Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Summary

Neuralleiste (NC)-Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hpSC) abgeleitet haben ein großes Potenzial für die Modellierung menschlichen Entwicklung und Krankheit und für die Zell-Ersatz-Therapien. Hier ein Feeder-freie Adaption des derzeit weit verbreitet

Abstract

Menschen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben ein großes Potenzial für die Untersuchung menschlichen embryonalen Entwicklung, für die Modellierung menschlichen Krankheiten in die Schüssel und als eine Quelle von transplantierbaren Zellen für regenerative Anwendungen nach der Krankheit oder Unfälle. Neuralleiste (NC)-Zellen sind die Vorläufer für eine Vielzahl von adulten somatischen Zellen, wie Zellen des peripheren Nervensystems und Glia, Melanozyten und mesenchymalen Zellen. Sie sind eine wertvolle Quelle der Zellen, um Aspekte der menschlichen embryonalen Entwicklung, einschließlich Zellschicksal Spezifikation und Migration zu untersuchen. Eine weitere Differenzierung der NC-Vorläuferzellen in terminal differenzierten Zelltypen bietet die Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu modellieren in vitro untersuchen Krankheitsmechanismen und erzeugen Zellen für die regenerative Medizin. Dieser Artikel stellt die Anpassung eines derzeit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen aus hPSCs. Dieses neue Protokoll erfordert 18 Tagen unterschiedrentiation ist Feeder-frei, einfach skalierbare und hoch reproduzierbare unter humanen embryonalen Stammzellen (hES) Linien sowie menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien. Beide alten und neuen Protokolle ergeben NC-Zellen gleicher Identität.

Introduction

Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) haben immense Potenzial gezeigt, insbesondere für die Untersuchung und die künftige Behandlung von Krankheiten des Menschen, für die weder gut noch Tiermodellen primären Gewebe zur Verfügung. Anwendungsbeispiele für den HES / hiPSC Technologie sind die folgenden: Zellen von besonderem Interesse kann von hESC / hiPSCs für die regenerative Medizin in unbegrenzter Menge ¹ erzeugt werden. Zellen von Patienten, die eine spezifische Krankheit hergestellt und verwendet, um in vitro Krankheitsmodellen ^2,3 einzurichten. Solche Krankheitsmodelle können dann für große Wirkstoff-Screening auf der Suche nach neuer Wirkstoffe ⁴ sowie die Prüfung vorhandener Arzneimittel auf Wirksamkeit und Toxizität ⁵ eingesetzt werden. In-vitro-Krankheitsmodelle können zur Identifikation von neuen Krankheitsmechanismen führen. Für alle Anwendungen der HES / iPS-Technologie ist es wichtig, mit spezifischen arbeiten, gut zu definierenin der Krankheit von Interesse betroffen d Zelltypen. So ist die Verfügbarkeit von festen und reproduzierbare in vitro Differenzierung Protokolle von entscheidender Bedeutung für alle Anwendungen der hESC / hiPSC Technologie. Protokolle sind wünschenswert, die minimale Variabilität, Zeitaufwand, Mühe, Schwierigkeiten und Kosten sowie maximale Reproduzierbarkeit unter hESC / hiPSC Linien und verschiedene Forscher zeigen.

Neuralleiste (NC)-Zellen entstehen während der Wirbel Neurulation zwischen der Epidermis und dem neuronalen Epithel. Sie vermehren sich und wandern weitgehend in den sich entwickelnden Embryo und führen zu einer beeindruckenden Vielfalt der Nachkommen Zelltypen, einschließlich Knochen / Knorpel, kraniofazialen Skeletts, sensorische Nerven, Schwann-Zellen, die Melanozyten, glatte Muskelzellen, enterischen Neuronen, autonome Nervenzellen, chromaffinen Zellen , Herzscheidewand-Zellen, Zähne und Nebennieren / Schilddrüsenzellen ^6. Somit NC-Zellen sind eine attraktive Zelltyp für die Stammzellfeld und wichtig für dieModellierung einer Vielzahl von Erkrankungen, wie Morbus Hirschsprung ^7, familiärer Dysautonomie ⁸ sowie Krebserkrankungen, wie Neuroblastomen ^9. Darüber hinaus bieten sie die Möglichkeit, Aspekte der menschlichen Embryonalentwicklung in vitro zu studieren.

Die derzeit verfügbaren und weit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen von hES ^10,11 aufgebracht erfordert bis zu 35 Tage der Differenzierung und es beinhaltet neurale Induktion auf Stromazellen Feeder-Zellen, wie Zellen, MS5 und somit schlecht unter definierten Bedingungen durchgeführt. Zwar kann es sein skaliert, um große Mengen von NC-Zellen zu erzeugen, beispielsweise zum ^{Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-4} erforderlich ist, ist dieser arbeits-und kostenintensiv. Darüber hinaus geht es um Hand Passagieren neuronaler Rosetten, die schwer zu reproduzieren können und damit unterliegt der Gesamtvariabilität, insbesondere, wenn es um eine Vielzahl von menschlichen embryonalen Stammzellen oder hiPSC angewendet wirdLinien. Hier wird die schrittweise Ableitung NC-Zellen in einem 18-Tage-Protokoll, das frei von Feederzellen ist gezeigt. Dieses Verfahren ist kürzer und definiert als das aktuell verwendete Protokoll. Darüber hinaus ist es sehr robust bei der Erzeugung NC-Zellen unter verschiedenen hiPSC Linien. Wichtig ist, wird gezeigt, dass die NC-Zellen durch beide Protokolle ergab entstehen an der Grenze von neuralen Rosetten (im Folgenden als Rosette-NC oder R-NC). Die Verwendung eines der beiden Protokolle abgeleiteten Zellen morphologisch identisch aussehen, können sie die gleichen NC-Marker exprimieren und Cluster zusammen in der Microarray-Analyse. NC-Zellen mit dem neuen Protokoll (R-NC) abgeleitet sind funktional, ähnlich wie NC-Zellen mit dem alten Protokoll (MS5-R-NC), so dass sie wandern können und weiter zu differenzieren zu Neuronen abgeleitet. Daher können die Zellen gleichzeitig mit den MS5-R-NC-Zellen verwendet werden. Die R-NC-Zelle-Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / iPS nützlich für alle Anwendungen der HES / iPS-Technologie, die die NC-Linie sein. </ P>

Protocol

1. Herstellung von Nährmedien, beschichtetes Geschirr und Wartung von hPSCs

1.1 Medien-Vorbereitung

Hinweis: Filtern Sie alle Medien für die Sterilisation und bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 2 Wochen. Reagenz Namen, Firmen-und Katalognummern werden in der Werkstoff-Tabelle aufgeführt.

1. DMEM/10% FBS: Kombinieren 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep und 5 ml L-Glutamin.
2. HES-Medium: Kombinieren 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamin, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Mindest essentiellen Aminosäuren-Lösung, 1 ml β-Mercaptoethanol. Werden 10 ng / ml FGF-2 nach dem Filtern des Mediums.
   ACHTUNG: β-Mercaptoethanol ist giftig, das Einatmen, Verschlucken und Hautkontakt.
3. KSR-Differenzierungsmedium: Kombinieren 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-Glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Mindest essentiellen Aminosäuren-Lösung und 1 ml β-Mercaptoethanol.
4. N2-differentiatiauf mittel: Lösen Sie 12 g Pulver in DMEM/F12 980 ml ​​dH ₂ O, 1,55 g Glucose hinzuzufügen, 2 g Natriumbicarbonat und 100 mg APO menschliches Transferrin. Mix 2 ml dH ₂ O mit 25 mg Humaninsulin und 40 ul 1 N NaOH, die aufgelöste Lösung für das Medium. 100 l Putrescin-dihydrochlorid, 60 ul Selenit, 100 ul Progesteron und bringe das Volumen auf 1 L mit dH ₂ O.

1.2 Beschichtung der Kulturschalen

1. Matrigel-Beschichtung: Tauwetter 1 ml eingefroren Matrigel aliquoten durch Pipettieren von 19 ml DMEM/F12 über den aliquoten bis es sich aufgelöst hat. Klumpen entfernen, indem man es durch ein 40 um-Sieb und Zellplatte 8 ml/10 cm Schüssel. Geschirr Inkubation für 1 h bei RT. Saugen Sie den Matrigel unmittelbar vor dem Ausplattieren der Zellen.
   Hinweis: schnell arbeiten mit Matrigel, da es bei Temperaturen über 4 ° C verklumpen
2. PO / Lam / FN-Beschichtung: 10 ml 1x PBS mit 15 ug / ml Poly-L-Ornithin Hydrobromid auf eine 10 cm-Schale. Inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 ° C Waschen Platten mit 1x PBS einmal und fügen 10 ml/10 cm Schale aus 1x PBS mit 2 ug / ml Maus-Laminin-I und 2 pg / ml Fibronektin. Die Gerichte Inkubation über Nacht bei 37 ° C Vor der Beschichtung der Zellen, die Lösung vollständig zu entfernen und lassen die Platten gründlich trocknen bei RT für 15-20 min durch Stehen sie bis auf die Gewebekultur Haubenwand ohne den Deckel auf.
   Hinweis: Die Gerichte völlig trocken und bereit für die Zellbeschichtung, wenn man Kristallstrukturen auf der Oberfläche (sichtbar durch das Auge) zu sehen. Die Platten können bei Raumtemperatur für einige Stunden in diesem trockenen Zustand gehalten werden. PO / Lam / FN Gerichte haben bis 2 Tage vor der Zeit vorbereitet werden. In Notfällen können Lam / FN für nur 2-4 Stunden inkubiert werden. Dies kann jedoch suboptimal Differenzierung / Überlebensergebnisse riskieren.

1.3 Wartung von hPSCs

Hinweis: hPSCs auf 0,1% Gelatine und mitotisch inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten (M gehaltenEF) im HES-Medium, ergänzt mit 10 ng / ml FGF-2, wie zuvor beschrieben ^10,12. Die Zellen sollten alle 6-8 Tage aufgeteilt werden.

1. Mantel eine 10-cm-Spiegel mit 8 ml 0,1% Gelatine (in 1x PBS ohne Magnesium oder Calcium) bei RT für 5 min.
2. Tauen Sie gefrorene MEFs schnell in einem 37 ° C Wasserbad. In 1 Million MEFs auf 10 ml DMEM/10% FBS.
3. Saugen Sie die Gelatine und die Platte die Zellen. Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 6 Stunden.
4. Saugen Sie den DMEM/10% FBS aus dem vorbereiteten MEF Platte, Waschplatte mit 1x PBS und einmal mit 10 ml HES-Medium mit 10 uM Y-27632-dihydrochlorid ergänzt. Das Medium zum Aufwärmen bei 37 ° C für 20 min.
   Anmerkung: Für die manuelle Aufspaltung hPSCs einer Steril mit einem eingebetteten Mikroskop verwendet wird. Jedoch können die Zellen unter Verwendung von geeigneten alternativen Verfahren passagiert werden.
5. Unter einer Steril mit einem eingebetteten Mikroskop lösen einzelnen Kolonien mit einem Zellheber und lassen Sie sie schweben.
6. Verwenden Sie ein1-ml-Spritze, um die schwimmende Kolonien absaugen und versenden Sie sie auf den frischen, warmen MEF Platte. Übertragen etwa ein Viertel der Zellen in die neue Schale. Bei 37 ° C.
7. Feed-Zellen täglich mit frischen HES Medium.

2. Überzug von hPSCs für Differenzierung

Hinweis: hPSCs aufgeteilt werden soll oder überzogen für die Differenzierung, wenn die Kolonien groß sind, aber immer noch scharfe Kanten haben, mit so wenig wie möglich zu differenzierenden Zellen an ihren Grenzen (siehe Abbildung 1B). Wenn die Zellen unter Verwendung manueller Passage aufrechterhalten die Kolonien groß genug, um leicht mit dem Auge gesehen werden kann. Um das richtige Gefühl für diese Zeit Punkt kann man einen separaten hpSC Gericht für zwei Wochen ohne Passagieren warten und beobachten, wie die Zellen zu erreichen und geben den idealen Zeitpunkt für die Passage / zu differenzieren sind.

1. Bereiten 10 cm Gerichte mit Matrigel 1 Stunde vor Beginn der Differenzierung. Erfolgreiche Matrigel Beschichtung kannmit 4-facher Vergrößerung überprüft.
2. Wenn die hPSCs bereit sind, aufgeteilt werden, saugen Sie den mittel-und 4 ml 0,05% Trypsin-EDTA zu den Zellen.
3. Schütteln Sie die Schüssel horizontal für 2 min kräftig, bis man die MEFs als Einzelzellen Abheben der Platte unter dem Mikroskop zu sehen. Die hpSC Kolonien bleiben als Kolonien befestigt.
4. Sofort und gründlich absaugen Trypsin und lassen die Platte stehen bei RT für 2-4 min.
5. 2 ml HES-Medium auf die Platte und mit einer Pipette P1000, nehmen die Zellen.
   Hinweis: Wenn die Zellen nicht von der Oberfläche leicht angehoben werden, kann die Platte leer bei RT für weitere 2-3 min inkubiert werden.
6. Übertragen Sie die Zellen, die 8 ml HES-Medium mit 10 uM Y-27632-dihydrochlorid ergänzt.
7. Saugen Sie den Matrigel aus einer zuvor hergestellten 10 cm Schüssel. Platte die Zellen in einem Verhältnis 1:1 oder 1:2 (zum Beispiel: Die Zellen aus einem 10-cm-Spiegel sind in zwei 10 cm-Schalen aufgeteilt) auf die Matrigel Platte. Bei 37 °C über Nacht.
   Hinweis: Diese Beschichtung sollte in etwa 100.000 Zellen / cm ² führen.

3. Induktion der Differenzierung Neural

Hinweis: Die Differenzierung eingeleitet (Tag 0), wenn die Zellen 90-100% konfluent (siehe Fig. 1C), üblicherweise am folgenden Tag. Wenn der genaue Konfluenz noch nicht erreicht ist, können die Zellen täglich mit HES-Medium zugeführt werden, bis sie bereit zur Differenzierung. Alternativ kann die Anfangszahl der plattierten Zellen erhöht werden.

1. Am Tag 0 bis 3, füttern die Zellen täglich mit 10 ml/10 cm austeilen KSR-Differenzierungsmedium mit 0,1 uM LDN193189 und 10 uM SB431542.
2. Am Tag 4 und 5 Futter die Zellen mit 75% KSR-Differenzierungsmedium und 25% N2-Differenzierungsmedium enthält sowohl LDN193189 und SB431542.
3. Am Tag 6 und 7 Futter die Zellen mit 50% KSR-Differenzierungsmedium und 50% N2-Differenzierungsmedium sowohl LDN193189 und SB4 enthalten31542.
4. Am Tag 8 und 9 Futter die Zellen mit 25% KSR-Differenzierungsmedium und 75% N2-Differenzierungsmedium enthält sowohl LDN193189 und SB431542.
5. Am Tag 9 und 10 bereiten PO / Lam / FN Gerichte wie in 1.2.2 für Replattierung der Zellen am Tag 11 angedeutet.
6. Am Tag 10 Futterzellen mit N2-Differenzierungsmedium enthält LDN193189 und SB431542.

4. Replattierung in Tröpfchen für NC-Daten

1. Am Tag 11 absaugen Lam / FN von den zuvor hergestellten Platten und sie vollständig trocknen bei RT für 20-30 min, wie in 1.2.2 erläutert zu lassen.
2. Entfernen Sie das Medium aus den differenzierenden Zellen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und 1x 8 ml accutase/10 cm Schüssel. Inkubation für 20 min bei 37 ° C.
3. Die Verwendung eines Handys Heber, nehmen die Zellen und resuspendieren sie in Accutase mit einer 5 ml Pipette. Die Suspension in einem 15-ml-Tube.
4. 5 ml 1 × PBS und drehen die Zellen 5 min bei 114 x g.
5. Resuspendieren der Zellen in 10 ml 1x PBS. Um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten, filtern sie durch eine 40 um Zellsieb und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder gleichwertige Technik.
6. Dreh die Zellen nach unten und resuspendieren sie in N2-Differenzierungsmedium, das 200 uM Ascorbinsäure (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632 Dihydrochlorid bei der Konzentration von 100.000 -150.000 Zellen/10 ul.
7. Mit ein Wiederholungs-Pipetten, Platte 10 ul Tröpfchen nahe beieinander, ohne sie zu berühren auf die getrocknete PO / Lam / FN 15 cm Gerichte.
   Hinweis: Ein 10-cm-Spiegel von differenzierten Zellen führt in der Regel etwa 2-3 mal 15 cm Geschirr oder ca. 100 x 10 cm ul droplets/15 Gericht.
8. Lassen Sie die Tropfen stehen bei RT für 20-30 min, dann sehr vorsichtig (nicht zu stören die Tropfen) 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y und bei 37 ° C
9. Am Tag 12 sorgfältig füttern die Zellen mit 20 ml/15 cm Schale N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
10. Von day 14-17 füttern die Zellen jeden zweiten oder dritten Tag mit N2/AA/BDNF/FGF8.
11. Am Tag 16 und 17 vorzubereiten PO / Lam / FN Platten NC-Zellen nach FACS-Sortierung Ausstrich.

5. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) von NC-Zellen

Anmerkung: Die Vorbereitung der Zellen für die FACS erfordert etwa 2 Stunden.

1. Am 18. Tag entfernen Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS in die Schüssel und fügen Sie 12 ml Accutase. Die Zellen für 20 min bei 37 ° C.
2. Die Verwendung eines Handys Heber, nehmen die Zellen von der Oberfläche und lassen Sie sie schweben. Pipettieren Sie die Zellen in Suspension mit einer 5 ml Pipette, übertragen Sie sie auf einer 50-ml-Tube und 30 ml 1x PBS. Dreh die Zellen 5 min bei 114 x g.
3. Verwendung einer P1000-Pipette resuspendiert die Zellen in 1 ml 2% FBS / HBSS (HBSS enthält 15 mM HEPES). Hinzufügen von 19 ml 2% FBS / HBSS, und die Zellen filtriert durch ein 40 &mgr; m Zellsieb um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Die Zellen auf Eis inkubieren 15 min für die Antikörper-Blocking und dann zählen sie mit einer Zählkammer.
4. Dreh die Zellen nach unten und wieder zu suspendieren sie bei der Konzentration von 10 Millionen Zellen / ml in 2% FBS / HBSS.
5. Beiseite 1 Million Zellen, die jeweils für die ungefärbten, single-gefärbt (HNK-1 nur und nur p75) und sekundären Antikörper gefärbt nur (APC nur und nur 488) FACS steuert.
6. In 5 ul der HNK-1 und 5 ul p75 primären Antikörper pro 10 Millionen Zellen in 1 ml Suspension auf die richtigen Proben und Inkubation für 20 min auf Eis.
7. Waschen der Zellen in 10 ml 1x PBS (Zentrifuge 5 min bei 114 × g) und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 2% FBS / HBSS. In 2 ul APC und 1 ul von 488 sekundären Antikörper pro 10 Millionen Zellen in 1 ml Suspension auf die richtigen Proben und Inkubation für 20 min auf Eis im Dunkeln.
   Hinweis: APC und 488 sind die sekundären Antikörper verwendet hier für das HNK-1-und p75-Färbung auf.
8. Die Zellen werden in 10 ml 1x PBS zweimal resuspendiert 10 Millionen Zellen in 500 &mgr; l2% FBS / HBSS mit DAPI (0,5 ng / ul) oder alternativ entsprechende Live-Cell-Fleck auf toten Zellen von der FACS-Analyse auszuschließen.
9. Übertragen Sie die Proben auf FACS-Röhrchen eignen.
10. Bereiten FACS-Röhrchen mit 0,5 ml 2% FBS / HBSS für Zellsammlung.
    Hinweis: Die Zellen und das Entnahmeröhrchen auf Eis im Dunkeln während des Sortier Zeit gehalten.
11. Mit Hilfe eines Zellsortiermaschine mit Laser, die DAPI, APC und 488 sortieren DAPI-/HNK-1 + / P75 + doppelt positiven Zellen erkennen kann.
    Hinweis: Zubereitungszeit und die Handhabung der Zellen führt zu einem geringen Prozentsatz des Zelltods, ermöglicht DAPI Flecken toten Zellen und damit nur diese Zellen aus der sortierten Population auszuschließen. Jede Alternative Live / Dead-Färbung funktioniert genauso gut für diesen Zweck. DAPI selbst nicht Zytotoxizität verursachen in der Live-Zellpopulation.

6. Replattierung der sortierten Zellen, NC Wartung und Erweiterung

Hinweis: FACS sortierten Zellen sollten Hand seinführte mit besonderer Sorgfalt, um eine optimale Überleben zu sichern. Halten Sie sie auf Eis, bis sie Neubelegung. Vortexen nicht oder pipettieren sie barsch. Die Zellen können durch Schwenken der Röhre resuspendiert werden.

1. Nach FACS-Sortierung, zählen die NC-Zellen, dann drehen sie auf und resuspendieren in N2-Differenzierungsmedium mit 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF und 10 uM Y-27632 dihydrochlorid in dem Volumen und gegebenenfalls ergänzt, um sie bei 30.000 Zellen Ausstrich / 10 ul Tröpfchen.
2. Gründlich trocken zuvor hergestellten PO / Lam / FN-Platten und Platten etwa 50-70 Tropfen pro 10 cm Schale. Lassen Sie die Gerichte stehen bei RT für 20-30 min.
3. 20 ml/10 cm Gericht N2/FGF2/EGF/Y-27632 Sehr vorsichtig hinzufügen, ohne die Tropfen zu stören. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C.
4. Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage mit N2/FGF2/EGF.
   Hinweis: NC-Zellen erweitert oder agiert etwa alle 4-5 Tage oder, wenn sie beginnen häufen sich in den Tröpfchen.
5. Um Durchgang die NC-Zellen, entfernen Sie das Medium, wash die Zellen einmal mit PBS und 1x 8 ml accutase/10 cm Schüssel. Inkubation für 20 min bei 37 ° C.
6. Pipettieren Sie die Zellen von der Platte mit einer 5 ml Pipette und übertragen Sie sie auf einem 15-ml-Tube. In 6 ml 1x PBS.
7. Dreh die Zellen 5 min bei 114 x g.
8. Resuspendieren der Zellen in N2-Differenzierungsmedium mit 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF und 10 uM Y-27632-dihydrochlorid um 20.000 Zellen/10 ul Tröpfchen ergänzt haben.
9. Ausstrich die Zellen in 10 ul Tröpfchen auf getrocknet PO / Lam / FN-Platten. Lassen Sie die Gerichte stehen bei RT für 20-30 min.
10. Vorsichtig 20 ml/10 cm Gericht N2/FGF2/EGF/Y-27632. Bei 37 ° C.
    Anmerkung: NC-Zellen aufrechterhalten oder für bis zu 2 Wochen als relativ homogene Vorläuferpopulation expandiert werden. Längere Kultur kann dazu führen, in diverse Nachkommen Zelltypen differenzieren.

Representative Results

Die beiden wichtigsten Verbesserungen der R-NC-Protokoll über die MS5-R-NC-Protokoll ¹¹ der Feeder-frei, definiert Differenzierungsbedingungen und die allgemeine Verkürzung der Zeitbedarf. MS5 Feeder-Zellen sind ¹³ Maus-Knochenmark-abgeleiteten Stromazellen, die gezeigt haben, neuronale Differenzierung von hES-Zellen ¹⁴ zu unterstützen. HESCs kultiviert auf MS5 Feeder-Zellen bei einer Dichte Form epithelialen Strukturen niedrig und neuronalen Rosetten ^15, an der Peripherie der NC-Zellen entstehen ^10, so imitiert frühen menschlichen neuronalen Entwicklung. Es ist jedoch nicht klar, welche Signalmoleküle und Wachstumsfaktoren werden von MS5 Feeder-Zellen freigesetzt. Daher werden die Differenzierungsbedingungen schlecht definiert, so dass es schwierig ist, sie in wiederkehrenden Experimenten und in hpSC Linien reproduzieren. Für eine ausreichende neurale Induktion, haben hESCs bei niedrigen Dichte in kleinen Kolonien auf Feederzellen ausgesät MS5 werden, Komplikationenting Up-Scaling und das Erreichen hoher Ausbeuten von differenzierten Zellen. Im Jahr 2009 wurde ein Verfahren entwickelt, dass bei neuralizing hPSCs sehr effizient ¹² ausgerichtet. Bei diesem Verfahren hPSCs in hoher Dichte in Abwesenheit von Feeder-Zellen ausgesät MS5, in Monoschichten, Erzielung hoher Ausbeuten an neurale Induktion in 10 Tagen. Wir folgten dem Schema dieser Methode bei der Anpassung der MS5-R-NC Differenzierungsprotokoll (Abbildung 1A). HPSCs in Kolonien auf MEFs (1B) kultiviert wurden, als Einzelzellen in einer Monoschichtkultur mit hoher Dichte (Fig. 1C) dispergiert und auf Matrigel ausgesät. Am Tag 11 der Differenzierung haben die Mehrzahl der Zellen erfolgreich neuralized (Pax6-positiven, nicht gezeigt, ^12). Replattierung die Zellen in hoher Dichte in Tröpfchen ermöglicht die Bildung von Kondenswasser neuralen Rosetten innerhalb des Tröpfchens (1D und Abbildung 2). NC-Zellen entstehen an den Grenzen der neuralen Rosetten (1D </ Strong>) und wandern aus dem Tröpfchen (1E). Nach 7 Tagen Kultur werden die weiteren NC-Zellen durch FACS-Sortierung isoliert werden. HNK-1/p75 doppelt positiven NC-Zellen können an der Effizienz von 20-40% (1F) isoliert werden. Dieses Protokoll erfordert 18 Tage, während die MS5-R-NC-Protokoll erfordert bis zu 35 Tage, so dass die R-NC Zellenprotokoll nützlich für eine Vielzahl von nachfolgenden Anwendungen.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, NC-Zellen zu erzeugen in einer kürzeren, reproduzierbare und billiger-Protokoll, was die gleichen Zellen wie der alte NC-Protokoll. Wir haben dieses neue Protokoll verwendet werden, um erfolgreich zu differenzieren mindestens 10 hESC und hiPSC Linien und gesunden Kontrollen (Daten nicht gezeigt) von Patienten stammen, zeigt solide Reproduzierbarkeit des Protokolls über verschiedene hpSC Linien. Das neue Protokoll spart Kosten aufgrund der Verwendung von LDN gegen Noggin, weniger Einsatz von SHH und das Fehlen MS5 Produktionskosten. Das neue Protokoll dauert 18 Tage im Vergleich zu 35 Tages in der alten Protokoll, das ca. 5 Fütterungen und damit die zugehörigen Medienkosten spart. Um zu untersuchen, ob die mit den beiden Protokollen hergestellten Zellen haben ähnliche Identität zeigen wir, dass NC-Zell-Entwicklung in beiden Protokollen folgt dem gleichen Differenzierungsmuster (Abbildung 2). Die Zellen durchlaufen eine neuronale Rosettenstadium liefern und NC-Zellen mit identischer Morphologie nach FACS-Sortierung. Die kleinere Größe der neuronalen Rosetten in dem neuen Protokoll gegenüber dem alten Protokoll nach der Neubelegung am Tag 11 aufgrund der hohen Zelldichte. Dagegen in den alten Protokoll Rosetten bilden innerhalb hpSC Kolonien, die nicht kondensiert sind. NC-Zellen mit den zwei Protokollen abgeleitet drücken die gleiche biologische NC Marker, wie HNK-1, AP2 und Nestin. Wir analysierten NC-Zellen mit den beiden Protokolle auf einer globalen Genexpressionsebene (3A) erstellt und festgestellt, dass NC-Zellen, die mit den beiden Protokollen erzeugt Cluster eng zusammen. NC-Zellen, die Gattungen warented durch Aktivierung des wnt-Signalwegs (wnt-NC) und wurde gezeigt, dass das Potential zur Erzeugung von Melanozyten ^16, Cluster getrennt, wenn durch die globale Genexpression analysiert, was anzeigt, dass dies eine andere NC Bevölkerung. In der Tat haben wir es nicht gelungen, Melanozyten-Vorläuferzellen in vitro aus R-NC oder MS5-R-NC-Zellen (Daten nicht gezeigt) zu erzeugen. Ebenso Neuroepithelzellen (LSB), für 10 Tage in LDN193189 und SB431542 differenziert zeigen nur eine klar abgegrenzte Genexpressionsmuster. Neuroepithelzellen sind frühe Vorläuferzellen des Nervensystems und sind daher weniger differenzierten Zellen, verglichen mit NC und werden hier als negative Kontrollgruppe einbezogen. Um zu beurteilen, wenn die R-NC-Zellen erzeugt hier ähnlich wie bei den Zellen, die mit dem alten Protokoll gemacht sind, zeigen wir ihre Migrationsfähigkeit in einem in vitro-Assay Kratzer (3B). 48 Stunden nach dem Kratzen eine konfluente gut sortierter R-NC-Zellen, in die scra wandern die Zellentch erfolgreich. Schließlich zeigen wir, dass R-NC-Zellen haben das Potential, in Zellen aus dem autonomen Nervensystems zu unterscheiden. Die Zellen wurden spontan für 4 Tage nach HNK1 + / p75 + FACS differenziert und für Mash1 und Tuj1, Gene, die in autonomen Neuronen (3C) ausgedrückt werden gefärbt.

Abbildung 1. Kritische Schritte in der R-NC Differenzierung Protokoll. A. MS5-R-NC ^10,11 und R-NC Differenzierung Protokollschema. Die spezifischen Differenzierungsschritte der beiden Protokolle gezeigt. MS5: Feeder-Stromazellen, KSR: KSR-Differenzierungsmedium, N2: N2-Differenzierungsmedium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic hedgehog, 8: FGF8, A: Ascorbinsäure, B:. BDNF B. Zeigt undifferenzierte Kolonien hpSC gefärbt mit Oct-4 und DAPI vor der Induktion der Differenzierung. C. Zeigt die Zelldichte (90-100% Konfluenz) am Tag 0 der Differenzierung, typischerweise 1 Tag nach dem Ausplattieren hPSCs. D. Zeigt neuralen Rosetten mit Pax6-und Schwellen NC-Zellen mit HNK-1 innerhalb des Tröpfchens. E befleckt. Tag 13 Zellen zeigt, an Tag 11 in Tröpfchen und NC-Zellen, die aus der Kante des Tropfens. F erneut plattiert. Repräsentative FACS-Sortierung Grundstück, zeigt HNK-1/p75 doppelt positiven NC-Zellen am Tag 18 der Differenzierung. Die Tore wurden auf der Grundlage der ungefärbten und gefärbten Einzel Kontrollen (nicht gezeigt) gewählt. FACS-Sortierung Parzellen zwischen Experimenten hpSC Linien und die Verwendung der alten oder neuen Protokolls in Bezug auf den Anteil der Doppel positive und einzigen positiven Zellen unterscheiden. Daher ist es wichtig, die doppelt positiven Bevölkerung zu isolieren, um sicherzustellen, dass die richtigen NC-Zellen extrahiert werden. Bilder C bis F wurden mit der neuen R-NC-Protokoll erzeugt.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Vergleichbare Neuralleistenzellen Identität der Zellen mit dem MS5-R-NC-oder R-NC-Protokoll abgeleitet. In beiden Protokollen die Zellen durchlaufen eine neuronale Rosettenstadium. Sortiert NC-Zellen identisch aussehen von Morphologie und durch Expression von NC-Marker wie HNK-1 und AP2. NC-Zellen sind Nestin-positiv, die zeigen, dass sie sind Vorläuferzellen. Maßstabsbalken: 200 um. Alle Bilder sind für Fluoreszenz DAPI gegengefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. NC-Zellen, die mit dem alten und dem neuen Protokoll erzeugt haben ähnliche Identität. A. Unbeaufsichtigte Clustering von Illumina-Microarray Genexpressionsdaten zu vergleichen NC-Zellen mit dem MS5-R-NC-und der R-NC-Protokoll abgeleitet. NC-Zellen mit dem MS5 NC-R-oder R-NC-Protokoll am Tag 35 oder Tag 18 bzw. abgeleitet wurden dreifach durch Hybridisierung mit einer menschlichen Illumina 12 Oligonukleotid-Array analysiert. Die Datenanalyse wurde mit der Partek Genomic Suite-Software durchgeführt. Signifikante Unterschiede wurden als solche mit einem Fold Change größer als 2 und FDR weniger als 0,05 definiert. 1.421 Gene analysiert. Standardeinstellungen, wie euklidischen Probe Unähnlichkeit, Durchschnitts Verknüpfung Cluster-Verfahren und 25 für Dendrogramm Länge verwendet. NC-Zellen durch Aktivierung Wnt-Signal (wnt-NC) induziert wurden aufgenommen (die Zellen differein LDN193189 Tag 0-3, 0-4 Tage SB431542 ntiated, CHIR99021 Tag 0-11 FACS sortiert und an Tag 11 für sox10) ^16. Diese Zellen Cluster getrennt von R-NC-Zellen, die anzeigt, dass Wnt-NC-Zellen und R-NC-Zellen sind unterschiedliche Populationen. Zellen für 11 Tage in LDN193189 und SB431542 differenziert wurden als neuroepithelialen Steuer (LSB) enthalten. R-NC und MS5-R-NC-Zellen Cluster im Vergleich zu den Kontrollzellen eng zusammen. Raw Genexpressionsdaten sind auf GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) Beitritts # verfügbar:. GSE50643 B. Migration-Assay. HNK1 + / p75 + FACS sortiert R-NC-Zellen wurden auf PO / Lam / FN in 96-Brunnen überzogen und von Hand 24 Stunden später zerkratzt. Die 0 hr Bild wurde unmittelbar nach dem Kratzen und Post-Färbung mit Hoechst übernommen. Die übrigen Brunnen wurden für 48 h migrieren, bevor das zweite Bild aufgenommen wurde. Maßstabsbalken: 200 C um. Sortiert R-NC-Zellen wurden für 4 Tage spontan zu differenzieren und wurden für Ma gebeiztsh1, Tuj1 und DAPI. Maßstab:. 500 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Für die erfolgreiche Differenzierung von R-NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / hiPSCs die folgenden Überlegungen sollten gemacht werden. Es ist kritisch, unter sterilen Kulturbedingungen jederzeit arbeiten. Insbesondere ist es wichtig, hpSC Kulturen für Mykoplasmen regelmäßig zu prüfen, da diese Kontamination erfolgreich Differenzierung behindern, aber nicht ohne weiteres visuell in hpSC Kulturen. Die R-NC Differenzierung sollte bei 90-100% Zelldichte eingeleitet werden; niedriger Zelldichte wirkt sich das Zellüberleben und die Effizienz der R-NC-Differenzierung. Es ist wichtig, empirisch zu validieren optimalen Konzentrationen und Chargennummern von einigen der Reagenzien, insbesondere für die Unterstützung KSR effiziente NC-Differenzierung. Wenn die Zellen am Tag 11 in Tröpfchen erneut ausplattiert, sollte die Zelldichte im Bereich von 10 &mgr; l Tröpfchen hoch sein und wird am besten empirisch bestimmt. Proper Rosette-und NC-Bildung hängt von der geeigneten Zelldichte innerhalb des Tröpfchens. Wir empirisch Beobachved erhöhte das Überleben der Zelle, wenn die Zellen mindestens zweimal nach der Behandlung mit Accutase gewaschen. Für die erfolgreiche Isolierung von R-NC-Zellen durch FACS die richtigen experimentellen Steuerelemente, wie ungefärbt, Single-Antikörper gefärbt und sekundären Antikörper nur gefärbten Zellen entscheidend sind. Tote Zellen können durch DAPI, 7-AAD oder Propidiumiodid-Färbung ausgeschlossen werden. Außerdem sollten Antikörperverdünnungen empirisch für jede Menge spezifischer Antikörper bestimmt werden. Es ist wichtig, zu reinigen FACS R-NC-Zellen durch Doppelfärbung mit HNK-1 und p75, da einzelne Färbung kann zu einer Kontamination der NC Bevölkerung mit unerwünschten Zelltypen, wie z. B. p75-positiven ZNS-Zellen, frühe Mesoderm oder Plakode führen. Nach unserer Erfahrung Prozentsätze der Doppelgegenüber Einzelbunt Populationen zwischen hpSC Linien und Differenzierungsexperimente variieren. R-NC Überleben der Zellen nach FACS können durch die Vermeidung von harten Pipettieren der Zellen, sondern blätterte der Röhre wieder auszusetzen ist ratsam, die Zellen erhöht werden. Auch Beschichtung R-NC FACSisolierten Zellen in konditioniertem Medium (gefilterte Medium wuchsen die Zellen vor dem FACS) wurde gezeigt, dass das Überleben ¹¹ zu verbessern. Es ist ratsam, einen kleineren Maßstab, Differenzierung parallel, die mit der neuronalen epithelialen Marker Pax6 an Tag 11 und Tag 14 Bunt können, um eine effiziente Neutralisation und Rosettenbildung zu gewährleisten. NC-Marker, wie HNK-1 oder AP2 am Rosettenstadium für die richtige NC Differenzierung sollte auch bewertet werden. Außerdem sollte isoliert R-NC-Zellen durch Morphologie und Färbung für NC-Marker, wie AP2, HNK-1 und Nestin (Fig. 2) überprüft werden.

Die Ableitung der MS5-R-NC-Zellen aus hpSC wurde 2007 von Lee et al. ¹⁰ beschrieben. Es wurde gezeigt, dass diese Vorläuferpopulation vermehrt und in vitro weiter differenziert in Derivate der NC-Linie. MS5-R-NC-Zellen können spontan mit Hilfe der neuronalen ^10,17 Kugelverfahren unterschieden werdenoder durch in vitro Differenzierung gerichtet. Es wurde festgestellt, dass MS5-R-NC-Zellen entstehen Zellen des peripheren Nervensystems (autonome und sensorische Neuronen), periphere Glia (Schwann-Zellen), Myofibroblasten, mesenchymalen Stammzellen und deren Nachkommen und glatten Muskelzellen ¹⁰ geben kann. Transplantation in Küken und Mäusen zeigten, dass MS5-R-NC-Zellen wandern und zu differenzieren in vivo ^10. MS5 NC-R-Zellen wurden weiter bei der Modellierung von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Die charakteristische Phänotyp der genetischen Krankheit Familiäre Disautonomia (FD) wurde in vitro mit patientenspezifischen hiPSC abgeleitete MS5-R-NC-Zellen ² modelliert. NC charakteristischen Phänotypen, wie dysfunktional NC-Zell-Entwicklung und Migration wurden in Zellen von FD-Patienten gewonnen wurden, aber nicht in gesunden Kontrollzellen gezeigt. MS5-R-NC-Zellen sind auch verwendet worden, um die toxikologische Prüfung von Verbindungen beeinflussen Neuralleiste Migration während der embryonalen etablierenEntwicklung, mit dem Potenzial, die Freisetzung von Medikamenten, die zukünftige Entwicklung des Nervensystems negativ beeinflussen könnten ⁵ zu vermeiden. Eine spannende Anwendung der Technologie ist hpSC Hochdurchsatz-Screening und Testen von pharmazeutischen Behandlungsmöglichkeiten für Erkrankungen des Menschen. MS5-R-NC-Zellen verwendet wurden, um den ersten solchen Bildschirm in einer iPS-basierten Krankheitsmodell, dh familiärer Dysautonomie ⁴ erreichen. Dieser Bildschirm führte zur Identifizierung neuer Verbindungen, die weiter in klinischen Studien untersucht werden können.

Für alle Anwendungen des Feldes hpSC es kritisch genaue, reproduzierbare, definierte und spezifische in vitro Differenzierungsprotokollen zur Verfügung zu haben. In diesem Bericht zeigen wir die Anpassung eines etablierten in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von R-NC-Zellen aus hPSCs. Das Protokoll berichtet die gleichen Zellen wie zuvor in mehreren definierten Kulturbedingungen berichtet, ¹⁰ und eine shorte ergibtr Zeitrahmen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um R-NC-Zellen für menschliche Krankheiten, die Zellen von der NC-Linie zum Screening von Verbindungen, toxikologischen Prüfung und der weiteren Entwicklung der gerichteten Differenzierungsprotokollen zu Zelltypen von der NC-Linie abgeleitet erzeugen.

Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Acknowledgments

Und dem Tri-institutionellen Stammzellen-Initiative (Starr-Stiftung); Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für fortgeschrittene Forschende des Schweizerischen Nationalfonds und durch Zuschüsse aus NYSTEM (C026447 C026446) unterstützt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008

References

1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
3. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
4. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
6. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
7. McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
8. Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
9. Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
10. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
11. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
13. Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
14. Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
15. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
17. Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).

Tags

Neuroscience Ausgabe 87 Embryonale Stammzellen (ESC) pluripotenten Stammzellen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) Neural Crest Periphere Nervensystem (PNS) pluripotente Stammzellen Neuralleistenzellen, Krankheit Modellierung Differenzierungsprotokoll menschliche embryonale Stammzellen menschliche pluripotente Stammzellen