İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Summary

Insan pluripotent kök hücreleri (hPSC) türetilmiş nöral krest (NC) hücreler, insan gelişimi ve hastalık modelleme ve hücre replasman tedavileri için büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, şu anda yaygın olarak kullanılan bir besleyici ücretsiz adaptasyon

Abstract

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs) tabak içinde, insan hastalıklarının modellemek için hastalık veya kaza sonrası uygulamalarda rejeneratif transplante edilebilir hücre kaynağı olarak, insan embriyo gelişimini incelemek için büyük bir potansiyele sahiptir. Sinir tepe (NC)-hücreleri, periferik sinir sistemi ve glia, melanositler ve mezenkimal hücrelerden hücreler gibi yetişkin somatik hücre, büyük bir çeşitlilik için öncülerdir. Bunlar hücre kaderinin şartname ve göç dahil olmak üzere insan embriyonik gelişim, yönlerini incelemek için hücre değerli bir kaynaktır. Terminal olarak farklılaşmış hücre tipleri NC projenitör hücrelerin farklılaşma başka, in vitro olarak insan hastalıklarının Modele hastalık mekanizmalarını incelemek ve rejeneratif hücrelere ilaç üretmek için imkanı sunar. Bu makalede, hPSCs NC hücrelerinin türetilmesi için bir mevcut in vitro farklılaşma protokol adaptasyonu sunar. Bu yeni protokol sorumluluk yönün 18 gün gerektirirrentiation, besleyici-özgür insan embriyonik kök hücre (HESC) hatları gibi insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları arasında kolayca ölçeklenebilir ve yüksek tekrarlanabilir olduğunu. Hem eski hem de yeni protokoller eşit kimlik NC hücreleri verim.

Introduction

İnsan embriyonik kök hücreleri (HESC) ve insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) iyi hayvan modelleri ne birincil dokular ne mevcut olduğu için insan hastalıkların araştırılması ve gelecekteki tedavisi için özellikle, muazzam bir potansiyel göstermiştir. HESC / hiPSC tekniği Uygulama örnekleri aşağıdaki gibidir: Özellikle ilgi çekici hücreleri sınırsız miktar ¹ de rejeneratif tıp için HESC / hiPSCs oluşturulabilir. Hücreler, belirli bir hastalık taşıyan hastaların üretilen ve vitro hastalık modellerinde ^2,3 kurmak için kullanılabilir. Bu tür hastalık modelleri daha sonra yeni ilaç bileşikleri ⁴ arayışı hem de etkinlik ve toksisite ⁵ için mevcut ilaçların test büyük ölçekli ilaç taraması için kullanılabilecektir. In vitro hastalık modelleri, yeni hastalık mekanizmalarının tanımlanmasına yol açabilir. HESC / iPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için spesifik ile çalışmak önemlidir, iyi tanımlamaksöz konusu hastalığın etkilenen d hücre türleri. Bu nedenle, katı ve tekrarlanabilir in vitro farklılaşma protokollerin kullanılabilirliği HESC / hiPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için çok önemlidir. Protokoller HESC / hiPSC hatları ve farklı araştırmacılar arasında en az değişkenlik, zaman gider, çaba, zorluk ve maliyet hem de maksimum tekrarlanabilirlik gösteriyor ki arzu edilir.

Nöral krest (NC) hücreleri epidermis ve nöral epiteli arasında omurgalı nörülasyon sırasında ortaya çıkar. , Çoğaldıkları ve gelişen embriyonun boyunca göç eder ve yaygın olarak kemik / kıkırdak, kraniofasiyal iskelet, duyu sinirlerinin, Schwann hücreleri, melanositler, düz kas hücreleri, bağırsak, nöronlar, otonomik nöron, kromafin hücreleri de dahil olmak üzere, soy hücre tiplerinin etkileyici bir çeşitliliği doğuran , kalp septum hücreleri, diş ve adrenal / tiroid salgı bezi hücreleri ^6. Bu durumda, hücreler, Kuzey Carolina çekici bir hücre alanı için kök hücre tipi ve için önemlidirBu tür Hirschsprung hastalığı ^7, Ailevi Disotonomi ⁸ yanı sıra ⁹ gibi nöroblastoma kanser gibi hastalıkların, çeşitli modellenmesi. Dahası, in vitro insan embriyonik gelişim yönlerini incelemek için imkanı sunuyoruz.

Şu anda mevcut ve yaygın olarak hESC ^10,11 NC hücrelerinin türetilmesi için vitro farklılaşma protokolünde uygulanan farklılaşma 35 güne kadar sürer ve bu gibi MS5 stromal hücreleri gibi besleyici hücreleri üzerinde uyarılmasını sinir içerir ve bu nedenle yetersiz tanımlanmış koşullar altında gerçekleştirilir. Bu NC hücreleri büyük miktarlarda üretmek için ölçekli kadar olabilir, yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama ⁴ için gerekli olan, örneğin, bu iş ve maliyet yoğundur. Ayrıca, yeniden zor olabilir sinir rozet, elle pasajlanmasını da içerir ve bu HESC veya hiPSC büyük bir çeşitlilik uygulandığı zaman bu nedenle, özellikle genel olarak değişkenlik, tabidirçizgiler. Burada, besleyici hücre içermeyen bir 18 günlük protokolünde NC hücrelerin aşamalı türetme gösterilmiştir. Bu yöntem, şu anda kullanılan protokol daha kısa ve daha belirgin olduğunu. Ayrıca, farklı hiPSC hatları arasında NC hücreleri üreten çok sağlamdır. Önemlisi, bu iki protokol tarafından vermiştir NC hücreler nöral rozetler (bundan sonra adlandırılan rozet-NC ya da R-NC) sınırında ortaya olduğu gösterilmiştir. Iki protokolden birini kullanarak elde edilen hücreler aynı NC işaretleri ifade ve mikroarray analizi birlikte küme, morfolojik aynı görünüyor. Yeni protokolü (R-NC) kullanılarak elde edilen NC hücreleri göç ve daha fazla nöronların içine ayırt olabilir böyle eski protokolü (MS5-R-NC) kullanılarak elde edilen NC hücrelerine benzer, işlevseldir. Bu yüzden, hücreler, MS5-R-NC hücreleri ile eş zamanlı olarak kullanılabilir. HESC / iPSC NC hücrelerin derivasyon için R-NC hücre protokol NC soy içeren HESC / iPSC teknolojisinin tüm uygulamalar için faydalı olacaktır. </ P>

Protocol

1.. Kültür Medya, Kaplamalı Yemekleri ve hPSCs ve Bakım hazırlanması

1.1 Medya hazırlık

Not: en fazla 2 hafta boyunca karanlıkta 4 ° C'de sterilizasyon ve mağaza için tüm ortamı Filtre. Reaktif isimler, şirket ve katalog numaraları Malzeme tabloda listelenmiştir.

1. DMEM/10% FCS: 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep ve 5 ml L-Glutamin birleştirin.
2. HES-ortamı: 800 ml DMEM/F12, KSR 200 mi, 5 ml L-glutamin, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum esansiyel amino asitler çözeltisi, 1 ml β-mercaptoethanol birleştirin. FGF-2 ortamın süzülmesi ve sonra 10 ng / ml ilave edilir.
   DİKKAT: β-Mercaptoethanol inhalasyon, yenmesi ve cilt temasından kaçınmak, zehirlidir.
3. KSR-farklılaştırma ortamı: 820 ml DMEM Knockout, KSR 150 mi, 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum esansiyel amino asitler çözeltisi ve 1 ml β-mercaptoethanol birleştirin.
4. N2-differentiatiortamı üzerinde: 980 ml ​​dH ₂ O 12 g DMEM/F12 toz çözündürün 1.55 g Glukoz, 2 g sodyum bikarbonat ve 100 mg APO insan transferin ekleyin. Ortama çözünmüş çözeltisi ekleyin, 25 mg insan insülini ve 40 ul 1 N NaOH ile 2 ml dH ₂ O karıştırın. 100 ul putressin dihidroklOliirürü, 60 ul selenit, 100 ul progesteron ekleyin ve dH ₂ O. ile 1 L'ye kadar ses getirmek

Kültür kaplarına 1.2 Kaplama

1. Matrigel kaplama: Çözülme 1 ml 'çözülene kadar bölenin üzerine 19 ml DMEM/F12 pipetleyerek matrigel alikosunu donduruldu. 40 mikron hücre süzgecinden ve plaka 8 ml/10 cm çanak geçirilerek kümeleri kaldırmak. Oda sıcaklığında 1 saat için yemekler inkübe edin. Hücrelerin hemen önce, kaplama Matrigel aspire.
   Not: 4 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda gelme çünkü matrigel ile hızlı çalışın
2. PO / Lam / FN kaplama: 10 cm çanak için 15 ug / ml Poli-L Ornithin hidrobromitin içeren 1x PBS 10 ml ekleyin. 37 ° C'de gece boyunca inkübe çanak 1x kez PBS ile yıkayın plakaları ve 2 ug / ml fare Laminin-I ve 2 ug / ml ihtiva eden fibronektin 1x PBS 10 ml/10 cm tabak ekleyin. 37 ° C'de gece boyunca inkübe yemekler Hücreleri kaplama önce tamamen çözüm kaldırmak ve plakalar üzerinde kapak olmadan doku kültürü kaputu duvara onları ayakta tarafından 15-20 dakika oda sıcaklığında iyice kurumasını bekleyin.
   Not: yemekleri bir (gözle görülebilir) yüzeyinde kristal yapıları görebilirsiniz zaman tamamen kuru ve hücre kaplama için hazırız. Plakalar, bu kurutulmuş halde bir kaç saat için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. PO / Lam / FN yemekler 2 gün önceden hazırlıklı olmak zorunda. Acil durumlarda, Lam / FN sadece 2-4 saat inkübe edilebilir. Ancak, bu optimal farklılaşma / sağkalım sonuçlarını riski olabilir.

HPSCs 1.3 Bakım

Not: hPSCs% 0.1 jelatin ve mitotikal inaktive fare embriyonik fibroblast (M tutulurHES-ortam içinde EFs) ile takviye edilmiş 10 ng / ml FGF-2, daha önce tarif edildiği gibi ^10,12. Hücreler 6-8 gün, her bölünmüş olmalıdır.

1. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (magnezyum veya kalsiyum olmadan 1x PBS) 8 ml,% 0.1 jelatin ile kaplayın, 10 cm tabak.
2. Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla dondurulmuş MEFS çözülme. 10 ml DMEM/10% FBS 1 milyon MEFS ekleyin.
3. Jelatin aspire ve hücreler plaka. En az 6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
4. 1x PBS ile bir kez, plakayı yıkayın ve 10 uM Y-27632 dihidroklorid ile takviye edilmiş 10 ml HES-orta ekleyin, hazırlanan MEF plakadan DMEM/10% FBS aspire. Aracı, 20 dakika boyunca 37 ° C 'de ısınmasına izin verin.
   Not: hPSCs manuel bölmek için gömülü bir mikroskop ile bir laminer akış kaputu kullanılır. Bununla birlikte, hücreler, uygun alternatif yöntemler kullanılarak geçişli olabilir.
5. Gömülü bir mikroskop ile bir laminer akış kaputu altında, bir hücre hırsızı kullanarak ayrı koloni ayırmak ve onları şamandıra izin.
6. Bir kullanınYüzen koloniler aspire ve taze, sıcak MEF plaka üzerine sevketmek 1 ml şırınga. Yeni çanak hücrelerin yaklaşık olarak dörtte biri aktarın. 37 ° C'de inkübe edin
7. Taze HES orta günlük hücreleri besleyin.

Farklılaşma için hPSCs 2. Kaplama

Not: hPSCs (Şekil 1B bakınız) bölmek veya kaplama farklılaşması için koloniler büyük olduğunda, ama yine de kendi sınırları mümkün ayırt hücreleri olduğunca az ile keskin kenarlara sahip olmalıdır. Hücreler manuel Pasajlanması kullanılarak korunur zaman koloniler kolayca gözle görülemeyecek kadar büyük olmalıdır. Bu zaman noktası için doğru fikir almak için bir pasaj olmadan iki hafta için ayrı hPSC çanak korumak ve hücreler ulaşmak izlemek ve onları ayırt / geçiş için ideal bir zaman noktasını geçebilir.

1. Farklılaşmasını başlamadan önce matrigel 1 saat ile 10 cm yemekler hazırlayın. Başarılı matrigel kaplama olabilir,4x büyütme doğrulandı.
2. HPSCs bölünmüş hazır olduğunda, ortam aspire ve hücreler% 0.05 tripsin-EDTA 4 ml.
3. Tek hücreler mikroskop altında plaka kaldırma gibi MEFS görebilirsiniz kuvvetlice kadar 2 dakika boyunca yatay çanak çalkalayın. HPSC koloniler koloniler olarak takılı kalır.
4. Hemen ve iyice tripsin aspire ve plaka, 2-4 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
5. Plakasına HES-orta 2 ml ilave edilir ve P1000 pipet kullanılarak, hücreleri ayırmak.
   Not: hücreler kolayca yüzeyden kaldırılabilir edilemiyorsa, plaka, bir 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırılır, boş olabilir.
6. 10 uM Y-27632 dihidroklorid ile takviye 8 ml HES-ortamına hücreleri aktarın.
7. Önceden hazırlanan, 10 cm çanağından aspire Matrigel. Matrigel plaka üzerine (10 cm tabak ikinci Hücreler iki 10 cm çanaklara bölünmüş, örneğin), 1:1 veya 1:02 oranında hücreleri Plate. 37 ° C de inkübeGece boyunca C.
   Not: Bu kaplama yaklaşık olarak 100,000 hücre / cm ² sonuçlanmalıdır.

Nöral Farklılaşma 3. İndüksiyon

Not: hücreler,% 90-100 sıklıkta (Şekil 1C bakınız), genellikle aşağıdaki gün zaman farklılaşması (gün 0) başlatılabilir. Doğru confluency henüz ulaşılamadığı takdirde onlar farklılaşması için hazır olana kadar, hücreler HES-orta günlük beslenebilir. Alternatif olarak, kaplama hücrelerinin ilk sayısı arttırılabilir.

1. 3 0. günde, 0.1 uM ve 10 uM LDN193189 SB431542 içeren KSR farklılaşma orta çanağı 10 ml/10 cm günlük hücreleri besleme.
2. Gün 4 ve 5 yem% 75 KSR-farklılaşma orta ve% 25 N2-farklılaşma orta hücreler LDN193189 ve SB431542 içeren hem de.
3. 6 ve 7 gün besleme üzerinde% 50 KSR-farklılaştırma ortamının ve% 50 N2-farklılaşma ortamı ile hücreler LDN193189 ve SB4 ihtiva eden hem de31542.
4. Gün 8 ve 9 yem% 25 KSR-farklılaşma orta ve% 75 N2-farklılaşma orta hücreler LDN193189 ve SB431542 içeren hem de.
5. 11. günde hücre şarjı için 1.2.2 belirtildiği gibi günde 9 ve 10, PO / Lam / FN yemekler hazırlamak.
6. Günde N2-farklılaştırma ortamının 10 besleme hücreleri LDN193189 ve SB431542 ihtiva etmektedir.

NC Şartname damlacıklar 4. Replating

1. Gün 11 aspirat Lam / FN önceden hazırlanmış plakalardan ve 1.2.2 de açıklandığı gibi bunları, 20-30 dakika süreyle oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin.
2. Ayırt hücreleri orta çıkarın, 1x PBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve 8 ml accutase/10 cm çanak eklemek. 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe
3. Hücre kaldırıcı kullanarak, hücreleri ayırmak ve bir 5 ml pipetle Accutase bunları tekrar süspansiyon. Bir 15 ml tüp süspansiyon aktarın.
4. 1x PBS içinde 5 ml ilave edilir ve 114 x g, 5 dakika boyunca hücreleri döndürün.
5. 10 ml 1 hücrelerin tekrarx PBS. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak 40 mikron hücre süzgecinden filtre ve Hemasitometre veya eşdeğer tekniği kullanarak hücreleri saymak.
6. Aşağı hücreleri Spin ve 100,000 'lik bir konsantrasyonda 200 uM askorbik asit (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632 dihidroklorür içeren N2-farklılaştırma ortamı içine yeniden süspanse -150000 cells/10 ul.
7. Onları kurutulmuş PO / Lam / FN 15 cm yemekleri üzerine dokunmadan birbirine yakın bir tekrar-pipet, plaka 10 ul damlacıkları kullanarak.
   Not: farklılaşmış hücrelerin biri 10 cm çanak normalde yaklaşık 2-3 kez 15 cm yemekleri ya da yaklaşık olarak 100 x 10 ul droplets/15 cm çanak sonuçlanır.
8. Damlacıklar N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y 30 ml ekleyin ve 37 ° C de inkübe edilir (damlacıkları rahatsız olan) çok dikkatli bir şekilde, daha sonra, 20-30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin
9. 12. günde, dikkatli bir şekilde 20 mL/15 cm tabak N2/AA/BDNF/FGF8/SHH ile hücrelerin beslenir.
10. Da 'dany 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8 her ikinci veya üçüncü gün hücreleri beslemek.
11. Günde 16 ve 17 FACS sıralama sonra NC hücreleri replate PO / Lam / FN plakaları hazırlamak.

5. Floresan Aktive Hücre NC hücre sınıflandırması (FACS)

Not: FACS için hücrelerin hazırlanması, yaklaşık olarak 2 saat gerektirir.

1. Gün 18 remove ortamı üzerinde, çanak 1x bir kez PBS ile yıkayın ve hücreler 12 mi Accutase ekleyin. 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri
2. Bir hücre hırsızı kullanarak, yüzey hücreleri ayırmak ve onları şamandıra izin. 50 ml'lik bir tüpe transfer ve 1 x PBS, 30 ml ekleme, 5 ml pipet kullanılarak bir süspansiyon içine hücreleri Pipet. 114 x g, 5 dakika boyunca hücreleri dönerler.
3. P1000 bir pipet kullanarak, 1 ml% 2 FBS / HBSS (HBSS, 15 mM HEPES ihtiva etmektedir) içinde tekrar süspansiyon hücreleri. % 2 FBS / HBSS 19 ml ilave edilir ve tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için 40 mikron hücre süzgecinden hücreleri filtre. 15 dakika daha buz üzerinde hücrelerin inkübeantikor engelleme için ve daha sonra Hemasitometre kullanarak onları saymak.
4. Aşağı hücreleri Spin ve% 2 FBS / HBSS içinde 10000000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon bunları.
5. Yalnızca kontrol (APC okunur ve 488 için) FACS lekeli boyanmamış, tek lekeli (HNK-1, sadece ve sadece p75) ve ikincil antikor 1000000 hücreleri kenara her ayarlayın.
6. Uygun örnekler 1 ml süspansiyon içinde 10000000 hücre başına p75 birincil antikor HNK-1 ile 5 ul 5 ul eklenir ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir.
7. 10 ml 1 x PBS (114 x g hızında santrifüj 5 dakika) hücreler yıkanır ve 1 ml% 2 FBS / HBSS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Uygun örnekler 1 ml süspansiyon içinde APC 2 ul ve 10000000 hücre başına 488 ikincil antikor ilave edin ve 1 ul karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir.
   Not: APC ve 488, sırasıyla, HNK-1 ve p75 boyanması için burada kullanılan ikincil antikorlardır.
8. 10 ml 1 x PBS, hücreleri iki kere yıkayın, 500 ul 10000000 hücreleri tekrar süspansiyonDAPI (0.5 ng / ml) ya da, FACS analizi ölü hücreleri çıkarmak için uygun bir alternatif, canlı hücre lekesi içeren% 2 FBS / HBSS.
9. FACS tüpler uygun örnekleri aktarın.
10. Hücre toplanması için 0.5 ml% 2 FBS / HBSS FACS tüpleri hazırlayın.
    Not: Hücreler ve toplama tüpleri sıralama süre boyunca karanlıkta buz üzerinde tutulur.
11. DAPI, APC ve 488 çeşit DAPI-/HNK-1 + / P75 + çift pozitif hücrelerini tespit edebilen lazer ile bir hücre sıralama makinesi kullanarak.
    Not: Bu hücreler sıralanmış popülasyonundan hariç olmak için Hazırlama Süresi ve hücrelerin ele hücre ölümü küçük bir yüzdesi neden olur, ölü hücreler DAPI lekeler olduğu ve bu nedenle izin verir. Herhangi bir alternatif ölü / canlı leke bu amaç için eşit derecede iyi çalışır. DAPI kendisi canlı hücre popülasyonunda sitotoksisiteye neden olmaz.

6.. SÄ Hücrelerinin replating, Kuzey Bakım ve Genişleme

Not: FACS sıralanmış hücreler el olmalıOptimum hayatta kalmasını sağlamak için özel bakım ile açtı. Onları replating kadar buz üzerinde tutun. Vorteks veya sert onları pipetle etmeyin. Hücreler tüp hafifçe vurarak yeniden süspanse edilebilir.

1. FACS sıralama sonra, onları aşağı spin sonra, NC hücrelerin sayısı ve N2-farklılaşma ortamda tekrar süspansiyon 30.000 hücrelerin onları replate uygun hacminde 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF ve 10 mcM Y-27632 dihidroklorüre ile desteklenmiş / 10 ul damlacıklar.
2. Iyice kuru önce PO / Lam / FN plakaları ve 10 cm çanak plaka başına yaklaşık 50-70 damlacıkları hazırlanmıştır. Yemekler 20-30 dakika oda sıcaklığında bekletin.
3. Çok dikkatli damlacıklarını bozmadan N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm çanak eklemek. 37 ° C de inkübe hücreleri
4. N2/FGF2/EGF her 2-3 günde bir hücreleri besleyin.
   Not: damlacıkların içindeki yığmaya başladığınızda NC hücreleri genişletilmiş veya pasajlandığında yaklaşık olarak her 4-5 günde bir veya edilir.
5. Geçide NC hücreler, orta, wa kaldırmaksh, hücreler bir defa PBS ile ve 1x cm tabak accutase/10 8 ml. 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe
6. 5 ml'lik bir pipet kullanılarak plaka kapalı hücreleri pipet ve bir 15 ml tüp aktarın. PBS 1x 6 ml ekleyin.
7. 114 x g, 5 dakika boyunca hücreleri dönerler.
8. Damlacık ul 20000 cells/10 elde etmek için 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF ve 10 uM Y-27632 dihidroklorid ile takviye N2-farklılaştırma ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
9. Kurutuldu, PO / Lam / FN plakalar üzerine 10 ul damlalar hücreleri Replate. Yemekler 20-30 dakika oda sıcaklığında bekletin.
10. Dikkatle N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm çanak eklemek. 37 ° C'de inkübe edin
    Not: NC hücreleri tutulan ya da nispeten homojen bir ata nüfus olarak 2 hafta boyunca genişletilebilir. Uzun kültür çeşitli döl hücre tipleri ayırt etmek için onları neden olabilir.

Representative Results

MS5-R-NC protokolü üzerinde ¹¹ R-NC protokolünün en önemli iki gelişmeler besleyici ücretsiz, tanımlanmış farklılaşma koşulları ve süre şartına genel kısalma vardır. MS5 besleyici hücreler ¹³ hESC ¹⁴ sinir farklılaşmasını desteklemek için gösterilmiştir fare kemik iliği stromal türetilmiş hücrelerdir. HESC böylece erken insan nöral gelişimi taklit eden, Kuzey Carolina hücreler ¹⁰ ortaya hangi periferinde, düşük yoğunluklu bir şekilde epitel yapısı ve nöral rozet ¹⁵ at MS5 besleyici hücreleri üzerinde kültürlenmiştir. Ancak, bu molekülleri ve büyüme faktörleri sinyal MS5 besleyici hücreler salınır ne olduğu açık değildir. Bu nedenle, farklılaşma durumları kötü zor tekrarlayan deneylerde ve hPSC hatları üzerinden bunları üretmek için yapım tanımlanır. Yeterli nöral indüksiyon için, HESC komplikasyon, MS5 besleyici hücreler üzerine küçük koloniler halinde düşük yoğunlukta numaralı seribaşı olmasıting ölçekleme-up ve farklılaşmış hücrelerin yüksek verim ulaştı. 2009 yılında, bir yöntem çok verimli ¹² hPSCs neuralizing yönelik geliştirildi. Bu yöntemde hPSCs 10 günde sinir indüksiyonunun yüksek verim elde, MS5 besleyici hücrelerin yokluğunda içinde mono-tabaka olarak, yüksek yoğunlukta ekilir. Biz MS5-R-NC farklılaşma protokolü (Şekil 1A) uyarlanması, bu yöntemin düzenini takip etti. MEF'ler (Şekil 1 B) kolonileri kültürlenmiş HPSCs yüksek yoğunluklu (Şekil 1C) tek tabakalı bir kültür olarak tek hücre matrigel üzerine dağıtılmış ve tohumlanır. Farklılaşma 11. günde, hücreler çoğunluğu başarılı bir şekilde (pozitif Pax6, ^12, gösterilmemiş olan) neuralized var. Damlacıkları yüksek yoğunlukta hücreleri şarjı damlacık (Şekil 1B ve Şekil 2) içinde yoğunlaşmış sinir rozet oluşumu sağlar. NC hücreleri sinir rozetler (Şekil 1D <sınırları da ortaya/ Strong>) ve damlacık (Şekil 1E) dışarı göç. Ayrıca 7 günlük bir kültürden sonra, NC hücreler FACS sıralama ile izole edilebilir. HNK-1/p75 çift pozitif NK hücreleri,% 20-40 (Şekil 1F) en verimlilikle izole edilebilir. MS5-R-NC protokol alt çeşitli uygulamalar için R-NC hücre protokol daha faydalı bir hale getirir 35 güne kadar süre gerektirmektedir Bu protokol, 18 gün sürer.

Bu çalışmanın amacı, eski NC protokolü ile aynı hücre sağlar, daha kısa ve daha yeniden üretilebilir ve daha ucuz protokolünde NC hücreleri üretmektir. Başarıyla farklı hPSC hatları üzerinden protokol katı tekrarlanabilirlik gösteren, en az 10 HESC ve hiPSC hastalardan alınan çizgiler ve sağlıklı kontroller (veriler gösterilmemiştir) ayırt etmek için bu yeni protokolü kullanılır. Yeni protokol noggin, SHH'nin kullanımı ve daha az MS5 üretim maliyetleri eksikliği karşı LDN kullanımı nedeniyle maliyet tasarrufu sağlar. Yeni protokol 35 güne göre 18 gün süreryaklaşık 5 beslenmeleri ve böylece ilgili medya maliyetlerini kaydeder eski protokol, s. Iki protokol ile üretilen hücreleri de benzer kimliğe sahip olup olmadığını araştırmak için, biz de protokoller NC hücre gelişimi aynı farklılaşma deseni (Şekil 2) izler olduğunu göstermektedir. Hücreler bir nöral rozet aşamadan geçmesi ve FACS sıralama sonra aynı morfolojiye sahip NC hücreleri verim. Eski protokolüne kıyasla, yeni protokol nöral rozetler küçük boyutta 11. günde şarjı sonra yüksek hücre yoğunluğuna bağlıdır. Aksine, eski protokol rozet kondanse olarak değil hPSC koloniler, içinde oluşturur. Iki protokol ile elde NC hücreleri, HNK-1, AP2 ve Nestin da aynı biyolojik NC belirteçler, ifade eder. Biz küresel bir gen ekspresyon seviyesinde (Şekil 3A) üzerindeki iki protokol ile oluşturulan NC hücreleri analiz ve iki protokolleri ile oluşturulan NC hücreleri yakından birlikte küme bulundu. Cins vardı NC hücreleriWnt sinyal yolu (WNT-NC) aktivasyonu ile ted ve bu farklı NC nüfus olabileceğini göstermektedir, küresel gen ifadesi ile analiz edildiği zaman ayrı ayrı üreten melanosit ^16, kümenin potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Gerçekten de, R-NC ya da MS5-R-NC hücreleri (veriler gösterilmemiştir), in vitro olarak melanosit progenitör hücreler oluşturmak mümkün olmuştur. Benzer şekilde, nöroepitel hücreleri (LSB), LDN193189 ve SB431542 10 gün boyunca farklılaşmış sadece açıkça farklı gen ifade deseninin göstermektedir. Nöroepitelyal hücreleri, sinir sistemi, erken öncüleri olan ve bu nedenle NC hücreleri ile karşılaştırıldığında daha az farklılaşmış olan ve burada negatif bir kontrol popülasyonu olarak dahil edilmiştir. Burada elde edilen R-NC hücreleri eski protokolü ile yapılan hücrelerine benzer olup olmadığını değerlendirmek için, bir in vitro deneyi sıfırdan (Şekil 3B) içinde geçme kapasitesini göstermektedir. 48 saat sıralanmış R-NC hücrelerinin konfluent kuyu kaşınması, hücreler scra içine göçltak başarıyla. Son olarak, R-NC hücreler, otonom sinir sistemi hücrelerine ayırt etmek için bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Hücreleri kendiliğinden 4 gün sonrası HNK1 + / p75 + FACS için farklılaşmış ve Mash1 ve Tuj1, otonomik nöronların (Şekil 3C) olarak ifade edilen genlerin boyandı.

Şekil 1. R-NC farklılaşma protokolünde kritik adımlar. Bir. MS5-R-NC ^10,11 ve R-NC farklılaşma protokol düzeni. Iki protokol spesifik farklılaşması adımlar gösterilmektedir. MS5: besleyici stromal hücreler, KSR: KSR-farklılaşma orta, N2: N2-farklılaşma orta LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic kirpi, 8: FGF8'i, A: askorbik asit, B:. BDNF B. Farklılaşmamış hPSC kolonileri gösterir farklılaşma. C indüksiyonundan önce Ekim-4 ve DAPI ile boyandı. , Tipik olarak 1 gün hPSCs. D kaplama sonrası farklılaşma 0. günde hücre yoğunluğu (% 90-100) gösterir. Pax6 ve damlacık. E içerisinde HNK-1 ile ortaya çıkan NC boyanmış hücreler ile boyanmış sinir rozet gösterir. Günü damlacıklar ve damlacığın. F kenarından çıkan NC hücrelerde 11. günde de tekrar kaplandı 13 hücreleri gösterir. Temsilcisi FACS farklılaşma gün 18 HNK-1/p75 çift pozitif NC hücreleri gösteren, arsa sıralama. Kapıları ve lekesiz bir lekeli kontrol, (gösterilmemiş olan) göre seçilmiştir. Araziler sıralama FACS deneyleri, hPSC hatları ve çift pozitif ve tek pozitif hücrelerin yüzdesi bakımından eski veya yeni protokolün kullanımı arasında farklılık olabilir. Bu nedenle, uygun NC hücreler ekstre sağlamak için çift pozitif popülasyonu izole etmek önemlidir. F Görüntüler C yeni R-NC protokolü kullanılarak üretildi.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,. MS5-R-NC ya da R-NC protokolü ile elde edilen hücrelerin karşılaştırılabilir nöral tepe hücre kimliği. Her iki protokolde de hücreler, nöral rozet aşamasına geçer. Kriteri NC hücreleri morfolojisi ve böyle HNK-1 ve AP2'nin gibi NC belirteçler ifade ile aynı görünüyor. NC hücreleri progenitör hücreler olduğunu gösteren, Nestin-pozitiftir. Ölçek çubuğu: 200 mikron. Tüm floresan resimler DAPI'nin için karşıt edilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Eski ve yeni protokol ile oluşturulan Şekil 3.. NC hücreleri de benzer bir kimlik. A var. MS5-R-NC ve R-NC protokolü ile elde edilen NC hücreleri karşılaştırarak Illumina mikroarray gen ekspresyon verileri denetimsiz kümeleme. MS5-R-NC ya da günde 35 ya da 18. günde sırasıyla R-NC protokolü ile elde edilen hücreler, bir NC Illumina insan 12 oligonükleotid diziye hibridizasyonu ile üç kopya olarak analiz edilmiştir. Veri analizi Partek Genomik Suite yazılımı kullanılarak yapılmıştır. Anlamlı farklar 0.05 'den az bir katlama 2 daha büyük bir değişim ve FDR sahip olarak tanımlandı. 1421 genleri analiz edilmiştir. Böyle dendrograma uzunluğu Öklid örnek benzemezlik, ortalama bağlantı küme yöntemi ve 25 olarak varsayılan ayarları, kullanılmıştır. Wnt sinyal (wnt-NC) aktive tarafından uyarılan NC hücreleri (hücreler differe vardı dahil edildiLDN193189 günde 0-3, SB431542 günde 0-4 ntiated, CHIR99021 gün 0-11 ve FACS) sox10 için 11. günde ¹⁶ sınıflandırılmaktadır. Bu hücreler, WNT-NC hücreleri ve R-NC hücreleri ayrı nüfus belirten, R-NC hücrelerinden ayrı küme. LDN193189 ve SB431542 11 gün boyunca farklılaşmış hücreler bir nöro kontrol (LSB) olarak dahil edilmiştir. R-NC ve MS5-R-NC hücreleri kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında yakından birlikte küme. Ham gen ekspresyon verileri GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) katılım # mevcuttur:. GSE50643 B. Göç deneyi. HNK1 + / p75 + FACS R-NC hücreleri 96 kuyuda PO / Lam / FN kaplama ve 24 saat sonra elle çizik sınıflandırılmaktadır. 0 saat resminiz hemen Hoechst ile çizilmeye ve sonrası boyama sonra çekilmiştir. Geri kalan kuyular ikinci resim alınmıştır önce 48 saat boyunca göç bırakılmıştır. Ölçek çubuğu: 200 mikron C. Kriteri: R-NC hücreleri kendiliğinden 4 gün boyunca ayırt etmek için izin verilmiştir ve Ma lekeliSH1, Tuj1 ve DAPI. Ölçek çubuğu:. 500 mikron , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Discussion

HESC / hiPSCs R-NC hücrelerinin başarılı farklılaşması için aşağıdaki noktalar göz önüne alınmalıdır. Bu her zaman steril kültür koşulları altında çalışmak için çok önemlidir. Özellikle, bu kirlenme başarılı engel farklılaşmasını çünkü, düzenli mikoplazma kontaminasyonu için hPSC kültürleri test etmek önemlidir, ancak kolayca hPSC kültürde görsel olarak tespit edilemez. R-NC farklılaşması% 90-100 hücre yoğunluğunda başlanmalıdır; düşük hücre yoğunluğu, hücre hayatta kalması ve R-NC farklılaşma etkinliğini etkiler. Bu deneysel olarak etkili NC farklılaşmasını desteklemek için, özellikle KSR de, en uygun konsantrasyonları ile reaktiflerin bazı çok sayıda doğrulamak için çok önemlidir. Hücreler damlacıkları içinde 11. günde tekrar kaplandı zaman, 10 ul damlacık içindeki hücre yoğunluğu yüksek olmalıdır ve en iyi şekilde ampirik olarak belirlenir. Uygun gül ve NC-oluşumu damlacık içindeki uygun hücre yoğunluğuna bağlıdır. Biz obser deneysel olarakhücreler Accutase ile muamele edildikten sonra, en az iki kez yıkanır zaman ved hücre yaşamını artmıştır. FACS ile R-NC hücrelerinin başarılı bir şekilde izole edilmesi için bu tür lekeli boyanmamış, bir antikor ve ikincil antikor, sadece lekeli hücreler olarak uygun deneysel kontrol, çok önemlidir. Ölü hücreler DAPI, 7-AAD veya Propidium Iodide boyama tarafından dışlanmış olabilir. Bundan başka, antikor seyreltileri deneysel olarak her özel antikor parti için belirlenmelidir. Tek boyama gibi p75-pozitif MSS hücreleri gibi istenmeyen hücre tipleri, erken mezoderm veya plakod ile NC nüfusun kirlenmesine yol açabilir, çünkü HNK-1 ve p75 ile çift boyama ile R-NC hücreleri arındırmak FACS önemlidir. Tek lekeli nüfus karşı çifte bizim deneyim yüzdelerinde hPSC hatları ve farklılaşma deneyler arasında değişebilir. R-NC hücre hayatta kalma sonrası FACS tavsiye yerine, hücreleri yeniden askıya tüpün getirerek, hücre sert pipetleme kaçınarak artırılabilir. Ayrıca, R-NC FACS kaplamaşartlandırılmış ortam (hücreler FACS önce arttı, filtre ortamı) içinde izole edilmiş hücrelerin hayatta kalmasını geliştirmek için ¹¹ gösterilmiştir. Bu verimli nötralizasyon ve rozet oluşumunu sağlamak için günde 11 ve 14. günde sinir epitel işaretleyici Pax6 ile boyanmış olabilir paralel bir küçük ölçekli farklılaşma yürütmek için tavsiye edilir. Böyle uygun NC farklılaşma için rozet aşamada HNK-1 ya da AP2'nin gibi NC belirteçleri de değerlendirilmelidir. Ayrıca, izole edilmiş R-NC hücreleri gibi AP2'nin, HNK-1 ve Nestin (Şekil 2) gibi NC belirteçleri, morfolojisi ve boyanması ile valide edilmelidir.

HPSC ikinci MS5-R-NC hücrelerinin türetilmesi Lee et al. ¹⁰ tarafından 2007 'de tarif edilmiştir. Bu ön-madde nüfus NC soyunun türevleri içine yayılır ve ayrıca, in vitro olarak ayırt edilebilir olduğu gösterilmiştir. MS5-R-NC hücreleri kendiliğinden nöral küre yöntem ^10,17 kullanılarak ayırt edilebilirya da in vitro farklılaşmasında ilgilidir. Bu MS5-R-NC hücreler, periferal sinir sisteminin (otonomik ve duyumsal nöronlar), periferal glia (Schwann hücreleri), miyofibroblastlar, mezenkimal kök hücreleri ve bunların soyu ve düz kas hücreleri ¹⁰ sebebiyet verebilir kurulmuştur. Civciv ve farelere transplantasyonu MS5-R-NC hücreleri göç eder ve in vivo ^10'da ayırt gösterdi. MS5-R-NC Hücreler, insan hastalıklarının modelleme implike edilmiştir. Genetik hastalığı Ailevi Disautonomia (FD) ve karakteristik bir fenotip hasta belli hiPSC türetilen MS5-R-NC hücreler ² kullanılarak in vitro modellenmiştir. Bu tür işlevsel NC hücre gelişimi ve göç gibi NC karakteristik fenotipleri, FD hastalardan alınan hücrelerde değil, sağlıklı kontrol hücrelerinde gösterilmiştir. MS5-R-NC hücreleri de insan embriyonik sinir ucu boyunca göç etkileyen bileşiklerin toksikolojik test kurmak için kullanılmıştırgeliştirme, olumsuz nöro ⁵ etkileyebilecek gelecekteki uyuşturucu salınımını önlemek için potansiyele sahip. HPSC teknoloji heyecan verici bir uygulama, yüksek verimli tarama ve insan hastalıkları için farmasötik tedavi seçenekleri testtir. MS5-R-NC hücreleri iPSC tabanlı bir hastalık modeli, örneğin, Ailevi Disotonomi ^4'te bu tür ilk ekranı gerçekleştirmek için kullanıldı. Bu ekran başka klinik deneylerde değerlendirilebilmektedir Yeni bileşiklerin tanımlanmasına yol açtı.

HPSC alanın tüm uygulamalar için, in vitro farklılaşma protokollerde, doğru, çoğaltılabilir, tanımlanmış ve özel mevcut olması önemlidir. Bu raporda, biz hPSCs R-NC hücrelerin derivasyon için kurulmuş bir in vitro farklılaşma protokol adaptasyon gösteriyor. Bildirilen protokol olarak önceden daha tanımlı kültür koşullarında ¹⁰ rapor aynı hücreleri ve Shorte verirr zaman çerçevesi. Bu protokol, insan hastalıkları bileşik taraması, toksikoloji testleri ve NC soyundan türetilen hücre tiplerine yönelik farklılaşma protokollerin daha da geliştirilmesi için, NC soy hücreleri etkilemek için R-NC hücreleri üretmek için kullanılabilecektir.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek hiçbir çatışan çıkarları var.

Acknowledgments

Ve Tri-kurumsal kök hücre girişimi (Starr Vakfı); Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı ve NYSTEM (C026447 C026446) hibe yoluyla ileri araştırmacılar için bir burs ile desteklenmiştir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008

References

1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
3. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
4. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
6. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
7. McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
8. Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
9. Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
10. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
11. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
13. Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
14. Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
15. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
17. Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).

Tags

Nörobilim Sayı 87 Embriyonik Kök Hücreler (ESC) pluripotent kök hücreleri uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) Sinir Crest Periferik Sinir Sistemi (PNS) pluripotent kök hücreler nöral krest hücreleri, hastalık modelleme farklılaşma protokol insan embriyonik kök hücreleri insan pluripotent kök hücreleri