rodentium colitis inducida es un modelo poco común que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas, ampliar nuestro conocimiento de los posibles mecanismos de la patogénesis de la EII;esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos.

Introducción

La infección por patógenos bacterianos entéricos desencadena gastrointestinal (GI) la inflamación, así como patología intestinal y la fisiopatología, incluyendo la diarrea y la disfunción intestinal barrera epitelial. Los mecanismos de virulencia de patógenos bacterianos que colonizan el tracto gastrointestinal de sus anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos, sin embargo, los avances recientes en la modelización de las infecciones bacterianas entéricas han comenzado a ayudar a nuestra comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias in....

Protocolo

1. Preparación del inóculo y Citrobacter rodentium sonda oral de ratones

1. Preparar y esterilizar en autoclave caldo Luria Bertani (LB).
2. Obtener viable C. rodentium de una reserva de glicerol congelado y raya sobre la placa de LB agar con un asa de inoculación estéril o punta de pipeta. Incubar a 37 ° C durante la noche. Inocular 3 ml de caldo LB estéril en un tubo de cultivo Falcon con colonias de la placa de LB con un asa de inoculación o punta de la pipeta. Preparación del inóculo debe hacerse utilizando técnicas asépticas.
3. Incubar la C. cultura rodentium aeróbicamente a 37 ° C durante la noche en un....

Resultados

Durante un experimento de infección estándar, los ratones se infectaron con aproximadamente 2,5 x 10 ⁸ UFC a través de una sonda de 100 l C durante la noche rodentium cultura. La infección de ratones C57BL / 6 con C. rodentium resultados en pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Aunque sucede rara con C57BL / 6 ratones, los animales pueden enfermarse y requerir la eutanasia. Por lo tanto, los ratones deben ser monitorizados para el grado de pérdida de peso y síntomas de a.......

Discusión

Citrobacter rodentium infección proporciona un modelo valioso para el estudio tanto de la enfermedad infecciosa y colitis en ratones. Este modelo único permite la caracterización de las dos respuestas del huésped, así como las propiedades patógenas de bacterias. Los pasos descritos en este detalle el protocolo del uso exitoso de este modelo.

Hay varios pasos críticos en este protocolo a tener en cuenta cuando se provoque colitis y el análisis de las respuestas. En primer lugar, la p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de Catálogo	Comentarios
Caldo Luria	ABM	G247	Añadir 25 g de polvo LB a 1 litro de agua. Esterilizar en autoclave antes de usar.
Placa de fondo cuadrado con rejilla	Pescador	08 a 757-11A
Falcon tubo de cultivo	Sarstedt	62.515.006
Bombilla con punta de aguja sonda gástrica	Herramientas Artes Ciencias	18060-20
1 ml jeringa	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-dextrano	Sigma	FD-4
El ácido cítrico	Sigma	C7129
Citrato de sodio	Pescador	S279-500
Dextrosa	Pescador	D16.1
Ácido citrato dextrosa			20 mM de ácido ctiric, citrato de sodio 110 mM, 5 mM de dextrosa
Negro de 96 pocillos	Pescador	07-200-762
Cuentas de metal (5 mm)	Qiagen	69989
10% de formalina	Pescador	5F93-4
5 ml vial	DiaMed	STK3205
Hematoxilina	Pescador	H345-23
Eosina	Pescador	E511-100
Xileno	Pescador	HC700-1gal
Tween 20	Sigma	P5927
Tinción Coplin tarro	VWR	47751-792
Tampón de citrato de sodio			10 mM citrato de sodio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0
Pap pluma	Cedarlane	MU22
Suero de cabra	Sigma	G902-3
Albúmina de suero bovino (BSA)	Pescador	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
Sodio azida	Sigma	SZ002
El tampón de bloqueo			2% de suero de cabra, 1% BSA, 0,1% de Triton X-100, 0,05% de Tween 20, 0,05% de sodioazida, 0,01 M PBS, pH 7,2, mezclar y almacenar a 4 º C.
Tampón de dilución de anticuerpo			0,1% de Triton X-100, 0,1% de BSA, 0,05% de azida de sodio, 0,04% de EDTA
El tampón de bloqueo y tampón de dilución de anticuerpos para tir			Recetas Igual que el anterior, pero sin la adición de detergentes (Triton X-100 y Tween 20)
Prolongar Reactivo Antifade oro con DAPI	Invitrogen	P-36931
Cubreobjetos	Pescador	12.54SE
Benchtop incubación agitador	Barnstead Lab Line	Max Q4000
Fluorómetro	Perkin Elmer	Victor2D
Centrífuga refrigerada	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Buque de vapor	Negro & Decker
Microscopio de fluorescencia	Zeiss	Axio Image.Z1