Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre
En este artículo
Resumen
Resumen
Células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen un gran potencial para el estudio de desarrollo embrionario humano, para el modelado de enfermedades humanas en el plato y como una fuente de células trasplantables para aplicaciones de regeneración después de la enfermedad o accidentes. Células de la cresta neural (NC) son los precursores para una gran variedad de células somáticas adultas, tales como células del sistema nervioso periférico y glía, melanocitos y células mesenquimales. Ellos son una valiosa fuente de células para estudiar aspectos del desarrollo embrionario humano, incluida la especificación del destino celular y la migración. Además diferenciación de las células progenitoras NC en tipos de células diferenciadas terminalmente ofrece la posibilidad de modelar enfermedades humanas in vitro, investigar mecanismos de la enfermedad y generar células para la medicina regenerativa. En este artículo se presenta la adaptación de un protocolo vitro disponibles actualmente en la diferenciación para la derivación de células NC desde hPSCs. Este nuevo protocolo requiere 18 días de diferenciación, es-alimentador libre, fácilmente escalable y altamente reproducible entre células madre embrionarias humanas (hESC) líneas, así como células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) líneas. Ambos viejos y nuevos protocolos producen células NC de igual identidad.
Introducción
Las células madre embrionarias (células madre) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) han demostrado un enorme potencial, en particular para la investigación y el tratamiento futuro de enfermedades humanas para las que están disponibles ni los buenos modelos animales ni los tejidos primarios. Ejemplos de aplicación de la tecnología de células madre / hiPSC son los siguientes: Las células de especial interés pueden ser generados a partir de células madre / hiPSCs para la medicina regenerativa en cantidad ilimitada 1. Las células pueden producirse a partir de pacientes portadores de una enfermedad específica y se utiliza para establecer ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de medios de cultivo, placas revestidas y Mantenimiento de hPSCs
Preparación 1.1 Medios
Nota: todos los medios de filtro para la esterilización y se almacenan a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 semanas. Números de los nombres de Reactivos para la empresa y catálogo se listan en la Tabla de Materiales.
- DMEM/10% de SFB: Combinar 885 ml DMEM, FBS 100 ml, 10 ml penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-glutamina.
- HES-medio: Combinar 800 ml de DMEM/F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 10 ml de MEM mínimo de solución am....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Las dos mejoras más importantes del protocolo R-NC a través del protocolo MS5-R-NC 11 son las condiciones de diferenciación, definidos libres de alimentador y el acortamiento general del requisito de tiempo. Células alimentadoras MS5 13 son de médula ósea células del estroma derivadas murinas que han sido mostrados para apoyar la diferenciación neural de hESCs 14. Células madre embrionarias humanas cultivadas sobre células alimentadoras MS5 en estructuras de baja densidad de formulario e.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Para la diferenciación de las células exitosa R-NC de células madre / hiPSCs deben hacerse las siguientes consideraciones. Es fundamental trabajar en condiciones de cultivo estériles en todo momento. En particular, es importante para poner a prueba las culturas HPSC para contaminación por micoplasma regularmente, ya que esto impedirá la contaminación diferenciación exitosa, pero no puede fácilmente ser detectado visualmente en cultivos de HPSC. La diferenciación R-NC debe iniciarse con la densidad celular 90-100%; menor.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca para investigadores avanzados de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y por medio de donaciones de NYSTEM (C026446; C026447) y la iniciativa de células madre Tri-institucional (Fundación Starr).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Suero knockout de reemplazo | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | El lote debe ser probado |
| L-glutamina | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlina/Estreptomicina | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM solución de aminoácidos esenciales mínimos | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoetanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | |
| tóxico FGF humano recombinante básico (FGF2) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 polvo | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucosa | Sigma | G7021 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | S5761 | |
| APO transferencia humana | Sigma | T1147 | |
| Insulina humana | Sigma | I2643 | |
| Dihidrocloruro de putriscina | Sigma | P5780 | |
| Selenita | Sigma | S5261 | |
| Progesterona | Sigma | P8783 | |
| Matriz Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Hidrobromuro de ornitina | Sigma | P3655 | |
| Laminina de ratón-I | R& amperio; D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectina | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispasa en la solución salina equilibrada de Hank 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 diclorhidrato | Tocris-R& D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1614 | |
| Accutase | Tecnologías Celulares Innovadoras | AT104 | |
| Ácido Ascórbico | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R& D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R& D Systems | 423-F8 | |
| Erizo sónico recombinante para ratón (SHH) | R& D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| EGF recombinante humano | R& D Systems | 236EG | |
| gelatina (PBS sin Mg/Ca) | en casa | ||
| Anticuerpos: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | se debe analizar |
| el lote Anti-p75 mIgG1 (receptor del factor de crecimiento nervioso) | Advanced Targeting Systems | El lote AB-N07 | debe ser probado |
| APC rata anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lote debe ser probado |
| AlexaFluor 488 cabra anti-ratón IgG1 | Invitrogen | A21121 | debe ser analizado |
| Anti Oct4 mIgG2b (utilizado en dilución 1:200) | El | Santa Cruz sc-5279 | debe ser analizado |
| Material/Equipo: | |||
| Fibroblastos embrionarios de ratón (7 millones de células/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Placas de cultivo celular: placas de 10 cm y 15 cm, tubos de centrífuga, tubos FACS, pipetas, pipetas Consejos | |||
| Hematocitómetro | |||
| Centrífuga | |||
| celular Incubadora de cultivo celular (CO2, humedad y temperatura controladas) | |||
| Campana de flujo laminar para cultivo celular con microscopio | |||
| Campana | de bioseguridad para cultivos celulares | ||
| Máquina clasificadora de células, i.e. MoFlo | |||
| Microscopio | |||
| 1 ml Jeringa TB 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Elevador de células Polietileno | Corning Incorporated | 3008 |
Referencias
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
