Summary
Ce protocole décrit une procédure d'explantation amélioré qui implique
Abstract
Développement cortical implique des interactions complexes entre les neurones et les non-neuronales, y compris des éléments précurseurs de cellules, des vaisseaux sanguins, les méninges et associé matrice extracellulaire. Parce qu'ils fournissent un environnement propice organotypique, les explants tranches corticales sont souvent utilisées pour étudier ces interactions qui contrôlent la différenciation neuronale et le développement. Bien que bénéfiques, le modèle d'explant tranche peuvent souffrir d'inconvénients, y compris stratification cellulaire aberrante et la migration. Nous rapportons ici l'ensemble du système cérébral explant hémisphère pour les études du développement cortical précoce qui est plus facile à préparer que les tranches de cortex et spectacles cohérente de migration organotypique et le laminage. Dans ce système modèle, la stratification précoce et les schémas de migration se dérouler normalement pour une période de deux jours in vitro, y compris la période de séparation preplate, au cours de laquelle prospective couche corticale six formes. Nous avons ensuite développé une électroporation ex utero (EUEP)approche qui connaît un succès ~ 80% dans le ciblage expression de la GFP pour les neurones en développement dans le cortex dorsal médial.
Le modèle hémisphère explant rend développement précoce corticale accessibles pour l'électroporation, une intervention pharmacologique et des approches d'imagerie en direct. Cette méthode permet d'éviter la chirurgie de survie nécessaire d'électroporation in utero (IUEP) des approches tout en améliorant à la fois la transfection et la cohérence de surface de ciblage. Cette méthode facilitera les études expérimentales de la prolifération, la migration neuronale et de la différenciation.
Introduction
Les formes de mammifères cortex cérébral à travers la prolifération, la migration concertée et la différenciation des neurones générés successivement. Chaque neurone est né dans la zone ventriculaire (VZ) et migre du VZ dans la zone intermédiaire (IZ), la formation de la plaque corticale (CP) 1. Lors de leur passage à travers les différents domaines corticaux, les neurones migrent afficher de multiples modes de migration 2,3 qui dépendent de l'environnement extracellulaire et d'autres éléments cellulaires (par exemple, la glie radiale) dans le tissu développement. Les neurones corticaux puis arrêter la migration en haut de la plaque de formage corticale dans les processus d'arrêt coïncidant migration neuronale et 4 dendritogénèse.
Développement cortical est initiée entre embryonnaires jours 11-13 (E11-13) 5 à travers la couche de mise en place primordiale plexiforme 6 ou preplate (PP), une couche de neurones pionniers qui recouvre le VZ. Éventuelcouche 6 neurones corticaux (c'est à dire les premiers neurones corticaux nés dans le VZ) puis orienter leur corps cellulaire dans un modèle stéréotypé et se fondre en une couche distincte au sein du PP 7. Ces événements diviser le preplate dans une superficielle marginale (future couche corticale 1) et une zone de profondeur, ce dernier composé de cellules sous-plaque (transitoire couche corticale 7). Ce processus, appelé le fractionnement preplate, est un événement fondamental dans la croissance future du cortex cérébral 8.
De nombreuses mutations génétiques ont été identifiés qui perturbent les différents aspects du développement cortical 9. Développement cortical peut également être affectée négativement par l'exposition à des toxines ingérées telles que la cocaïne et l'alcool 10 11. Parce que des malformations corticales qui se posent au cours du développement sont probablement contribué à des troubles neurologiques (autisme, par exemple, la schizophrénie), les enquêtes empiriques de perturbations du développement cortical sont inhérentesment important. Il est donc d'une importance considérable pour établir des approches pour étudier le développement cortical qui permet des tests rapides d'effets génétiques ou de la toxine mais aussi de préserver les interactions possibles entre les neurones de différenciation, d'autres types cellulaires et la matrice extracellulaire (ECM) au cours de cette première période de 12 le développement du cerveau .
Explants tranche 13 ont fourni un tel système et ont été largement utilisés pour analyser neurone développement cortical 14-16. Toutefois, les essais de tranche peuvent souffrir de l'inconvénient que la migration neuronale et de stratification peut être anormale 17 probablement en raison de dommages aux cellules méningées qui entourent le cerveau en développement et l'ancrage du gliales radiales échafaud. Comme radiales fibres gliales sont un substrat important pour la migration des neurones corticaux 18 rupture de la membrane basale par tranchage peut perturber localement radiale l'architecture des cellules gliales et conduire à la migration corticale altérée. En outre, le sliced surfaces d'explants fournit une région de cellules mortes qui peuvent modifier la composition normale de l'ECM dans ces domaines.
Des approches plus récentes ont concentré leur analyse sur les cellules situées au fond de la tranche qui sont entourés par des types de cellules appropriées sains et ECM. Toutefois, dans certains cas, ces nouvelles approches peuvent exiger que l'original tranche épaisse culture cryo-être sectionné ou de la paraffine après fixation de section afin que l'intérieur relativement normal de la tranche est mis à disposition pour l'analyse de 19-21. À la fois l'origine vibratome sectionnement pour préparer les tranches en direct pour la culture, ainsi que la découpe au cryostat ultérieur de tranches fixes pour l'analyse nécessitent des soins et de l'effort de ces dosages à travailler.
Pour assurer une approche simple et complémentaires pour les études du développement cortical début, nous avons modifié l'approche d'une tranche existante de 13 à faciliter les études du développement cortical précoce. Nous avons développé un whmodèle ole explant hémisphère semblable à un modèle existant E14 hémisphère qui a impliqué cultures secousses à 65 rotations par minute et permet la croissance organotypique pour 16-18 heures 22,23. Dans notre approche, les explants hémisphère entières sont placées sur membrane semi-perméable 13 avec la culture, dans une atmosphère d'oxygène à haute 21,24 organotypique de prolonger la croissance corticale pendant 48 heures. Cette approche permet également d'électroporation cohérente de développement des neurones corticaux. Les embryons sont retirés de l'utérus et une électroporation pour introduire l'ADN plasmidique et le télencéphale est ensuite découpé. Chaque hémisphère est isolé et placé côté médial vers le bas sur un filtre revêtu de collagène. L'explant est ensuite mis en culture pour une période de 48 heures, une période qui englobe 8 fractionnement preplate. Au cours de la période de culture, les neurones L6 développer à partir de précurseur de neurone différencié 25, correctement positionnée à l'intérieur de la plaque corticale. Tout au long de cette période, le développement deneurone est entouré par l'ECM approprié et des types de cellules qui face la cellule correspondant in vivo. Ce système a déjà avéré utile pour déchiffrer les événements cellulaires qui sous-tendent toxicité de l'éthanol 26, couche 6 formation et diviser preplate 7,25.
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Protocol
1. Électroporations ex utero avec Expression Green Fluorescent Protein plasmide
- Plasmide solutions d'injection d'ADN sont préparés avec CAG-eGFP ADN 27 dilué à la concentration de travail finale de 0,33 mg / ml dans ddH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sont utilisés pour purifier le plasmide à partir de bactéries transformées. Rapide colorant vert à ~ 0,02% (p / v final) est ajouté à la solution d'ADN en tant que traceur injection.
- Pour préparer la zone chirurgicale, arroser paillasse et le stade microscope à dissection avec une solution d'éthanol à 70% et essuyez-le. Vaporiser ciseaux chirurgicaux et des pinces d'éthanol à 70% avant la dissection et essuyez-le.
- Timed enceintes suisses / Webster barrages sont sacrifiés sur E13 par transfert dans une chambre remplie de CO 2 d'un cylindre pressurisé et le barrage est surveillé jusqu'à ce que tout mouvement a cessé pendant au moins 1 min. Après sacrifice par inhalation de CO 2 les embryons sont retirés de l'utérus et mis enune boîte de Pétri de 10 cm de glace contenant Hanks froide solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
- Disséquer soigneusement chaque embryon à partir des membranes extra-embryonnaires environnantes et garder à l'glacées HBSS.
- Transférer chaque embryon individuellement à un deuxième plat de 10 cm de Petri contenant HBSS froid. Utiliser une seringue pour injecter Hamilton 2-3 pl de l'ADN mélange vert rapide dans le ventricule de l'hémisphère cérébral gauche, en prenant soin d'injecter dans une zone corticale spatialement séparée de la zone corticale pour une analyse ultérieure.
- Pour électroporation, maintenez l'embryon délicatement avec une pince et placez la pagaie légère positive de l'électrode pince sur la ligne médiane dorsale de la tête et légèrement négative placez la pagaie sous le menton embryon. Électroporations sont atteints avec un électroporateur BTX830 programmé pour livrer cinq 30 impulsions V de 50 ms de durée, séparées par des intervalles ms 950. Ces réglages sont pour le modèle BTX830. D'autres systèmes peuvent être utilisés selon les instructio fabricantns.
2. Préparation des explants hémisphère entier
- Après électroporation les embryons sont replacés dans glacées HBSS. Le cerveau est prélevé au moyen de deux pinces de bijoutier n ° 5 pour enlever la peau et le crâne cartilagineux de la tête de l'embryon. Une pince est ensuite glissé sous le cerveau pour retirer le cerveau intact du crâne. L'hémisphère électroporation (à gauche) est ensuite disséqué loin du cerveau et attaché mi-tissu cérébral est retiré. Tout au long de la prise en charge technique de dissection est prise de ne pas endommager les méninges recouvrant l'hémisphère gauche corticale.
- Une fois disséqué chaque embryon est transféré dans HBSS l'aide d'une pipette avec une pointe de coupe 1 ml pipette. L'hémisphère est ensuite expulsé doucement sur un insert de culture revêtus de collagène. Jusqu'à six explants hémisphère sont disposés côté médial vers le bas sur chaque insert de 24 mm. Une fois disposées, HBSS en excès est éliminé de l'insert et l'insert est ensuite placé dans une 35 mm et d'une boîte à 6 puits. Le bien contient exacte 2,7 ml de médias: DMEM-F12 supports contenant Glutamax et additionné de 2% B-27, 1% et 1% G5 pénicilline-Strep. Quelques gouttes des médias du puits peut être introduit à la pipette au-dessus de chaque explant, mais ne pas ajouter des médias au-delà de l'original 2,7 ml par puits.
- Une fois les explants ont été placés sur des filtres de collagène le plat à 6 puits contenant les explants sont placés dans un Billups Rothenberg (BR) chambre (qui contient également un plat d'humidification de l'eau). A 95% / 5% d'oxygène / CO 2 du mélange gazeux est injecté dans la chambre pendant au moins 1 min avant de sceller la chambre fermée et la déconnexion 95% / 5% d'oxygène / CO 2 du tube d'alimentation en gaz. La chambre de BR est ensuite placé dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pour le reste de la période de culture, 1-2 DIV.
3. Fixation des tissus explantation pour histologie
- Dans une hotte préparer la solution de fixation Pagano en commençant par solubilisation 8 g de paraformaldéhyde dans 100 ml d'préchauffé (~ 80 & deg, C) ddH 2 O. Ajouter 1-3 gouttes de NaOH concentrée pour favoriser la solubilisation et remuer doucement. Une fois solubilisé mélanger la solution de paraformaldéhyde 8% de 1:1 avec une solution qui est de 500 mM de saccharose, Hepes 100 mM, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM de KCl pour une concentration finale de paraformaldéhyde 4% de saccharose dans 250 Hepes mm 50 mm , 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
- Pour fixer les explants réchauffer la solution fix Pagano à 37 ° C. Supprimer rapidement la plupart des DMEM/F12 médias de chaque puits de culture et ajoutez 5 ml de Fix Pagano dans chaque puits d'explants. Assurez-vous de couvrir chaque explant complètement en solution. Fixer pendant 1 heure à température ambiante. Ne retirez pas explants de filtre avant 1 h de fixation.
- Après fixation éliminer la solution de correction Pagano et la remplacer par une solution Pagano sans correction (250 mM HEPES 50 mM de saccharose, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4). Ajouter quelques gouttes d'azoture de sodium à 10% et conserver à 4 ° C jusqu'à incorporer.
4. Intégration et Sectioning pour histologie
- Préparer une solution de veau à 10% la gélatine de peau en solubilisant 10 g de gélatine de peau de veau dans 100 ml d'eau tiède (55-60 ° C). Placez une solution de gélatine sur une plaque chauffante réglée à 60 ° C et agiter périodiquement jusqu'à solubilisé.
- Verser environ 10 ml de la solution de gélatine à 10% dans le fond d'une boîte de Petri de 10 cm et 30 min permettre de se solidifier. Cela formera un "pad" pour l'intégration des explants. Ces tampons peuvent être des jours préparés à l'avance et stocké à 4 ° C. Utilisez une règle pour tracer une grille sur le fond de la boîte de Pétri et le transfert des explants individuels dans chaque case de la grille. Enlever les résidus solution Pagano et à l'aide d'une pipette, couvrir chaque explant avec une solution de gélatine chaude 10% et laisser se solidifier. Reprendre l'addition lente d'une solution de gélatine jusqu'à ce que chaque explant est complètement entourée par la gélatine, en prenant soin de ne pas faire fondre le tampon par addition de trop chauffer la gélatine à la fois. Permettre la gélatine à durcir pendant ~ 1 heure. Une fois durci le particulierexplants UAL peut être découpée en petits blocs de gélatine. Les blocs sont ensuite post-fixée dans Pagano fixer pendant 24-48 heures avant la coupe avec un vibratome.
- Explants dans les blocs de gélatine sont positionnés bulbe olfactif et en coupe dans le plan frontal à 100 pm d'épaisseur. Les coupes sont recueillies et stockées dans du PBS + 0,1% d'azoture de sodium à 4 ° C jusqu'à leur traitement immunohistochimique.
- Détection immunohistochimique est réalisée par le transfert de sections dans une plaque à 24 puits (2-3 sections par puits). Premier bloc non spécifique de liaison d'anticorps en ajoutant 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 et 2% de BSA) à chaque puits, incuber 1 h sous agitation douce. L'anticorps primaire appropriée est ensuite dilué dans du PBST + B et de 0,4 ml par puits est ajouté pour une nuit d'incubation à température ambiante. Le premier est lavé avec du PBS 3X lave pendant au moins 10 minutes chacune. L'anticorps secondaire et 2 pg / ml Hoechst 33342 colorant nucléaire sont ensuite diluées dans du PBST + B et les échantillons sont incubés pendant 2 heures à la température ambianteen agitant doucement. Trois lavages PBS (10 min chacun) sont effectués, puis les coupes sont montées sur des lames à l'aide de 90% de glycérol Tris 50 mM, pH 7,4, milieu de montage.
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Representative Results
Le rongeur embryonnaire cortex présente un gradient de neurogénétique transversale tout au long de la période de développement, tels que le néocortex latéral est d'environ 1 jour plus mature que dorsale médiale néocortex 28. Le nombre de neurones couche 6 est ainsi généré (c'est à dire présenter leur dernière phase S) sur E12 dans le cortex latéral (également appelé champ 40 5) et à E13 dans le cortex médial dorsale (également appelé champ 1 5). Fractionnement Preplate commence environ 1 jour après la couche 6 et la génération neurone est ainsi engagé dans la corticale externe de l'E13 et E14 cortex dorsal sur. Pour étudier le fractionnement preplate et l'initiation du développement corticale, nous avons modifié un test explant tranche de 21,24 telle que tout hémisphères cérébraux ont été cultivées généralement de E13 à E15 (figure 1).
Nous avons testé la viabilité de la technique explant cortical en examinant la croissance des explants d hémisphèreerived de souris Tg (GSAT Eomes :: eGFP) (Figure 2). Cette souche de souris contient un transgène qui relève des neurones immatures de la lignée d'excitation corticale 7,29,30. Explants hémisphère corticales ont été préparés à E13, à un moment avant preplate fractionnement dans le néocortex dorsale (figure 2A). Explants corticales de la même portée sont fixées séquentiellement goutte sur une période de 2 DIV et traitées pour l'analyse histologique ultérieure. Au point le temps d'analyse initiale (DIV 0), le fractionnement preplate n'a pas encore eu lieu dans la zone 1 (néocortex dorsale; figures 2A, 2E). Par le CP 1 DIV est évident (figures 2B, 2C, 2F, 2G), et il continue de croître jusqu'à 2 DIV (figures 2D, 2H). Ainsi, les explants cultivés hémisphère initialement à E13 soutien pendant deux jours la maturation du cortex cérébral et capte le fractionnement preplate dans le néocortex dorsale.
Pour confirmer la normeal développement histologique dans le néocortex dorsale, nous immunocolorées 2 DIV explants de protéoglycanes chondroïtine sulfate (CSPG), un composant de la matrice extracellulaire qui est aussi un marqueur établi du PP et ses dérivés et le MZ SP 8,31,32. Immunocoloration pour CSPG révèle deux bandes de CSPG immunoréactivité dans le cortex dorsal indiquant division appropriée du PP dans MZ et SP pendant la période de culture in vitro (figures 3A-3C). Le PP est divisé par L6 neurones corticaux qui sont connues pour exprimer des facteurs de transcription et Ctip2 TBR1 7,33,34. Le modèle immunologique de ces marqueurs (figures 3D-3F, 3G-I, respectivement) confirme l'expression appropriée de ces facteurs de transcription dans le CP nouvellement formé. Ensemble, ces analyses confirment organotypique développement précoce corticale dans l'hémisphère explants entiers.
In utero électroporations ont été largement utiliséspour doser la fonction d'un gène cellulaire autonome dans le développement du cortex 35. Nous avons donc testé si électroporation pourrait réussir à transfecter les neurones dans le modèle d'explant hémisphère. Le ventricule gauche du intactes E13 embryons ont été injectés avec 0,33 mg / ml CAG-GFP plasmide et électroporation (voir Méthodes) pour introduire l'ADN plasmidique dans les précurseurs neuronaux qui bordent le ventricule latéral (figure 1A). Après 2 DIV les explants ont été abandonnées fixe et sectionné pour l'analyse histologique. A ce point du temps, les cellules exprimant la GFP ont été observées dans toutes les zones corticales à travers la paroi cérébrale (figures 4A-4C). Expression de la GFP a pu être observée à partir de précurseurs neuronaux dans le VZ tandis que les cellules exprimant la GFP intenses ont été observés dans la ZI et le CP. Surtout, de nombreux neurones GFP + ont été observées dans la partie supérieure du CP formation de dendrites et des axones émergents. Les cellules ont formé une couche discrète à l'interface entre le CP et MZ indicatinarrestation g de migration approprié et le laminage (Figures 4A-4C, flèches). Les dendrites étendu dans le MZ tandis que les axones corticofugal s'étendent en dessous du CP et dans l'IZ (figures 4A-4C et 5 Voir aussi S1 film supplémentaires). Ci-dessous les cellules différenciées sont des cellules GFP + dans divers états de maturité, y compris les neurones avec une morphologie bipolaire, juxtaposées à fibres gliales radiales et en dessous d'eux, les neurones multipolaires dans la ZI (figures 4D à 4F). En outre, les dendrites sont observées s'étendant dans le MZ où la protéine Reelin ECM est appropriée immunolocalized (figures 4G-4I). Les conditions d'électroporation explant et ainsi permettre le développement normal des neurones corticaux à travers les étapes de la migration précurseur de neurone en neurone immature de différenciation.
Au moment de l'électroporation (E13) 100% des neurones produits par les VZ dorsales sont néocorticales L6 neurones, les neuronesqui a divisé le PP 5. Électroporation réussie nécessite que des constructions être introduit dans les neurones au cours de l'heure 6 immédiatement avant ou pendant la phase M du cycle cellulaire 36. Il est ainsi prévu que la première postmitotiques, GFP + neurones suivants E13 électroporation dans le cortex dorsal (champ 1) doit remplir le CP formation. Ces neurones ont été observées (Figure 4) indiquant que le protocole peut cibler de manière fiable L6 neurones corticaux pour l'étude de la migration et de la maturation.
Pour estimer le «taux de réussite» de la procédure d'électroporation / explant nous avons analysé une enquête en cours de notre laboratoire. Dans le cadre de cette étude, 21 litres d'explants ont été préparés, un total de 248 embryons ont été soumis à une électroporation (tel que décrit ci-dessus) avec CAG-GFP et un explant seul hémisphère de chaque embryon a été préparé. Sur les 248 explants initiaux, 195 (79%) ont été jugés appropriés pour l'imagerie et l'analyse. Environ la moitié des 53explants qui ne pouvaient être analysés manqué d'exprimer la GFP ou expression de la GFP était mal ciblée. Les pertes restantes ont été expliqués par la croissance dysmorphique en raison de l'explantation détachement du filtre à la culture, ou des problèmes associés à la transformation histologique. Ce taux de réussite d'environ 80% (figure 5) a rendu le système explant approprié pour les études pharmacologiques 26, ainsi que l'analyse des mutations récessives 7 qui affecter le début du développement cortical.
Figure 1. Toute procédure d'explantation hémisphère électroporation in utero ex. A E13) d'embryons de souris sont injectés avec une solution d'ADN plasmidique et électroporation. Les cerveaux sont disséqués et sectionnés sagittale. L'électroporationhémisphère sont ensuite placés côté médial vers le bas sur un filtre enduit de collagène et cultivées pendant 2 DIV. Les hémisphères peuvent ensuite être visualisés en temps réel ou fixée pour l'imagerie et l'analyse histologique ultérieure. B) Une photo de 10 explants mis sur trois filtres dans un lave six puits de culture tissulaire. C) Le plat ainsi six avec des explants est placé dans un environnement riche en oxygène (95% O 2/5% CO 2) dans une chambre de Billups-Rothenberg Incubateur, qui est ensuite placé dans une norme 37 ° C incubateur de culture tissulaire.
Figure 2. Croissance organotypique de plaque corticale dans l'hémisphère explants entiers issus d'une portée unique de Eomes :: embryons EGFP. A, E) une section coronale du cerveau d'un menu fixe au début du culte période ure (O DIV). Notez que le PP est présente mais que le CP n'a pas encore à se former. Le signal vert est produit par expression de la GFP dans les neurones excitateurs et immatures le bleu est le colorant Hoechst qui étiquette le noyau de toutes les cellules. B, F). Croissance CP, notée en pointillés, est observée de 0,5 DIV et augmente de 1 DIV (C et G) et 2 DIV (panels D et H). Notez l'épaisseur accrue de la cellule exprimant la GFP de domaine dans AD panneaux indiquant la prolifération et la différenciation de la lignée neurone excitateur dans l'expiant. Barres d'échelle est de 500 um (panneau A) et 50 um (panneau H). Abréviations: CP, plaque corticale; IZ, zone intermédiaire; MZ, la zone marginale; SP, Embase, VZ, la zone ventriculaire.
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Figure 3. Fractionnement Preplate dans des explants de l'hémisphère tout entier. AC) protéoglycane chondroïtine sulfate (CSPG) immunomarquage illustre la division (division) de la PP dans le MZ et SP. DF) Expression de la Ctip2 facteur de transcription dans le CP nouvellement formé. GI) Expression de la TBR1 facteur de transcription dans le CP nouvellement formé. Barres d'échelle sont de 50 um de panneaux C, F, I.
Figure 4. Expression de la GFP dans des explants entiers après l'hémisphère E13 électroporation in utero ex. AC) expression de la GFP après 2 DIV. Notez la couche de neurones corticaux qui se forment à la partie supérieure du CP (flèches). DF) nestine (rouge) immunoreactivlité dans un article à partir d'un explant hémisphère. GH) Reelin (rouge) immunoréactivité dans un article provenant d'un explant hémisphère. Barres d'échelle dans les panneaux C, F et I sont de 50 um.
Figure 5. Variabilité dans le ciblage électroporations ex utero au cortex médial dorsale (zone 1). Onze embryons à partir d'une même portée ont été soumis à une électroporation avec l'expression CAG-GFP construction (0,33 mg / ml) et cultivées comme explants hémisphère tout entier. AI) Neuf des onze explants ont montré expression de la GFP dans le cortex médial dorsal. Bien que l'expression de GFP varie entre explants, dans chaque explant GFP est détectée dans les trois zones corticales (c.-à-VZ, IZ et CP). La barre d'échelle est de 50 um dans le panneau A.
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Discussion
Nous avons amélioré et évalué un modèle expérimental - explants hémisphère entiers - pour l'étude du développement cortical précoce (E13-E15). Le modèle s'est révélé utile pour l'analyse de la migration et de la différenciation de la lignée neurone excitateur qui constitue la couche 6 du cortex cérébral 25,37. Les principaux avantages du système sont: 1) la croissance organotypique pour 2 DIV, 2) la simplicité de préparation, et 3) l'accès expérimental aux neurones pour l'électroporation, la manipulation pharmacologique et l'imagerie au cours de cette enfance, période critique du développement du cerveau. Nous avons utilisé le système pour documenter les différences subtiles dans la morphologie, l'orientation et la croissance dendritique de la couche 6 neurones corticaux 7,38 au cours de la période de séparation preplate.
Les neurones excitateurs qui peuplent la couche 6 sont largement composées de neurones de projection corticothalamiques qui apportent leur contribution réciproque au thalamus dorsal 39,40 41. Bien que ces neurones sont physiologiquement spécialisée, le processus de génération, de la migration et de la maturation de la couche 6 neurones partage des caractéristiques de base avec tous les neurones excitateurs dans les couches 2-6 du cortex. Plus précisément, tous les neurones corticaux excitateurs sont générés dans le VZ dorsale télencéphalique, migrent à travers la IZ que les neurones multipolaires, et se différencient dans le CP 7. La maturation des neurones corticaux excitateurs est entraîné par un ensemble de base des facteurs de transcription exprimés de manière séquentielle: Pax6, tbr2 et TBR1 29. Cette séquence est partagée par tous les neurones excitateurs dans les couches 2-6 42 et nous avons confirmé l'expression appropriée de TBR1 dans le CP nouvellement formé (figures 3G-3I). En utilisant cette approche pour étudier le développement de la couche 6 neurones corticaux devrait donc fournir des indications essentielles dans le développement de neurons que constituent toutes les couches corticales.
Explants hémisphère compléter les approches existantes pour les études sur le développement des neurones corticaux. Des études antérieures ont utilisé une approche globale E14 explant hémisphère pour étudier le développement cortical pour 1 DIV 22,23. Nous avons couplé des explants de l'hémisphère entier avec électroporation in utero ex pour enquêter sur 2 jours de développement cortical pendant la période de formation et diviser L6 preplate. Contrairement à dans électroporations in utero à E13, le taux de réussite des électroporations ex utero suivis par explant hémisphère est plus élevé: dans nos mains, nous réussir ~ 80% dans le ciblage électroporation pour le télencéphale dorsal. En outre, dans électroporations in utero besoin d'une chirurgie de survie et de prendre des efforts beaucoup plus technique que l'approche utero hémisphère ex entier. Enfin, dans les études in utero ne sont pas facilement prêter à pharmacologique précisemanipulations et des approches d'imagerie. Contrôle précis temporelle dans la livraison ou l'activation de médicaments et d'agents moléculaires (vecteurs d'expression, des constructions taire, etc) à des concentrations définies est fourni avec les explants hémisphère entier, mais il est plus difficile à réaliser dans l'utérus. En direct de contrôle optique des effets qui en résultent de telles manipulations, avec une résolution spatiale de l'ordre du micron, est facilement accessible avec EUEP, mais pas IUEP. Une telle précision est de nature à améliorer sensiblement le pouvoir d'interprétation des données recueillies sur les expériences impliquant le développement cortical et de la fonction. Ainsi, pour l'étude des explants début du développement cortical hémisphère entiers possèdent de nets avantages sur l'approche expérimentale in utero. A cette époque, cependant, pour des études de neurones corticaux de la couche supérieure et des expériences nécessitant la collecte des données> 48 h, les explants tranche et dans les approches in utero restent préférables.
Il est plusieurs exigences essentielles pour le succès de la technique explant hémisphère. Premièrement, la croissance de l'explant est très sensible à l'intégrité mécanique des méninges. Les dommages physiques aux méninges (c.-à-crevaison ou de déchirures) sera au minimum de perturber le développement local du cortex sous-jacent. Deuxièmement, la croissance des explants est sensible au volume total des médias au sein de la culture ainsi: avec les médias trop les explants se désengager du filtre et élaborer l'architecture CP déformée, avec trop peu de médias et les explants sont susceptibles de se déshydrater et expérience de la mort cellulaire excessive . Enfin, avec les explants technique actuelle nous avons documenté la croissance cortical pour 2 DIV. Lors du démarrage à E13 cette fenêtre de temps de développement, tout en admettant de nombreuses enquêtes précieux, limite l'analyse à une période antérieure à la synaptogenèse et canonique communication neuronale. Bien que les neurones corticaux à E14.5 express ARNm codant pour des protéines synaptiques nombreux (w.genepaint.org "target =" _blank "www.genepaint.org>), la synaptogenèse ne commence pas avant ~ E15 dans le cortex latéral, et ce synaptogenèse se limite à preplate cellules plutôt que la couche 6 neurones 43. Certaines questions critiques concernant la formation des synapses corticales et la fonction sont donc pas actuellement adressable avec le système explant hémisphère.
En conclusion, la préparation hémisphère explant peut être utilisé de façon fiable et cohérente pour étudier le développement précoce corticale chez des souris modèles de malformations héréditaires. La technique est facilement adaptable à l'ARNi, shRNA et autres manipulations moléculaires et pharmacologiques. L'explant hémisphère est également approprié pour les études impliquant appliquée protéine recombinante, les médicaments et les toxines environnementales.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu subventions du NINDS (NS066071) et le NIAAA. (P50AA017823) à NML. Les auteurs remercient le Dr Robert Quinn et le personnel du ministère des Ressources animales de laboratoire pour le soin des animaux. Nous remercions Judson Belmont pour le support technique, Nicole Belletier de l'aide en tant que chercheur d'été de premier cycle (SURF). Nous remercions également le Dr David Cameron pour les commentaires et les modifications sur une version antérieure du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1" and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
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