Summary
이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를 설명합니다
Abstract
대뇌 피질의 개발은 뉴런과 전구체 세포, 혈관, meninges 및 관련 세포 외 기질 등의 비 neuronal 요소들 간의 복잡한 상호 작용을 포함한다. 그들은 적절한 organotypic 환경을 제공하기 때문에, 대뇌 피질의 슬라이스 explants는 종종 neuronal 차별화 및 개발을 제어 이러한 상호 작용을 조사하는 데 사용됩니다. 이익이지만, 슬라이스 explant 모델은 비정상 세포 적층 및 마이그레이션 등의 단점으로 고생 할 수 있습니다. 여기 대뇌 피질의 조각과 쇼 일관 organotypic 마이그레이션 및 적층보다 준비하는 것이 더 쉽습니다 초기 대뇌 피질의 개발 연구 전체 대뇌 반구의 explant 시스템을보고합니다. 이 모델 시스템에서 초기 적층 및 마이그레이션 패턴, preplate 분할의 기간을 포함하여, 체외에서 2 일 동안 일반적으로 미래의 대뇌 피질 층 중 여섯 양식을 진행합니다. 우리는 전 자궁의 electroporation (EUEP)를 개발등쪽 내측 피질에서 개발 뉴런에 GFP 표현을 타겟팅 ~ 80 %의 성공을 달성 접근.
전체 반구의 explant 모델은 electroporation, 약리 개입 및 라이브 영상 방식의 접근이 초기 대뇌 피질의 개발을합니다. 이 방법은 transfection 및 면적 타겟 일관성을 모두 개선하면서 자궁 electroporation (IUEP) 접근 방식에서 요구 생존 수술을 방지합니다. 이 방법은 neuronal 확산, 이전과 차별화의 실험 연구를 촉진합니다.
Introduction
연속 생성 뉴런의 공동 확산, 이전과 차별화를 통해 포유류의 대뇌 피질 양식. 각 신경 세포는 심실 구역 (VZ)에서 태어나 대뇌 피질 판 (CP) 1을 형성 중간 영역 (IZ)로 VZ에서 마이그레이션합니다.합니다 그들은 다른 대뇌 피질의 도메인을 통과으로, 마이그레이션 뉴런은 개발 조직 내의 세포 환경 및 기타 휴대 요소 (예 : 반경 glia)에 따라 마이그레이션 2,3의 여러 모드를 표시합니다. 대뇌 피질의 뉴런는 neuronal 마이그레이션 체포와 dendritogenesis (4)의 일치 과정에있는 성형 대뇌 피질 판의 상단에있는 마이그레이션을 체포.
대뇌 피질의 개발은 배아 일 원시 plexiform 계층 6 preplate (PP), 그 overlies VZ 선구자 뉴런의 층의 설립을 통해 11-13 (E11-13) 5 사이에 시작됩니다. 예기되는그런 다음 레이어 6 대뇌 피질의 뉴런 (VZ에서 태어난 즉, 첫 번째 대뇌 피질의 뉴런) 방향이 틀에 박힌 패턴의 somata와 PP 7 ~ 뚜렷한 층으로 뭉쳤다. 이러한 이벤트는 얕은 한계 (미래 대뇌 피질의 레이어 1)과 깊은 구역, subplate 세포 (과도 대뇌 피질의 레이어 7)로 구성 후자에 preplate를 나누었습니다. 이 과정은, preplate 분할이라고한다, 대뇌 피질 (8)의 미래 성장의 기초 행사입니다.
많은 유전자 변이는 대뇌 피질의 발달 9의 다양한 측면을 방해하는 확인되었습니다. 대뇌 피질의 개발은 또한 부정적인 등 코카인 10 술 11 등의 섭취 독소에 노출에 의해 영향을 수 있습니다. 개발하는 동안 발생하는 대뇌 피질의 기형은 신경 장애 (예 : 자폐증, 정신 분열증)에 가능성이 참여자 때문에, 대뇌 피질의 발달에 섭동의 경험적 조사는 고유 아르중요한 그겁니다. 그것은 유전이나 독소 효과의 빠른 assays을 허용뿐만 아니라 두뇌 개발 12이 초기 기간 동안 차별화 뉴런, 다른 세포 유형과 세포 외 기질 (ECM) 사이의 가능한 상호 작용을 보존 그 대뇌 피질의 개발을 공부하는 방법을 설정하는 데 상당한 중요성을 따라서입니다 .
슬라이스 explants 13 이러한 시스템을 제공하고 광범위하게 분석 대뇌 피질의 신경 세포 개발에 14-16로 사용되었습니다. 그러나, 슬라이스 assays는 neuronal 마이그레이션 및 적층이 가능 개발 뇌와 앵커 반경 glial 비계를 둘러싼 수막 세포에 손상으로 인해 17 이상이 될 수있는 단점으로 고생 할 수 있습니다. 레이디 얼 glial 섬유가 썰기하여 기저 얇은 판의 대뇌 피질의 신경 세포 이주 18 혼란의 중요한 기판 있으므로 로컬 반경 glial 아키텍처를 중단시키고 변경된 대뇌 피질의 마이그레이션 될 수 있습니다. 또한 SLI에게의explants의 ced 표면이 분야에서 ECM의 일반적인 구성을 변경할 수 있습니다 죽은 세포의 영역을 제공합니다.
최근 접근법은 적절한 건강 셀 유형 및 ECM으로 둘러싸여있는 통에 깊숙히 자리 세포에 자신의 분석을 집중하고 있습니다. 그러나 경우에 이러한 새로운 접근법은 슬라이스의 비교적 정상적인 내부는 분석 19-21에 사용할 수 있습니다 있도록 원래의 두꺼운 교양 슬라이스 고정 후 cryo-sectioned 또는 파라핀-sectioned 할 것을 요구 할 수 있습니다. 문화뿐만 아니라 분석을위한 고정 슬라이스의 후속 cryosectioning의 라이브 조각을 준비하는 sectioning 원래 vibratome 모두는 이러한 assays에 대한 관심과 노력이 작동해야합니다.
초기 대뇌 피질의 개발 연구 간단한 보완 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 촉진하기 위해 기존 슬라이스 방식이 13으로 바뀌 었습니다. 우리는 대체를 개발65분 당 회전하고 16-18 시간 22,23에 대한 허용 organotypic 성장에 떨고 문화를 포함하여 기존 E14 전체 반구의 모델과 비슷한 OLE 반구의 explant 모델입니다. 우리의 접근 방식에 전체 반구의 explants은 48 시간에 organotypic 대뇌 피질의 성장을 확장하는 높은 산소 문화 분위기 21,24에서와 반 투과성 막 13에 표시됩니다. 이 방법은 또한 대뇌 피질의 뉴런을 개발 일관된 electroporation 할 수 있습니다. 태아는 자궁에서 제거 플라스미드 DNA를 소개 electroporated과 telencephalon 그 다음 해부되어 있습니다. 각 반구의 고립과 콜라겐 코팅 필터 안쪽면을 아래로 배치됩니다. explant 그런 다음 48 시간, preplate 분할 8 포함 기간 동안 배양하고 있습니다. 문화 기간 동안 L6 뉴런은 대뇌 피질 판에서 올바른 위치에 차별화 된 뉴런 25 일에 구체에서 개발할 수 있습니다. 이 기간 개발 전반에 걸쳐신경 세포는 생체의 해당 셀을 직면 것이다 적절한 ECM과 세포 유형으로 둘러싸여 있습니다. 이 시스템은 이미 에탄올 독성 26 층 6 형성과 preplate 분할 7,25를 기초 세포 사건을 해독에서 중요한 입증했다.
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Protocol
플라스미드 녹색 형광 단백질 표현 1. 예를 자궁에 Electroporations
- 플라스미드 DNA 주입 솔루션은 ddH 2 O.에서 0.33 MG / ML의 최종 작업 농도로 희석 편대의 편대장-eGFP DNA 27와 함께 준비가되어 있습니다 Qiagen 엔도 - 무료 맥시 - 최상의 상태로 준비가 변형 박테리아의 플라스미드를 정화하는 데 사용됩니다. ~ 0.02 % (w / V 최종)에서 고속 녹색 염료는 주입 추적과 DNA 솔루션에 추가됩니다.
- 외과 영역을 준비하려면 70 % 에탄올 솔루션으로 벤치 상단과 해부 현미경 단계를 스프레이 건조 닦으십시오. 이전 해부 70 %의 에탄올과 수술 가위와 집게를 뿌려서 건조 닦으십시오.
- 모든 운동은 적어도 1 분 동안 중단 될 때까지 시간이 초과되었습니다 임산부 스위스 / 웹스터 댐은 가압 실린더에서 CO 2로 가득하고 댐이 모니터링되는 챔버 내로 송금 E13에 희생되어 있습니다. CO 2 흡입에 의해 희생 한 후에 태아는 자궁에서 제거하고에 배치10cm 페트리 접시가 포함 된 얼음 차가운 행크스 균형 잡힌 생리 식염수 (HBSS).
- 조심스럽게 주변 extraembryonic 멤브레인의 각 배아를 해부하고 얼음처럼 차가운 HBSS에 유의하시기 바랍니다.
- 차가운 HBSS를 포함하는 두 번째 10cm 페트리 접시에 각각 배아를 전송합니다. 향후 분석을 위해 대뇌 피질의 지역에서 spatially 별도의 대뇌 피질의 영역에 주입 관리하고, 왼쪽 대뇌 반구의 심실에 DNA 빠른 녹색 혼합물로부터 2-3 μl를 삽입하기 위해 해밀턴 주사기를 사용하십시오.
- electroporate하려면, 포셉으로 부드럽게 배를 잡고 가볍게 머리의 등 중간 선에 트위터 전극의 긍정적 인 패들 넣고 가볍게 배아 턱 아래에있는 부정적인 패들 놓습니다. Electroporations는 950 밀리 초 간격으로 구분 된 50 밀리 초 기간 다섯 30 V 펄스를 제공하는 프로그램 BTX830 electroporator으로 달성된다. 이러한 설정은 BTX830 모델입니다. 다른 시스템은 제조업체의 instructio에 따라 사용할 수 있습니다NS.
2. 전체 반구의 Explant 준비
- electroporation 후 배아는 얼음처럼 차가운 HBSS에 다시 배치됩니다. 뇌는 배아의 머리에서 피부와 연골 성의 두개골을 제거하는 두 # 5 보석의 집게를 사용하여 제거됩니다. forcep는 다음 두개골에서 그대로 뇌를 제거하는 뇌 아래에 하락하고 있습니다. electroporated 반구는 (왼쪽)가 뇌에서 떨어져 해부되고 첨부 된 중간 뇌 조직은 제거됩니다. 분해 절차 관리를 통해 왼쪽 대뇌 피질 반구를 놓인 meninges을 손상하지 않도록 이루어집니다.
- 일단 각 배아는 절단 한 ML 피펫 팁과 pipettor를 사용하여 HBSS에 전송됩니다 해부 했어요. 반구는 부드럽게 콜라겐 코팅 문화 삽입에 퇴학하고 있습니다. 최대 6 개의 반구의 explants에 각 24mm 삽입에 안쪽면을 아래로 배열된다. 일단 배치, 초과 HBSS는 삽입에서 제거되고 삽입 나서 잘 6 잘 요리 중 하나가 35mm에 배치됩니다. 잘은 EXA가 포함되어 있습니다미디어 ctly 2.7 ML : DMEM-F12 미디어 Glutamax을 포함하고있는 2 % B-27, 1 % G5와 1% 페니실린 - 패 혈성 보충. 잘에서 미디어의 몇 방울은 각 explant의 상단에 pipetted 수 있지만 잘 따라 원래의 2.7 ML를 초과 미디어를 추가하지 않습니다.
- explants가 콜라겐 필터에 배치 한 후 explants를 포함하는 6도 요리는 Billups 로텐 버그 (BR) 챔버 (또한 물을 증발 접시를 포함)에 배치됩니다. 95 % / 5 %의 산소 / CO 2 가스 혼합물은 챔버 시스템 종료를 밀폐하고 95 % / 5 % 산소 / CO 2 가스 공급 튜브를 분리하기 전에 적어도 1 분 동안 챔버 내로 주입된다. BR 챔버는 다음 문화 시대, 1-2 DIV의 나머지 부분에 대해 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 배치됩니다.
3. 조직학에 대한 Explant 조직의 고정
- 연기 후드에 preheated (~ 80 & 드의 100 ML에 paraformaldehyde의 첫 solubilizing 8g하여 Pagano 고정 솔루션을 준비g, C) ddH 2 O. NaOH는 solubilization을 홍보하고 부드럽게 저어하는 집중 1-3 방울을 추가합니다. 일단 500 밀리미터 자당, 100 밀리미터 Hepes, 산도 7.4, 50 MM MgCl 2, 250 밀리미터 자당 50 밀리미터 Hepes의 4 % paraformaldehyde의 최종 농도 5 밀리미터 KCl이 그 솔루션을 8 % paraformaldehyde 솔루션 1:1 혼합 solubilized , 25 MM MgCl 2, 2.5 MM KCl, pH를 7.4.
- explants이 37 ° C.에 Pagano 수정 솔루션을 따뜻하게 해결하려면 신속하게 잘 각 문화에서 DMEM/F12 미디어의 대부분을 제거하고 explants의 각 잘에 Pagano의 수정의 5 ML을 추가합니다. 수정에 완전히 각 explant를 커버해야합니다. RT에서 1 시간 수정. 이전 고정 1 시간에 필터에서 explants를 제거하지 마십시오.
- 고정은 Pagano 수정 솔루션을 제거하고 수정없이 Pagano 솔루션 (250 밀리미터 자당 50 밀리미터 Hepes, 25 MM MgCl 2, 2.5 MM KCl, pH를 7.4)로 교체 한 후. 삽입 될 때까지 4에 10 %의 나트륨 azide 및 매장 ° C의 몇 방울을 추가합니다.
4. 삽입 및 S조직학에 대한 ectioning
- 따뜻한 물 (55-60 ° C)의 100 ML에 종아리 피부 젤라틴 10g을 solubilizing하여 10 % 송아지 가죽 젤라틴 솔루션을 준비합니다. solubilized까지 ° C와 소용돌이 정기적으로 60로 설정 핫 플레이트에 젤라틴 용액을 넣습니다.
- 10cm 페트리 접시의 바닥에 10 % 젤라틴 용액의 약 10 ML을 넣어 30 분 더욱 강화 할 수 있습니다. 이 explants를 삽입하기위한 "패드"를 형성합니다. 이 패드는 사전에 준비 일이, 4 ° C.에 저장 할 수 있습니다 페트리 접시의 바닥에 격자를 이끌어 그리드의 각 상자에 개별 explants를 전송하는 통치자를 사용합니다. 잔여 Pagano 솔루션을 제거하고 pipettor를 사용하여, 따뜻한 10% 젤라틴 솔루션으로 각 explant를 커버하고 더욱 강화 할 수 있습니다. 각 explant이 완전히 너무 한 번에 젤라틴 따뜻하게을 추가로 패드를 용해하지 돌보는, 젤라틴으로 둘러싸여 될 때까지 젤라틴 솔루션의 느린 또한을 다시 시작합니다. ~ 1 시간에 굳어 젤라틴을 위해 수 있습니다. 일단 individ 찼어, 무슨 일을 explants는 젤라틴의 작은 단위로 잘라 수 있습니다. 블록이 다음 사전 vibratome으로 sectioning에 24-48 시간에 대한 해결 Pagano에 게시 - 해결됩니다.
- 젤라틴 블록에서 Explants는 후각 망울을 위치 100 μm 두께의 코로나 비행기에서 sectioned 있습니다. 섹션 수집 및 저장됩니다 PBS 4시 + 0.1 % 나트륨 azide ° C immunohistochemical 처리까지.
- Immunohistochemical 감지가 24 잘 플레이트 (물론 당 2 ~ 3 개의 섹션)로 섹션을 전송하여 수행됩니다. 첫 번째 블록이 아닌 특정 항체 0.5 ML PBST를 추가하여 바인딩 + B 완만 한 진동 각 잘 길러 1 시간에 (PBS + 0.5 % 트리톤 X 100 2퍼센트 BSA). 적절한 기본 항체 그런 다음 PBST + B에 희석되어 잘 당 0.4 ML은 RT에서 하룻밤 배양에 추가됩니다. 기본은 3 배 PBS은 적어도 10 분마다 씻어 함께 씻어 수 있습니다. 차 항체와 2 μg / ML Hoechst 33342 얼룩 핵 그 다음 PBST + B에 희석되고 샘플은 RT에서 2 시간에 incubated 아르부드러운 진동과. 세 PBS 세차 (10 분마다)가 수행 된 다음 섹션은 90% 글리세롤 50 ㎜ 트리스, pH7.4, 장착 미디어를 사용 슬라이드에 장착되어 있습니다.
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Representative Results
배아 쥐 대뇌 피질의 발달 기간에 걸쳐 가로 neurogenetic 기울기를 전시 등 그 옆 네크로는 등쪽 내측 네크로 28 약 1 하루가 발전되어 있습니다. 레이어 6 뉴런의 일괄 따라서 측면 피질에 E12에 (또한 필드 40 5이라고도 함)과 E13의 등쪽 내측 피질 (또한 필드 1 5이라고도 함)에 (S-단계의 마지막을 전시 IE) 생성됩니다. Preplate 분류 레이어 6 신경 세포 생성 후 약 1 일 시작하므로 E13의 측면 피질과 E14의 등쪽 피질에서 시작됩니다. preplate 분할 및 대뇌 피질 판 개발의 개시를 연구하기 위해, 우리는 슬라이스 explant 분석 21,24으로 바뀌 었 전체 대뇌는 E13에서 E15 (그림 1)에 일반적으로 배양 된 있도록.
우리는 전체 반구의 explants D의 성장을 조사하여 대뇌 피질의 explant 기술의 가능성을 테스트TG (Eomes :: eGFP) Gsat 마우스 (그림 2)에서 erived. 이 마우스 변형은 흥분성의 피질 계보 (Lineage) 7,29,30의 미숙 뉴런를보고 transgene이 포함되어 있습니다. 전체 반구 대뇌 피질의 explants는 등쪽의 네크로 (그림 2A)에 분할을 preplate하기 전에 시점에서, E13에서 준비되었다. 같은 쓰레기에서 대뇌 피질의 explants은 2 DIV 기간 동안 순차적으로 고정 및 그 이후의 조직 학적 분석을 위해 처리 드롭했다. 초기 분석 시점 (DIV 0)에서 preplate 분할 아직 필드 1 (, 인물 2A, 2E 등쪽 네크로)에서 오류가 발생하지 않았습니다. 한 DIV에 의해 CP는 (그림 2B, 2C, 2 층, 2G) 명백하고, 2 DIV (그림 2D, 2H)으로 성장을 계속하고 있습니다. 따라서 전체 반구의 explants 이틀 대뇌 피질의 성숙을 위해 E13 지원에서 처음 배양과 등쪽의 네크로에 preplate 분할을 캡처합니다.
정을 확인하려면등쪽의 네크로에서 알 조직 학적 발전, 우리는 콘드로이틴 황산의 proteoglycans (CSPGs), 또한 PP 및 파생 상품 MZ와 SP 8,31,32의 설립 표시입니다 세포 외 기질 구성 요소에 대한이 DIV의 explants를 immunostained. CSPGs에 Immunostaining는 체외 문화 시대 (그림 3A-3C)의 기간 동안 MZ와 SP에 PP의 적절한 분할을 나타내는 등쪽의 피질에 immunoreactivity을 CSPG의 두 대역을 보여준다. PP는 전사 인자 Ctip2 및 Tbr1 7,33,34을 표현하는 것으로 알려진 대뇌 피질의 뉴런 L6에 의해 분할되어 있습니다. 이러한 마커 (그림 3D-3F, 3G-I, 각각)의 immunostaining 패턴은 새로 형성된 CP에서 이러한 전사 인자의 적절한 표현을 확인합니다. 함께 이러한 분석은 전체 반구의 explants에 organotypic 초기 대뇌 피질의 발전을 확인합니다.
자궁에 electroporations가 광범위하게 사용되어왔다개발 피질 35의 세포 자치 유전자 기능에 대한 분석합니다. 따라서 우리는 electroporation가 성공적으로 전체 반구의 explant 모델의 뉴런을 transfect 수 있는지의 여부도 테스트. 그대로 E13 배아의 왼쪽 심실은 neuronal 전구체에 플라스미드 DNA를 도입하는 0.33 MG / ML 편대의 편대장-GFP 플라스미드 및 electroporated (방법 참조)와 함께 주입 된 그 라인 측면 심실 (그림 1A). 이 DIV 후 explants은 조직 학적 분석을 위해 고정 및 sectioned 하락했다. 이 시점에서, GFP 표현 세포는 대뇌 벽 (그림 4A-4C)의 모든 대뇌 피질의 영역에서 관찰되었다. 강렬한 GFP 표현 세포 IZ와 CP에서 관찰하는 동안 GFP 표현은 VZ의 neuronal 전구체에서 관찰 될 수 있습니다. 중요한 것은, 수많은 GFP + 뉴런은 새로운 수석과 axons과 성형 CP의 상단에 관찰되었다. 세포는 CP와 MZ indicatin 사이의 인터페이스에서 분리 된 층을 형성g 적절한 마이그레이션 체포와 적층 (그림 4A-4C, 화살표). corticofugal axons은 CP 아래와 IZ (수치는 4A-4C 5도 보충 영화 S1 참조)로 확장하는 동안 수석이 MZ로 연장. 차별화 셀 반경 glial 섬유에 juxtaposed 바이폴라 형태로 뉴런, 그리고 아래에, IZ의 multipolar 뉴런 (그림 4D-4 층) 등의 성숙의 다양한 상태에 GFP + 세포하게됩니다. 또한, 수석는 ECM 단백질 Reelin합니다 (그림 4G-4I) 적절하게 immunolocalized입니다 MZ으로 확대 관찰됩니다. electroporation과 explant 조건 때문에 유치 차별화 신경 세포로 신경 세포를 마이그레이션하기 전구체의 단계를 통해 대뇌 피질의 뉴런의 정상적인 발전을 허용합니다.
electroporation시 (E13) 등쪽의 neocortical VZ에 의해 생성 된 뉴런의 100 % L6 뉴런, 뉴런 아르그 PP 5 분할. 성공적인 electroporation는 구조가 바로 이전에 6 시간 동안 뉴런에 소개 할 것을 요구하거나, 동안, 세포주기의 M-단계 36. 그것은 따라서 초기 postmitotic는 GFP + 등쪽의 피질 (필드 1) E13 electroporation에 따라 뉴런이 성형 CP를 생성해야한다는 것으로 예상된다. 이러한 뉴런은 프로토콜이 안정적으로의 마이그레이션과 성숙의 연구 L6 대뇌 피질의 뉴런을 타겟팅 할 수 있음을 나타냅니다 (그림 4) 관찰되었다.
electroporation / explant 절차의 "성공률"을 추정하기 위해 우리는 우리의 실험실에서 지속적인 조사를 분석했다. 그 연구의 과정에서 explants 21 litters는 248 배아의 총은 편대의 편대장-GFP으로 (위에서 설명한) electroporated되었다 준비되어 있으며, 각 배아에서 단일 반구의 explant이 준비되었습니다. 원래 248 explants 중, 195 (79 %)는 이미징 및 분석에 적합한 판단했다. 53 약 절반분석 할 수 없습니다 explants는 GFP를 표현하는 데 실패하거나 잘못 타겟 GFP 표현했다. 나머지 손실은 문화 필터, 또는 조직 학적 처리와 관련된 문제를 부대를 explant로 인해 기형적 인 성장으로 설명했다. 약 80 %이 성공률 (그림 5) 약리 연구 26에 적합 explant 시스템뿐만 아니라, 부정적인 초기 대뇌 피질의 발달에 영향을 미치지 열성 돌연변이 7 분석을 렌더링하고 있습니다.
1 그림. 예 자궁의 electroporation으로 전체 반구의 explant 절차. A) E13 마우스 배아는 플라스미드 DNA 솔루션을 주입하고 electroporated 있습니다. 머리가 해부하고 sagitally 가로로되어 있습니다. electroporated반구 그런 다음 필터 코팅 콜라겐에 안쪽면을 아래로 배치 2 DIV에 배양되어 있습니다. 뇌 그런 다음 조직 학적 소견과 이후의 영상 분석을 위해 라이브 이미징 또는 고정 할 수 있습니다. B) 여섯 잘 조직 배양 접시. C) explants있는 여섯 잘 요리가 높은 산소 환경에서 위치에 세 필터에 추가 10 explants의 사진 (95% O는 5분의 2 %의 CO 2)가 표준 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 배치되어있는 Billups - 로텐 버그 보육 챔버, 내.
그림 2. Eomes의 단일 쓰레기 :: eGFP의 배아에서 파생 전체 반구의 explants의 대뇌 피질 판 Organotypic 성장. A, E) 컬트의 시작 부분에 드롭 고정 뇌의 코로나 섹션 우레 기간 (O DIV). PP는 존재하지만 CP가 형성 아직합니다. 녹색 신호는 미숙 한 흥분성의 뉴런에 GFP 표현이 제작하고 파란은 모든 세포의 핵에 이름표를 Hoechst 염색입니다. B, F)이. 점선으로 표시 CP 성장은, 1 DIV (C와 G) 2 DIV (패널 D와 H)가 0.5 DIV와 증가가 관찰된다. 확산을 나타내는 패널 AD의 세포 도메인을 표현 GFP의 증가 두께를합니다 그리고 explant의 흥분성의 신경 세포의 혈통의 차별화. 스케일 바는 500 μm (패널 A) 및 50 μm (패널 H)입니다. 약어 : CP, 두피 플레이트, IZ, 중급 지대, MZ, 한계 지역, SP, Subplate, VZ, 심실 지역.
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그림 3. 전체 반구의 explants에서 Preplate 분할. AC) 콘드로이틴 황산 proteoglycan (CSPG) immunostaining는 새로 형성된 CP의 전사 인자의 Ctip2의 표현 MZ와 SP. DF에 PP의 분단을 (분할))을 보여줍니다. GI)의 표현을 새로 형성된 CP의 전사 인자의 Tbr1. 스케일 바 패널 C, F, I에서 50 μm 있습니다.
4 그림. 이 DIV 후 E13 예를 자궁의 electroporation 후 전체 반구의 explants에서 GFP를 표현. AC) GFP를 표현. CP의 상단 (화살표). DF) Nestin (빨간색) immunoreactiv에서 형성 대뇌 피질의 뉴런의 층을합니다전체 반구의 explant에서 파생 섹션에서 전체 반구의 explant에서 섹션의 ity. GH) Reelin (적색) immunoreactivity. 패널 C, F, 나는의 스케일 바는 50 μm이다.
그림 5. 등쪽 내측 피질 (필드 1) 예 자궁의 electroporations을 타겟팅 다양성. 한 쓰레기의 일레븐 배아가 편대의 편대장-GFP 표현 구조 (0.33 MG / ML) 및 전체 반구의 explants과 같은 양식으로 electroporated되었습니다. AI)가 열한 explants의 아홉 보여 등쪽 내측 피질에서 GFP의 표현. GFP의 표현이 explants 사이에 차이가 있지만, 각 explant의 GFP에 세 대뇌 피질의 영역 (예 : VZ, IZ와 CP)에서 검출된다. 스케일 바는 패널의 50 μm이다.
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Discussion
우리는 개선하고 실험 모델을 평가 한 - 전체 반구의 explants - 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 (E13-E15). 모델은 대뇌 피질 25,37의 레이어 6 구성 흥분성의 신경 세포의 계보 (Lineage)의 이전과 차별화의 분석에 유용 입증되었습니다. 시스템의 주요 장점은 준비 간단하고, 뇌 발달의 초기, 중요한 기간 동안의 electroporation, 약리 조작 및 이미징을위한 뉴런 3) 실험 접속) 2) DIV에 대한 organotypic 성장, 2 1입니다. 우리는 형태, 방향 및 preplate 분할 기간 동안 층 6 대뇌 피질의 뉴런 7,38의 수지상 성장의 미묘한 차이를 문서화하는 시스템을 사용했습니다.
레이어 6을 입력 흥분성의 뉴런은 크게 등쪽 시상 39,40에 상호 입력을 제공 corticothalamic 프로젝션 뉴런으로 구성되어있다 41 신경 기능의 동기화에 기능적으로 참여 가설 수 있습니다. 이러한 뉴런이 생리 학적 전문이지만, 레이어의 생성, 마이그레이션 및 성숙 과정 6 뉴런 층 피질의 2-6의 모든 흥분성의 뉴런과 주 기본 기능. 특히, 모든 대뇌 피질의 흥분성의 뉴런은 등쪽 telencephalic VZ에서 생성되며, multipolar 뉴런으로 IZ을 통해 마이그레이션 및 CP 7 ~ 차별화. Pax6, Tbr2 및 Tbr1 29 : 흥분성의 피질 뉴런의 성숙은 핵심 순차적으로 표현 전사 인자의 세트에 의해 구동된다. 이 순서는 레이어 2-6 42의 모든 흥분성의 뉴런이 공유하고 우리는 새로 형성된 CP (도 3G-3I)에 Tbr1의 적절한 표현을 확인하고 있습니다. 층 6 대뇌 피질의 뉴런의 발전을 조사하기 위해이 방법을 활용하면 따라서 neu의 개발에 필수적인 통찰력을 제공해야모든 대뇌 피질의 레이어를 구성 rons.
전체 반구의 explants 대뇌 피질의 신경 세포 개발 연구에 대한 기존의 접근 방식을 보완합니다. 이전 연구는 1 DIV 22,23에 대한 대뇌 피질의 개발을 연구 할 수있는 E14 전체 반구의 explant 방식을 채택하고 있습니다. 우리는 L6 형성과 preplate 분할의 기간 동안 대뇌 피질의 발달 2 일 조사하기 전 자궁의 electroporation으로 전체 반구의 explants를 결합했습니다. E13에서 자궁의 electroporations에 대조적으로, 전체 반구의 explant 다음 예에서 자궁의 electroporations의 성공 비율이 높은 : 우리 손에 우리는 등쪽 telencephalon에 electroporation을 타겟팅 ~ 80 %의 성공을 달성. 또한 자궁의 electroporations에서 생존 수술을 필요로 전체 반구의 예를 자궁 접근 방식보다 훨씬 더 많은 기술적 노력을. 마지막으로, 자궁 연구에서 정확한 약리에 쉽게 의무가 없습니다조작 및 이미징 접근. 마약과 정의 농도의 분자 대리인 (표현 벡터, 입을 구조 등)의 제공 또는 활성화의 정확한 일시적으로 제어는 전체 반구의 explants와 함께 제공하지만, 자궁에 달성하기 더 어렵습니다 수 있습니다. 이러한 조작의 결과 효과 광 모니터링을 라이브, 마이크론 범위의 공간 해상도로, 쉽게 EUEP 사용할 수 있지만, IUEP하지 않습니다. 이러한 정밀도는 실질적으로 대뇌 피질의 발달과 기능을 포함하는 실험에서 수집 한 데이터의 해석 능력을 향상시킬 수 있습니다. 따라서 초기 대뇌 피질의 개발 전체를 반구의 explants 연구의의 자궁 방식 통해 독특한 실험 장점을 가지고 있습니다. 현재 그러나,에 대한 데이터 수집> 48 시간, 슬라이스 explants과 자궁 접근 방식에를 요구하는 상위 레이어 대뇌 피질의 뉴런과 실험 연구는 바람직 남아있다.
가 있습니다 전체 반구의 explant 기술의 성공에 대한 몇 가지 중요한 요구 사항. 첫째, explant의 성장은 meninges의 기계 무결성에 매우 민감하다. meninges에 물리적 손상 (예 : 구멍이나 눈물이) 최소한의 기본 피질의 지역 개발을 중단합니다. 둘째, explant의 성장이 잘 문화에서 미디어의 총 볼륨에 민감 : 너무 많은 미디어와 explants는 필터에서 끄고 왜곡 CP 아키텍처를 개발할 것입니다, 너무 작은 미디어와 explants과 과도한 세포 죽음을 탈수과 경험을 할 가능성이 . 마지막으로, 현재 기술의 explants와 함께 우리는 2 DIV에 대한 대뇌 피질의 성장을 기록했습니다. 많은 귀중한 조사를 인정하지만,이 개발 시간 창 E13에서 시작하면, 이전 synaptogenesis 및 표준 neuronal 통신에 기간 분석을 제한합니다. E14.5 명시 많은 mRNAs의 대뇌 피질의 뉴런은 (시냅스 단백질을 인코딩하지만w.genepaint.org "목표는 ="_blank "> www.genepaint.org) synaptogenesis는 측면 피질에 ~ E15까지 시작되지 않습니다,이 synaptogenesis은 오히려 층 6 뉴런 43 이상 세포를 preplate에 국한되어있다.에 관한 일부 중요한 질문은 대뇌 피질의 시냅스 형성과 기능 따라서 전체 반구의 explant 시스템과 현재 주소 지정되지 않습니다.
결론적으로 전체 반구의 explant 준비는 뇌 기형을 물려 전할 수있는의 마우스 모델에서 초기 대뇌 피질의 개발을 조사하기 위해 안정적으로 일관되게 사용할 수 있습니다. 기술은 RNAi, shRNA, 다른 분자와 약리 조작에 쉽게 적응합니다. 전체 반구의 explant도 적용 재조합 단백질 의약품 및 환경 독소를 포함한 연구에 적합합니다.
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Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NINDS (NS066071)과 NIAAA의 보조금을 지원했다. (P50AA017823) ECO합니다. 저자는 박사 로버트 퀸과 동물 보호를위한 실험실 동물 자원학과에서 직원을 감사드립니다. 우리는 여름 학부 연구원 (서핑) 등 지원, 기술 지원 니콜 Belletier을 저드슨 벨몬트 감사드립니다. 우리는 또한 의견 박사 데이비드 카메론 감사하고 원고의 이전 버전에 수정할 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1" and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
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