Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Published: April 3, 2013 doi: 10.3791/50271
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam açıklanır

Abstract

Kortikal gelişme nöronlar ve öncü hücreleri, kan damarları, zarları ve ilişkili ekstrasellüler matriks içeren nöronal olmayan elemanlar arasındaki karmaşık etkileşimleri içerir. Onlar uygun bir organotipik ortamı sağlamak için, kortikal dilim eksplantlar genellikle nöronal farklılaşma ve gelişimini kontrol bu etkileşimlerin araştırılması için kullanılır. Yararlı olsa da, dilim eksplant modeli aberan hücresel laminasyon ve göç gibi sakıncaları muzdarip olabilir. Burada kortikal dilimleri ve gösterileri tutarlı organotipik göç ve laminasyon daha hazırlamak kolaydır erken kortikal gelişim çalışmaları için bir bütün serebral hemisfer eksplant sistemi rapor. Bu model sistem, erken laminasyon ve göç yollarını, preplate bölme dönemi de dahil olmak üzere, in vitro iki günlük bir süre için normal prospektif kortikal tabaka boyunca altı formları devam edin. Biz o eski utero elektroporasyon (EUEP) geliştirdidorsal medial korteks gelişen nöronlar GFP hedefleme ~% 80 başarı elde yaklaşım.

Bütün yarımkürede eksplant modeli elektroporasyon, farmakolojik müdahale ve canlı görüntüleme yaklaşımları için erişilebilir erken kortikal gelişim yapar. Bu yöntem transfeksiyon ve alansal hedefleme tutarlılığı hem artırırken utero elektroporasyon (IUEP) yaklaşımlar gerekli sağkalım cerrahi önler. Bu yöntem nöronal proliferasyon, göç ve farklılaşma deneysel çalışmalar kolaylaştıracaktır.

Introduction

Gittikçe üretilen nöronların uyumlu proliferasyon, göç ve farklılaştırılması yoluyla memeli serebral korteks formları. Her bir nöron ventriküler zonunda (VZ) doğdu ve kortikal plaka (CP) 1 oluşturan, ara bölge (IZ) içine VZ göç ediyor. Edilir Onlar farklı kortikal alanları geçerken, göç nöronlar gelişmekte doku içindeki ekstraselüler çevre ve diğer hücresel elementler (örneğin radyal glia) bağlıdır göç 2,3 çoklu ekran modları. Kortikal nöronlarda sonra nöronal göç yakalanması ve dendritogenesis 4 çakışık süreçlerinde şekillendirme kortikal plaka üstünde göç tutukla.

Kortikal gelişme embriyonik gün ilkel pleksiform tabakada 6 veya preplate (PP), o örter VZ öncü nöron tabakası kurulması yoluyla 11-13 (E11-13) 5 ile başlatılır. MuhtemelSonra katman 6 kortikal nöronların (VZ doğumlu yani ilk kortikal nöronlar) şark onların basmakalıp bir desen somata ve PP 7 içinde ayrı bir tabaka halinde birleşme. Bu olaylar bir yüzeysel marjinal (gelecek kortikal tabaka 1) ve derin bölge subplate hücreleri (geçici kortikal tabaka 7) oluşan ikinci içine preplate bölünmüş. Bu süreç, preplate yarma adlandırılan, serebral korteks 8 gelecekteki büyüme temel bir olaydır.

Pek çok genetik mutasyonlar kortikal geliştirme 9 çeşitli yönlerini bozan olduğu tespit edilmiştir. Kortikal gelişimi de olumsuz gibi kokain 10 ve alkol 11 olarak yutulur toksinler tarafından etkiledi olabilir. Gelişimi sırasında ortaya çıkan kortikal malformasyonlar nörolojik bozukluklar (örneğin otizm, şizofreni) muhtemelen katkıda olduğundan, kortikal gelişim için pertürbasyonların ampirik araştırmalar doğasında vardırönemli ly. Genetik ya da toksin etkilerinin hızlı testler izin değil, aynı zamanda beyin gelişimi 12 bu erken dönemde ayırt nöronlar, diğer hücre türleri ve ekstrasellüler matriks (ECM) arasındaki olası etkileşimler koruyan kortikal gelişim eğitim yaklaşımları kurmaya büyük önem taşımaktadır .

Dilim eksplantları 13 böyle bir sistemi temin olan ve yaygın olarak tahlil kortikal Nöron gelişme 14-16 için kullanılmıştır. Ancak, dilim deneyleri nöronal migrasyon ve laminasyon muhtemelen gelişmekte olan beyin ve çapa radyal glial iskele çevreleyen meningeal hücreler hasar nedeniyle 17 anormal olabilir dezavantajı muzdarip olabilir. Radyal glial lifler dilimleme bazal lamina kortikal nöron göçü 18 kesinti için önemli bir substrat olarak yerel radyal glial mimarisi bozabilir ve altere kortikal göç yol açabilir. Buna ek olarak slieksplant ced yüzeyleri bu alanlarda ECM normal kompozisyonu değiştirebilir ölü hücrelerin bir bölge sağlar.

Daha yeni yaklaşımlar uygun sağlıklı hücre tipleri ve ECM çevrili dilim derin yerleşimli hücrelerin üzerinde kendilerine analizi odaklanmıştır. Ancak, bazı durumlarda bu yeni yaklaşımların dilim nispeten normal iç analizi 19-21 için uygun hale getirilir, böylece orijinal kalın kültürlü dilim fiksasyon sonra kriyo-kesitli veya parafin-kesitli olmasını gerektirebilir. Kültür gibi analiz için sabit dilimlerin sonraki cryosectioning için canlı dilimleri hazırlamak için kesit orijinal vibratome Her ikisi de bu deneyler için çaba ve dikkat çalışma gerektirir.

Erken kortikal gelişim çalışmaları için basit, tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz erken kortikal gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için varolan bir dilim yaklaşımlar 13 değiştirdiniz. Biz bir wh geliştirdik65 dakikadaki dönüş ve 16-18 saat 22,23 için izin organotipik büyümeyi sallayarak kültürleri dahil varolan E14 bütün yarımkürede modeline benzer ole yarımkürede eksplant modeli. Bizim yaklaşım, bütün yarımkürede eksplantlar 48 saat süreyle organotipik kortikal büyüme genişletmek için yüksek oksijen kültür atmosferi 21,24 içinde yarı geçirgen bir zar 13 yerleştirilir. Bu yaklaşım, aynı zamanda kortikal nöronlarda geliştirilmesi tutarlı elektroporasyon için olanak sağlar. Embriyolar rahim kaldırılır ve plazmid DNA tanıtmak electroporated ve telencephalon sonra disseke edilir edilir. Her hemisfer izole ve kollajen kaplı filtre üzerinde medial yüzü aşağı yerleştirilir. Eksplant sonra 48 saat, preplate yarma 8 kapsayan bir dönem bir süre için yetiştirilir. Kültür döneminde, L6 nöronlar kortikal plağındaki doğru konumlandırılmış farklılaşmış nöron 25 habercisidir gelişir. Bu dönemde gelişmekte boyuncanöron in vivo olarak buna karşılık gelen hücre karşısına uygun ECM ve hücre türleri tarafından çevrelenmiştir. Bu sistem zaten etanol toksisitesi 26 kat 6 oluşumu ve preplate bölme 7,25 altında yatan hücresel olayları çözmekte değerli kanıtlamıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Plazmid Yeşil Floresan Protein Ekspresyonu ile 1. Ex utero Electroporations

  1. Plazmid DNA enjeksiyon çözeltileri GKD 2 O. içinde 0.33 mg / ml 'lik nihai konsantrasyona seyreltildi çalışma CAG-eGFP DNA 27 ile hazırlanır Qiagen Endo-Free Maxi-Preps dönüştürülmüş bakteriler plazmid arındırmak için kullanılır. ~% 0.02 (w / v nihai) çabuk bir yeşil boya enjeksiyon İzleyici olarak DNA çözeltisine ilave edilir.
  2. Cerrahi alan hazırlamak için,% 70 etanol çözeltisi ile tezgah üstü ve diseksiyon mikroskop sahne yıkadığınız ve kurulayın. Öncesinde diseksiyonu% 70 etanol ile cerrahi makas ve forseps püskürtün ve kurulayın.
  3. Tüm hareket en az 1 dakika süreyle durdu kadar Timed Hamile İsviçre / Webster barajlar basınçlı silindirden CO 2 ile doldurulur ve baraj izlenen bir odasına transferi ile E13 üzerinde kurban edilir. CO 2 solunum yoluyla kurban sonra embriyolar rahim kaldırılır ve yerleştirilir10 cm'lik Petri kabı içeren buz gibi soğuk Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS).
  4. Dikkatle çevredeki extraembryonic membranların her embriyo incelemek ve buz HBSS tutmak.
  5. Soğuk HBSS içeren ikinci bir 10 cm Petri kabı ayrı ayrı her bir embriyo transfer. Gelecek analizi için kortikal alandan mekansal ayrı bir kortikal alanda enjekte bakımı, sol serebral hemisfer ventrikül içine DNA Hızlı yeşil karışımı 2-3 ul enjekte etmek için bir Hamilton şırınga kullanın.
  6. Elektroporasyonu için forseps ile yavaşça embriyo tutun ve hafifçe başının dorsal orta hat üzerindeki cımbız elektrodun pozitif raket yerleştirin ve hafifçe embriyo çene altındaki negatif kürek yerleştirin. Electroporations 950 msn aralıklarla ayrılmış 50 msn süresince beş 30 V bakliyat, teslim etmek için programlanmış bir BTX830 Elektroporatör ile elde edilir. Bu ayarlar BTX830 model oluşturuyor. Diğer sistemler, üreticinin TALİMATLAR göre kullanılabilecekns.

2. Tüm Yarımküre Eksplantasyon Hazırlama

  1. Elektroporasyonun ardından embriyoların buz-soğuk HBSS içinde tekrar yerleştirilir. Beyin embriyo baş cilt ve kıkırdak kafatası kaldırmak için iki # 5 kuyumcu forseps kullanılarak kaldırılır. Bir forsepsle sonra kafatası bozulmamış beyinde çıkarmak için beyin altında kaydırılır. Electroporated yarımkürede (sol) ve sonra beyin uzak disseke edilir ve ekli orta beyin doku çıkarılır. Diseksiyon prosedürü dikkatle boyunca sol kortikal yarımkürede örten zarları tahrip etmeyecek alınır.
  2. Sonra her bir embriyo bir kesim 1 ml pipet ile bir pipet kullanarak HBSS aktarılır disseke. Yarımkürede hafifçe kollajen kaplı kültürü insert üzerine atılır. Altı adede yarımkürede eksplantlar her 24 mm uç üzerindeki medial tarafı aşağı düzenlenmiştir. Bir kez düzenlenmiş fazla HBSS elemanı kaldırılır ve insert daha sonra da bir 6 da çanak biri 35 mm içine yerleştirilir. Iyi EXA içerirOrtamın ctly 2.7 ml DMEM-F12 ortamı Glutamax içeren ve% 2 B-27,% 1 G5 ve% 1 Penisilin-Strep desteklenmiştir. Kuyudan bir ortam birkaç damla her eksplant üstüne pipetle edilebilir, ancak çukur başına 2.7 mL orijinal fazla medya ekleme.
  3. Eksplantlar Kollajen filtreler üzerine konulduktan sonra eksplantlar içeren 6 sıra çanak Billups Rothenberg (BR) odası (aynı zamanda bir su nemlendirme tabak içeren) içine yerleştirilir. A% 95 /% 5 Oksijen / CO 2 gaz karışımı odasının kapalı mühürleme ve% 95 /% 5 Oksijen / CO 2 gaz tüpü çıkarmadan önce en az 1 dakika süreyle odasına demlenir. BR oda sonra kültür periyodu, 1-2 DIV geri kalanı için bir 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içine yerleştirilir.

3. Histoloji için Eksplantasyon Doku fiksasyonu

  1. Bir davlumbaz olarak ısıtılmış (~ 80 ve de 100 ml paraformaldehid ilk çözücü 8 g tarafından Pagano tesbit çözeltisi hazırlamakg, C) GKD 2 O. NaOH çözünürleştirme teşvik ve hafifçe karıştırın konsantre 1-3 damla ekleyin. Bir kez 500 mM sakaroz, 100 mM Hepes, pH 7.4, 50 mM MgCl2, 250 mM sakaroz, 50 mM Hepes içinde% 4 paraformaldehid bir nihai konsantrasyon için 5 mM KCl, olduğu bir çözelti ile% 8 paraformaldehid çözelti 1:1 Karışım çözündürülmüş , 25 mM MgCl2, 2.5 mM KCI, pH 7.4.
  2. Eksplantlar 37 ° C'ye Pagano düzeltme çözüm ısıtmak düzeltmek için Hızla de her kültürden DMEM/F12 medyanın en çıkarmak ve eksplant her kuyucuğa Pagano Fix 5 ml ekleyin. Düzeltme tamamen her eksplant kapsayacak emin olun. Oda sıcaklığında 1 saat için düzeltildi. Önceki fiksasyon 1 hr filtresinden eksplantlar çıkarmayın.
  3. Tespit Pagano düzeltme çözüm kaldırmak ve sabit olmayan Pagano çözeltisi (250 mM sukroz, 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 2.5 mM KCI, pH 7.4) ile değiştirin sonra. Gömme kadar 4 azından% 10 sodyum azid ve mağaza ° C'de bir kaç damla ekleyin.

4. Gömme ve SHistoloji için ectioning

  1. Ilık su (55-60 ° C), 100 ml buzağı cilt jelatin 10 g çözücü ile bir% 10 buzağı cilt jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözündüğünü kadar ° C ve girdap aralıklarla 60 için ayarlanmış bir sıcak plaka üzerinde jelatin solüsyonu yerleştirin.
  2. 10 cm'lik Petri kabı içine alt% 10 jelatin solüsyonu, yaklaşık 10 ml dökülür ve 30 dakika katılaşmaya izin. Bu eksplantlar gömmek için bir "pad" oluşturacak. Bu pedler önceden hazırlanmış gün olması ve 4 ° C'de depolanabilir Petri kabı alt kısmında bir ızgara çizmek ve ızgara her kutuya tek eksplantlar aktarmak için bir cetvel kullanın. Rezidüel Pagano çözüm çıkarın ve bir pipet kullanarak, sıcak% 10 jelatin çözeltisi ile her eksplant kapak ve katılaşmaya izin. Her eksplant tamamen çok fazla kerede jelatin sıcak ilave edilmesi ile ped erime vermemeye dikkat ederek, jelatin ile çevrelenmiştir kadar jelatin çözeltisinin yavaş ilavesi devam edin. ~ 1 saat için sertleşmesine jelatin için izin ver. Bir kez münferit sertleştirilmişKitabında eksplantları jelatin küçük bloklar halinde kesip olabilir. Bloklar daha sonra önce bir vibratome ile kesit 24-48 saat süreyle düzeltmek Pagano yayınladığınız-sabittir.
  3. Jelatin blok Eksplantlarından koku ampul kadar konumlandırılmış ve 100 mikron kalınlığında koronal düzlemde kesitler vardır. Bölümleri toplanan ve saklanan PBS içinde 4 az +% 0,1 sodyum azid ° C immunohistokimyasal işleme kadar.
  4. Immünohistokimyasal algılama bir 24 gözlü bir levha (kuyu başına 2-3 bölümleri) bölümleri içine aktarılması ile gerçekleştirilir. İlk blok non-spesifik antikor 0.5 ml PBST ekleyerek bağlayıcı + B nazik sallayarak her şey, inkübe 1 hr (PBS +% 0.5 Triton X 100 ve% 2 BSA). Uygun birincil antikor daha sonra PBST + B ile seyreltilir ve çukur başına 0.4 ml RT'de bir gece kuluçka için ilave edilir. Birincil 3X PBS en azından 10 dakika için her bir yıkama ile yıkanmıştır. İkincil antikor ve 2 ug / ml Hoechst 33342 leke nükleer sonra PBST + B ile seyreltilir ve numuneler oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmektedirnazik sallayarak ile. PBS üç yıkama (her biri 10 dakika) yapılmakta ve daha sonra bölümleri ile% 90 gliserol, 50 mM Tris pH7.4, montaj ortamı kullanarak kaydıraklar üzerinde monte edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Embriyonik kemirgen korteks gelişim dönemi boyunca bir enine nörogenetik degrade sergiler, öyle ki yanal neokorteks dorsal medial neokorteks 28 yaklaşık 1 gün daha olgun olduğunu. Katman 6 nöronların toplu böylece lateral korteks bölgesindeki E12 üzerinde (ayrıca Saha 40 5 denir) ve E13 de dorsal medial korteks (ayrıca Tarla 1 5 denir) (S-fazı nihai sergilemek gibi) oluşturulur. Preplate yarma Katman 6 nöron üretimi yaklaşık 1 gün sonra başlar ve böylece E13 üzerinde lateral korteks ve E14 üzerinde dorsal korteks başlatılır. Preplate yarma ve kortikal plaka geliştirme başlatılması incelemek için, biz bir dilim eksplant tahlil 21,24 güncellenmiştir genelinde hemisferlerin E13 dan E15 (Şekil 1) tipik olarak ekildi böyle.

Biz bütün yarımküre eksplantları d büyüme inceleyerek kortikal eksplant tekniğin yaşayabilirliği testTg (Eomes :: eGFP) GSAT farelerde (Şekil 2) erived. Bu fare zorlanma eksitatör kortikal soy 7,29,30 olgunlaşmamış nöronlar raporları transgen içerir. Tüm olarak yarıküre kortikal eksplantlar dorsal neokorteks (Şekil 2A) içinde bölme preplate önce bir zaman noktasında, E13 hazırlandı. Aynı soydan Kortikal eksplantlar 2 DIV bir süre boyunca sırayla sabit ve daha sonra histolojik analiz için işleme damla edildi. İlk analiz zaman noktasında (DIV 0) At, preplate yarma henüz Tarla 1 (; Şekil 2A, 2E Dorsal neokorteks) oluşmamıştır. 1 DIV tarafından CP (Şekil 2B, 2C, 2F, 2G) açıktır ve 2 DIV (Şekil 2D, 2H) kadar büyümeye devam ediyor. Böylece bütün yarımkürede eksplantlar iki gün serebral korteksin olgunlaşması için E13 desteği başlangıçta kültüre ve dorsal neokortekste preplate bölme yakalar.

Norm onaylamak içindorsal neokortekste al histolojik gelişimi, biz kondroitin sülfat proteoglikan (CSPGs), ayrıca PP ve türevleri MZ ve SP 8,31,32 bir belirteçtir bir ekstrasellüler matriks bileşeni için 2 DIV eksplant immunohistokimyasal. CSPGs için immün in vitro kültür periyodu (Şekil 3A-3C) in sırasında MZ ve SP içine PP uygun bölme belirten dorsal kortekste immünreaktivitesi CSPG iki grup ortaya koymaktadır. PP transkripsiyon faktörleri Ctip2 ve Tbr1 7,33,34 ifade bilinmektedir L6 kortikal nöronlar tarafından bölünür. Bu belirteçlerin (Şekil 3B-3F, 3G-I, sırasıyla) immünboyama desen yeni kurulan CP bu transkripsiyon faktörlerinin uygun bir ifade ile onaylar. Birlikte bu analizler bütün yarımkürede eksplantlar organotipik erken kortikal gelişim onaylayın.

Utero electroporations yaygın olarak kullanılmaktadırGelişmekte olan korteks 35 hücre özerk gen fonksiyonu için tahlil etmek. Bu nedenle elektroporasyon başarıyla bütün yarımkürede eksplant modelinde nöron transfekte olabilir olmadığını test. Bozulmamış E13 embriyoların sol ventrikül nöronal öncülerine plazmid DNA tanıtmak için 0.33 mg / ml CAG-GFP plazmid ve electroporated (Yöntem bakınız) enjekte edildi bu hat lateral ventrikül (Şekil 1A). 2 DIV sonra eksplantlar histolojik analiz için sabit ve kesitli düştü. Bu zaman noktasında, GFP ifade eden hücrelerin beyin duvar (Şekil 4A-4C) üzerindeki tüm kortikal bölgelerinde tespit edilmiştir. Yoğun GFP ifade eden hücrelerin IZ ve CP olmadığı gözlenmiştir GFP tanımı VZ nöronal öncülerden gözlenebilir. Önemli olarak, çok sayıda GFP + nöronlar ortaya çıkan dendrit ve akson ile şekillendirme CP üst gözlenmiştir. Hücreler CP ve MZ indicatin arasındaki arayüzde bir ayrık katman oluşturdularg Uygun göç tutuklama ve laminasyon (Şekil 4A-4C, oklar). Corticofugal aksonlar CP altında ve IZ (Şekil 4A-4C ve 5 de Kilavuz Film S1 bakınız) içine doğru ise dendrit MZ uzanıyordu. Farklılaşan hücreler radyal glial lifleri yan yana iki kutuplu bir morfolojiye sahip nöronlar ve bunları aşağıda, IZ multipolar nöronlar (Şekil 4D-4F) dahil olmak üzere vade farklı eyalette, GFP + hücreler aşağıda. Buna ek olarak, dendrit ECM protein Reelin (Şekil 4G-4I) uygun şekilde immünolokalize olan MZ içine uzanan görülmektedir. Elektroporasyon ve eksplant koşulları dolayısıyla olgunlaşmamış ayırt nörona nöron göç etmek habercisi aşamalarında kortikal nöronların normal gelişimini izin verir.

Elektroporasyonun zamanda, (E13) dorsal neokortikal VZ tarafından üretilen nöronlarının% 100 L6 nöronlar, nöronlardırO PP 5 bölün. Başarılı elektroporasyon yapıları hemen öncesinde 6 saat boyunca nöronları girmiş olmalıdır, ya da, hücre döngüsünün M-faz 36. Bu nedenle ilk postmitotik, GFP + dorsal korteks (Field 1) E13 elektroporasyon ardından nöronların oluşturucu CP doldurmak gerektiği tahmin edilmektedir. Böyle nöronlar protokolü güvenilir kendi göç ve olgunlaşma çalışmaları için L6 kortikal nöronlar hedef belirten (Şekil 4) gözlenmiştir.

Elektroporasyon / eksplant prosedürün "başarı oranı" tahmin etmek bizim laboratuarımızda bir soruşturma analiz. Bu çalışma esnasında, eksplantlar 21 litre 248 embriyo toplam CAG-GFP ile (yukarıda açıklandığı gibi) electroporated edildi hazırlanmış, ve her bir embriyo tek bir hemisfer eksplant hazırlanmıştır. Orijinal 248 eksplant, 195 (% 79) görüntüleme ve analiz için uygun olduğuna karar verildi. 53 yaklaşık yarısıanaliz edilemedi eksplantlar GFP ifade başarısız veya yanlış hedefli GFP ifade vardı. Kalan zarar kültür filtre veya histolojik işleme ile ilişkili sorunlar dekolmanı eksplantasyona nedeniyle dismorfik büyüme tarafından açıklanmıştır. Yaklaşık% 80 arasında bu başarı oranı (Şekil 5), farmakolojik çalışmalar 26 için uygun eksplant sistem, aynı zamanda kortikal olumsuz erken gelişme etkileyen mutasyonların resesif 7 analiz hale gelmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Ex utero elektroporasyon ile Tüm yarımkürede eksplant prosedürü. A) E13 fare embriyoları bir plazmid DNA solüsyonu enjekte edilerek electroporated edilir. Beyinleri ve sagitally transeksiyon edilir. Electroporatedhemisfer sonra filtre kaplı bir kollajen üzerinde medial tarafı aşağı yerleştirilir ve 2 DIV için kültüre edilir. Hemisferler sonra histoloji ve sonraki görüntü analiz için canlı görüntülü veya sabit olabilir. B) altı iyi doku kültürü çanak. C) eksplant ile altı iyi yemeğin yüksek oksijen ortamında yerleştirilen üç filtre üzerine yerleştirilen 10 eksplant bir fotoğraf (% 95 O2 /% 5 CO2) daha sonra standart bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde doku kültürü yerleştirilen bir Billups-Rothenberg inkübatör içinde.

Şekil 2,
Şekil 2. Eomes tek bir çöp :: eGFP embriyo türetilmiştir bütün yarımkürede eksplantlar kortikal plaka Organotipik büyüme. A, E) kült başında bir damla sabit beyninden bir koronal bölümü ure dönemi (O DIV). PP mevcut olduğunu ancak CP oluşturmak için henüz unutmayın. Yeşil sinyal olgunlaşmamış eksitatör nöronların GFP ifade tarafından üretilen ve mavi tüm hücrelerin çekirdeğinde etiketler Hoechst boyalı olmasıdır. B, F). Kesik çizgiler ile gösterilen CP büyüme, 1 DIV (C ve G) ve 2 DIV (panel B ve H) 0.5 DIV ve artışlar görülmüştür. Proliferasyon gösteren, panel MS hücre etki ifade GFP daha kalın olması dikkat ve eksplant olarak eksitatör nöron soy farklılaşma. Ölçek çubukları 500 mikron (panel A) ve 50 um (panel H) vardır. Kısaltmalar: CP, Kortikal Levha; IZ, Orta Bölge, MZ, Marjinal Zon; SP, Subplate; VZ, Ventriküler Bölgesi.

/ 50271/50271fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Bütün yarımkürede eksplantlar Preplate bölme. AC) Kondroitin sülfat proteoglikan (CSPG) immun yeni kurulan CP transkripsiyon faktörü Ctip2 İfade MZ ve SP. DF içine PP bölme (bölme)) göstermektedir. GI) İfadesi yeni kurulan CP transkripsiyon faktörü Tbr1. Ölçek çubuklar paneller C, F, I 50 mm'dir.

Şekil 4,
Şekil 4. 2 DIV sonra E13 ex utero elektroporasyon sonra bütün yarımkürede eksplantlar GFP. AC) GFP. CP üst (oklar). DF) Nestin (kırmızı) immunoreactiv de oluşturan kortikal nöronların tabakası NotBir bütün yarıküre eksplant türetilen bir kısım halinde bir bütün yarıküre eksplant bir bölümü içinde Sığ. GH) Reelin (kırmızı) immünoreaktivitesi. Paneller C, F ve I Ölçek çubuklar 50 mm'dir.

Şekil 5,
Şekil 5,. Dorsal medial korteks (Alan 1) ex utero electroporations hedefleme Değişkenliği. Tek bir çöp arasından Eleven embriyolar CAG-GFP construct (0.33 mg / ml) ve tüm yarımküre eksplant olarak kültüre sahip electroporated edildi. AI) onbir eksplant Dokuz gösterdi dorsal medial kortekste GFP ifade. GFP eksplant arasında farklılıklar göstermekle beraber, her eksplant GFP her üç kortikal bölgelerinde (VZ, IZ ve CP) tespit edilir. Ölçek çubuğu paneli A 50 mikron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz gelişmiş ve deneysel modelini değerlendirdi - Bütün yarımkürede eksplantlar - erken kortikal gelişim çalışması için (E13-E15). Modeli serebral korteks 25,37 tabaka 6 teşkil eksitatör nöron soy göç ve farklılaşma analizi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sistemin prensibi avantajları hazırlık sadeliği ve beyin gelişiminin bu erken, kritik döneminde elektroporasyon, Farmakolojik manipulasyon ve görüntüleme için nöronlara 3) deneysel erişim)) 2 DIV organotipik büyüme, 2 1 vardır. Biz morfolojisi, yönelim ve preplate bölme döneminde katmanı 6 kortikal nöronların 7,38 arasında dendritik büyüme ince farklar belgelemek için sistemi kullanılmış.

Katman 6 doldurmak eksitatör nöronlar büyük oranda dorsal talamus 39,40 karşılıklı girdi sağlayan kortikotalamik projeksiyon nöronları oluşmaktadır 41 Sinir fonksiyonu senkronizasyon işlevsel katılmak için öne sürülmüştür. Bu nöronların fizyolojik uzman olmasına rağmen, katman oluşturma, göç ve olgunlaşma sürecini 6 nöron katmanları korteksin 2-6 tüm eksitatör nöronlar ile hisse temel özellikleri. Özellikle, tüm kortikal eksitatör nöronlar dorsal telencephalic VZ üretilir, çok kutuplu nöron olarak IZ yoluyla göç, ve CP 7 içinde ayırt. Pax6, Tbr2, ve Tbr1 29: eksitatör kortikal nöronlarda olgunlaşma bir çekirdek sıralı olarak ifade edilen transkripsiyon faktörlerinin grubu tarafından tahrik edilir. Bu dizi katmanları 2-6 42 Tüm eksitatör nöronlar tarafından paylaşılan ve biz yeni kurulan CP (Şekil 3G-3I) olarak Tbr1 arasında uygun bir ifade onaylanır. Katmanı 6 kortikal nöronların gelişimi araştırmak için bu yaklaşım kullanılması dolayısıyla neu gelişimi içine uçucu anlayışlar sunmalıdırTüm kortikal katmanları oluşturmaktadır Rons.

Tüm yarımkürede eksplantları kortikal nöron geliştirme çalışmaları için mevcut yaklaşımlar tamamlayacak. Önceki çalışmalarda 1 DIV 22,23 için kortikal gelişim incelemek için bir E14 bütün yarımkürede eksplant yaklaşımı istihdam var. Biz L6 oluşumu ve preplate bölme döneminde kortikal gelişim 2 gün araştırmak ex utero elektroporasyon ile tüm hemisfer eksplantlar birleştiğinde var. E13 de utero electroporations içinde tersine, bütün yarımkürede eksplant izledi ex utero electroporations başarı oranı yüksektir: Elimizdeki biz dorsal telencephalon elektroporasyonla hedefleme ~% 80 başarı elde. Ayrıca, utero electroporations bir sağkalım ameliyat gerektiren ve bütün yarımkürede eski utero yaklaşımı çok daha fazla teknik çaba gerektirebilir. Nihayet, utero çalışmalarda hassas farmakolojik kolayca uygun değildirmanipülasyonlar ve görüntüleme yaklaşımlar. Ilaçlar ve uygun konsantrasyonlarda moleküler ajanlar (ekspresyon vektörleri, susturma yapılar, vs) teslim ya da aktivasyonu için hassas geçici kontrol bütün yarıküre eksplantlar verilmiştir, fakat utero elde etmek için daha çok zordur. Böyle manipülasyon yarattığı etkileri optik izleme Canlı, mikron aralığında uzaysal çözünürlüğü ile, kolayca EUEP ile kullanılabilir, ancak IUEP değildir. Böyle hassas ölçüde kortikal gelişimi ve işlevi ile ilgili deneyler toplanan veri yorumlama gücünü geliştirmek için muhtemeldir. Böylece erken kortikal gelişim bütün yarımkürede eksplant çalışmalar için de utero yaklaşım üzerinde farklı deneysel avantaja sahiptir. Bu zamanda, ancak, için veri toplama> 48 saat, dilim eksplantlar ve utero yaklaşımlar gerektiren üst katman kortikal nöronlarda ve deney çalışmaları tercih kalır.

Var Bütün yarımkürede eksplant tekniğin başarısı için çok kritik gereksinimleri. Birincisi, eksplant büyüme menenjlerin mekanik bütünlüğü son derece duyarlıdır. Meninksler fiziksel hasar (yani delinmesi veya gözyaşları) en azından temel korteksin yerel kalkınma bozacaktır. İkincisi, eksplant büyümenin kültürün içinde medyanın toplam hacme duyarlı: çok medya eksplantlar filtre kurtulmuşsa ve çarpık CP mimarisi geliştirecek; çok az medya ve eksplantlar ile aşırı hücre ölümü kurutmak ve yaşama olasılığı vardır . Son olarak, mevcut tekniği eksplantlar ile biz 2 DIV kortikal büyüme belgeledi. Çok değerli araştırmalar itiraf rağmen, bu gelişim zaman penceresi E13 başlayınca, önceden sinaptogenez ve kanonik Nöronal haberleşmeyi bir döneme analizler kısıtlar. E14.5 ekspres birçok mRNA'ların de kortikal nöronların (sinaptik proteinleri kodlayan rağmenw.genepaint.org "target =" _blank "> www.genepaint.org), sinaptogenez lateral korteks ~ E15 kadar başlamaz ve bu sinaptogenez oldukça katman 6 nöronlar 43 daha hücreleri preplate sınırlıdır. ilgili bazı kritik sorular Kortikal sinaps oluşumu ve işlevi bu nedenle bütün yarıküre eksplant sistem ile şu anda adreslenebilir değildir.

Sonuç olarak, tüm yarımküre eksplant hazırlama lezyonların kalıtımsal fare modellerinde erken gelişme kortikal araştırmak için güvenilir ve tutarlı bir şekilde kullanılabilirler. Bu teknik, RNAi, shRNA, ve diğer moleküler ve farmakolojik manipülasyonlar kolaylıkla adapte edilebilir. Bütün yarımkürede eksplant de uygulanabilir rekombinant protein, ilaçlar ve çevresel toksinler içeren çalışmalar için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu eser NINDS (NS066071) ve NIAAA hibe desteklenmiştir. (P50AA017823) ECO. Yazarlar, Dr Robert Quinn ve hayvan bakımı Laboratuar Hayvan Kaynakları Bölümü personel teşekkür. Biz Yaz Lisans Araştırma Görevlisi (SURF) gibi yardım için, teknik destek için Nicole Belletier Judson Belmont ederim. Biz de yorum yapmak için Dr David Cameron teşekkür yazının önceki bir sürümünde düzenler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX GIBCO 10565
G5 Supplement 100X Invitrogen 17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X Invitrogen 1504-044
Pen / Strep Liquid 100X Invitrogen 15140-122
HBSS 500 ml GIBCO 14025
Culture insert collagen coated Costar 3492
Bovine skin gelatin Sigma G9382
H–chst 33342 Invitrogen H1399
Bovine Serum Albumin Sigma 7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Equipment
BTX 830 Electroporator Harvard Apparatus 450052
Tweezer electrodes 10mm Harvard Apparatus 450166
Incubator Billups Rothenberg MIC-101
Hamilton syringe (5uL) Hamilton 87930
Hamilton syringe needle Hamilton 7803-04 Specify 1" and style 4
Dumont #5 Forceps FST 11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm FST 14058-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
  2. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
  3. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
  4. Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
  5. Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
  6. Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
  7. Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
  8. Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
  9. Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
  10. Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
  11. Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
  12. Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
  13. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  14. O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
  15. Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
  16. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  17. Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
  18. Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
  19. Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
  20. Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
  21. Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
  22. Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
  23. Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
  24. Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
  25. O'Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
  26. Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
  27. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
  28. Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
  29. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  30. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
  31. Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
  32. Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
  33. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
  34. McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
  35. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  36. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
  37. Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
  38. O'Dell, R., et al. Society for Neuroscience. , Washington D.C. (2011).
  39. Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
  40. Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
  41. Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
  42. Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
  43. Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).

Tags

Nörobilim Sayı 74 Genetik Nörobiyoloji Gelişim Biyolojisi Anatomi Fizyoloji Moleküler Biyoloji Hücre Biyolojisi Biyomühendislik Doku Mühendisliği preplate yarma, dendritogenesis gen fonksiyonu testi, GFP yarımküre eksplantlar gen ekspresyonu plazmid eksplant doku hücre kültürü doku kültürü hayvan modeli
<em>Eski utero</em> Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nichols, A. J., O'Dell, R. S.,… More

Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development. J. Vis. Exp. (74), e50271, doi:10.3791/50271 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter