Inducir miointimal Hiperplasia Versus aterosclerosis en ratones: una introducción de dos modelos válidos

Resumen

Este video muestra a dos modelos de desarrollo de la placa de la íntima en las arterias murinos y hace hincapié en las diferencias en la hiperplasia miointimal y la aterosclerosis.

Resumen

Se han establecido varios modelos in vivo de roedores de laboratorio para la inducción de la estenosis de la arteria para imitar enfermedades que incluyen la formación de placa arterial y la estenosis, como se observa por ejemplo en la enfermedad isquémica del corazón. Dos modelos de ratón altamente reproducibles - tanto resulta en estenosis de la arteria pero cada subyacentes un camino diferente de desarrollo - se introducen aquí. Los modelos representan las dos causas más comunes de la estenosis de la arteria; a saber, se muestran un modelo de ratón para cada hiperplasia miointimal, y la aterosclerosis. Para inducir la hiperplasia miointimal, se realiza una lesión de catéter de balón de la aorta abdominal. Para el desarrollo de la placa aterosclerótica, la ApoE - se utiliza el modelo del ratón en combinación con dieta de grasos occidental - /. Diferentes opciones de modelo-adaptado para la medición y evaluación de los resultados se nombran y describen en este manuscrito. La introducción y la comparación de estos dos modelos ofrece Information para los científicos para elegir el modelo de estenosis de la arteria apropiada de acuerdo a la pregunta científica pedido.

Introducción

En los países industrializados la enfermedad isquémica del corazón sigue siendo una causa principal de mortalidad ^1. Las causas de la estenosis de la arteria coronaria son múltiples e incluyen la hiperplasia miointimal así como la aterosclerosis, con la revascularización restante la estrategia de tratamiento más común ^2. Modelos de investigación que distinguen claramente entre las vías mecanicistas de la hiperplasia de la íntima y la aterosclerosis son esenciales para investigar la pathobiological y los procesos fisiopatológicos en el desarrollo de la placa arterial. En este video se presentan dos modelos diferentes de ratones utilizados para estudiar bien el desarrollo de la hiperplasia miointimal o aterosclerosis.

Hiperplasia miointimal se postula para formar a través del paradigma de la "respuesta a la lesión", originalmente descrito para la aterosclerosis ^3. La ruptura mecánica de la capa endotelial conduce a una intensa remodelación mejorada por los efectos paracrinos. Hay varios diferentes modelos animales comúnmente utilizados para estudiar la hiperplasia miointimal. Algunos grupos utilizan dispositivos metálicos en la aorta ascendente de ⁴ ratas. El modelo de la denudación aórtica se realiza con un catéter de balón también se usa comúnmente en ratas de laboratorio ^5,6. El modelo de hiperplasia de la íntima realizado en ratones de laboratorio ⁷ implementa la ligadura de la arteria carótida e induce lesiones miointimales ^8. En nuestro laboratorio el modelo de la denudación de la aorta abdominal - para estudiar el desarrollo de la hiperplasia miointimal - así como un modelo de reestenosis del stent humanizado ⁹ son de uso general. Este video hace hincapié en que la elección del modelo animal experimental apropiado es crucial para los estudios mecanicistas o fisiopatológicos de la estenosis arterial.

Modelos hiperplasia miointimal deben diferenciarse de los modelos de aterosclerosis. Para estos últimos, la apolipoproteína E-deficiente (ApoE - / -) ratones en combinación con dieta occidental se utilizan comúnmente para inducir atheroscllesiones eróticos ^10,11,12,13. Ejemplos para la inducción de ambos de estos tipos de enfermedad miointimal en ratones se muestran aquí, junto con diferentes opciones de modelo adaptado para analizar estenosis de los vasos ^14.

Protocolo

Todo animal de trabajo debe llevarse a cabo según las directrices de cuidado de los animales pertinentes. Obtener la aprobación institucional para el trabajo con animales antes de protocolo de inicio.

1. Miointimales Hiperplasia Modelo (A)

Para el modelo de hiperplasia de la íntima, la compra de C57BL/6J (Stock número 000664, C57BL/6J) ratones a la edad de 8 semanas con un peso aproximado de 25 g. Los ratones de estos experimentos en condiciones convencionales; alimentar a los ratones estándar chow ratón y proporcionar agua a voluntad.

1. Preparación del ratón: Introducir el ratón a un estado de anestesia con isoflurano (2%) que utiliza una cámara de inducción.
   1. Quite el pelo abdominal usando un cortador de pelo, poner el ratón sobre su espalda y cubrir su nariz y boca con la máscara facial para asegurar la anestesia.
   2. Con Provo-yodo, la desinfección de la zona abdominal universalmente, seguido de etanol 80%, en dos ciclos.
   3. Asegurar la ausenciade los reflejos por pellizco la extremidad posterior para controlar la profundidad suficiente de la anestesia.
   4. Separar la piel y los músculos a lo largo de la línea alba en dos pasos para destapar los órganos abdominales.
   5. Coloque los intestinos en un guante de solución salina hidratada. Envuelva el guante alrededor de los intestinos para mantenerlos húmedos.
   6. Atentamente limpiar el tejido graso láminas de la aorta abdominal. Exponer la aorta infrarrenal hasta su bifurcación, teniendo cuidado de no dañar ningún ramas vasculares.
   7. En primer lugar, colocar una pinza de microcirugía en la proximal, la aorta infrarrenal para apagar el flujo de sangre. Ahora, aplique una segunda pinza distal próximo a la bifurcación aórtica.
   8. Cuando se interrumpe el flujo de sangre, hacer una pequeña incisión en la aorta cerca de la pinza proximal.
   9. Insertar el catéter con punta de balón, que ha sido hidratada con 0,9% de solución salina, y avanzar hacia la mordaza distal de la aorta.
   10. Por lesión endotelial, desnudar la aorta inflando el balloon cuidadosa y lentamente tirando del catéter en la dirección de la mordaza proximal.
   11. Repita la maniobra de la denudación dos veces.
   12. Retire el catéter y cerrar la incisión de la aorta utilizando prolene 10-0 suturas continuas.
   13. Abra con cuidado la pinza distal. En caso de sangrado en el sitio aortotomía, cierre la pinza de nuevo, localizar el sangrado y colocar puntos interrumpidos adicionales, según sea necesario.
   14. Si hay sangrado se puede observar, abra lentamente la pinza proximal.
   15. Un pulso aórtica debe ser visible distalmente desde la incisión. Ahora los intestinos se pueden arreglar de nuevo in situ.
   16. Enjuague la cavidad abdominal utilizando solución salina estéril precalentada.
   17. Cierre de la pared abdominal que comienza con la capa muscular utilizando 6-0 suturas de prolene en ejecución.
   18. Siguiente adaptar la piel bajo el uso de 5-0 prolene realizar suturas continuas.
   19. Durante el tiempo que el ratón sigue anestesiado, aplicar 4-5 mg / kg Carprofeno través de una inje subcutáneacción.
   20. Añadir metamizol al agua de beber (50 mg Metamizol por 100 ml) para el control del dolor y continuar durante 3 días después de la cirugía. Monitorear los animales en toda la recuperación.
       Nota: El período de observación para este modelo es de 28 días.

2. La aterosclerosis Modelo (B)

Para el modelo de aterosclerosis, comprar (ApoE - / -)-E deficientes apolipoproteína ratones (Stock número 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) a una edad de 4 semanas, y luego se alimentó durante 4-6 meses. Los ratones de estos experimentos en condiciones convencionales; alimentar a los ratones una dieta alta en lípidos occidental a la llegada (Harlan Laboratorios TD.88137) y proporcionar agua ad libitum con una duración de 4 a 6 meses.

1. Preparación del ratón:
   1. Alimentar a la ApoE - / - ratones con dieta occidental a partir de las 4 semanas de edad. La manipulación de la dieta debe comenzar directamente a la llegada.
   2. Mantener dieta occidental a lo largo de la duración del experimento.

3. Análisis

1. Modelo de hiperplasia miointimal (A)
   La región de interés en este modelo es el "área de la lesión". Opciones para el análisis incluyen obliteración luminal, relación I / M (relación íntima / media), grosor myointima máxima, área miointimal, tinción tricrómica para la fibrosis y tinción H & E para las células mononucleares (como se ilustra en las figuras 1A-1C). De acuerdo con la pregunta científica numerosas otras tinciones como el rojo Picrosirius para el colágeno, la inmunohistoquímica, y métodos confocales se pueden aplicar.
2. Modelo de aterosclerosis (B)
   Las regiones de interés en este modelo son la válvula aórtica, arco aórtico, así como la aorta descendente. Opciones para el análisis: Sudán tinción con rojo para los lípidos y la tinción tricrómica de la válvula aórtica, arco aórtico y la aorta descendente (como se ilustra en la Figura 1D).
   Este modelo también produce una variedad de otras opciones de tinción comopor ejemplo Oil Red O de lípidos neutros, Picrosirius rojo, inmunohistoquímica, y métodos confocal.
   1. Sudán tinción con rojo: Realizar la tinción con rojo Sudán el tejido aórtico recién cosechado.
      1. Retire la 6h dieta antes de la cosecha.
      2. Introducir el ratón a un estado de anestesia con isoflurano (2%) la utilización de una cámara de inducción. Asegurar la ausencia de reflejos pellizcando el miembro posterior para controlar la profundidad suficiente de la anestesia.
      3. Abra el pecho; cortar la punta del corazón y perfundir a través del ventrículo izquierdo, primero con solución salina (3 ml), seguido de PFA al 4% (3 ml) a través de la raíz aórtica para fijar la aorta.
      4. Libere la aorta desde la raíz hasta su bifurcación. Trate de eliminar el tejido graso tanto como sea posible.
      5. Cortar el corazón y la raíz de la aorta, y almacenarlos en el 4% PFA para histología.
      6. Para la histología la raíz aórtica tiene que ser colocado con cuidado en el bloque de parafina en una posición vertical para permitir el corte de la AORdiapositivas generadoras raíz de tics que muestran los 3 valvas valvulares.
      7. Corte un extremo del árbol de la aorta y fijarlo sobre la capa de silicona con alfileres finos. Abra la aorta longitudinalmente y fijar el tejido aórtico.
      8. Enjuague el tejido con etanol al 50%. Sumergir el tejido con una solución de tinción de Sudan III durante aproximadamente 15 min.
      9. Enjuague ligeramente con etanol al 50% para eliminar el exceso de Sudán III. (Nota: El 50% de etanol puede lavar el tinte de distancia.) Enjuagar con dH ₂ O, y tomar fotos para su posterior análisis.

Resultados

La figura 1 muestra las diferentes opciones de análisis y el estado de la enfermedad inducida por ambos modelos. Para el modelo de hiperplasia de la íntima, se muestra el análisis de secciones transversales representativas en la tinción tricrómica. A partir de estas secciones transversales, resultados como relaciones de I / M, espesor máximo de la placa, el espesor máximo de la íntima en el lumen, la obliteración luminal en por ciento, así como área de la placa pueden ser medidos y calculados.

Discusión

Aunque ambas enfermedades resultan en síntomas similares en el paciente, los mecanismos subyacentes de desarrollo de la placa y por lo tanto, los enfoques de tratamiento son muy diferentes ^2. En diferentes formas de estenosis arterial los hallazgos clínicos en los pacientes, así como el marco de tiempo de desarrollo de la placa dependen del mecanismo subyacente.

En función de los hallazgos clínicos en el paciente, diferentes métodos de análisis de la muestra deben realizarse ^...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo de tioglicolato 3%	Fluka	70157	polvo
PFA 4%	Ciencias de la microscopía electrónica#157135S		20%
Solución de tinción Sudán III	Sigma Aldrich	S4131	polvo
ratón C57BL/6J	Jackson Laboratories	Stock # 0006664
ratón ApoE -/-	Jackson Laboratories	Stock #002052
Western Diet	Harlan Laboratories	TD.88137
cortapelos	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	Abbott		Pinza microquirúrgica de isoflurano
	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - Aplicador de
pinza	Catéter
Sutura de prolene 10-0	Ethicon	788G
6-0 sutura de prolene	Ethicon	8709H
5-0 sutura de prolene	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer		Carprofen
Metacam 1,5 mg/ml	Boehringer Ingelheim		Metamizol

de 4 mm Fine Science Tools 18056-14