Summary
Neural crest (NC) celler avledet fra humane pluripotente stamceller (hPSC) har stort potensial for modellering menneskelig utvikling og sykdom og for celle erstatning terapi. Her, en mater-fri tilpasning av de for tiden brukteAbstract
Menneske pluripotente stamceller (hPSCs) har stort potensial for å studere menneskelig embryoutvikling, for å modellere menneskelige sykdommer i fatet og som en kilde til transplant celler av regenerativ applikasjoner etter sykdom eller ulykker. Neural crest (NC)-celler, er forløperne for et stort utvalg av voksne somatiske celler, slik som celler fra det perifere nervesystemet og gliaceller, melanocytter og mesenkymale celler. De er en verdifull kilde til celler for å studere aspekter av menneskelig embryoutvikling, inkludert celle skjebne spesifikasjon og migrasjon. Ytterligere differensiering av NC stamceller til terminalt differensiert celletyper gir muligheten til å modellere menneskelige sykdommer in vitro, undersøke sykdomsmekanismer og generere celler for regenerativ medisin. Denne artikkelen presenterer den tilpasning av en for tiden tilgjengelig i vitro differensiering protokoll for avledning av NC celler fra hPSCs. Denne nye protokollen krever 18 dager med forskjellerrentiation, er mater fritt, lett skalerbar og svært reproduserbare blant humane embryonale stamceller (hESC) linjer samt menneskeskapte pluripotent stamcelle (hiPSC) linjer. Både gamle og nye protokoller gi NC celler med lik identitet.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESC) og menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSC) har vist enormt potensial, særlig for etterforskningen og fremtidig behandling av menneskelige sykdommer som verken gode dyremodeller eller primære vev er tilgjengelige. Eksempler på bruksområder for hESC / hiPSC teknologi er følgende: Celler av spesiell interesse kan genereres fra hESC / hiPSCs for regenerativ medisin ved ubegrenset kvantitet en. Celler kan bli produsert fra pasienter bærende en spesifikk sykdom, og brukt til å etablere in vitro-sykdomsmodeller 2,3. Slike sykdomsmodeller kan da bli ansatt for storskala narkotika screening i jakten på nye stoffet forbindelser 4 samt testing av eksisterende legemidler for effekt og giftighet fem. In vitro sykdom modeller kan føre til identifisering av nye sykdomsmekanismer. For alle anvendelser av hESC / iPSC teknologi er det viktig å jobbe med spesifikke, godt definered celletyper som påvirkes i sykdommen av interesse. Således er tilgjengeligheten av faste og reproduserbare in vitro differensiering protokoller avgjørende for alle anvendelser av hESC / hiPSC teknologi. Protokoller er ønskelig som viser minimal variasjon, tidskostnad, krefter, problemer og kostnader samt maksimal reproduserbarhet blant hESC / hiPSC linjer og ulike forskere.
Neural crest (NC) celler dukke opp i løpet av virveldyr neurulation mellom epidermis og nevrale epitel. De sprer og migrere mye rundt utvikling av embryo og gi opphav til et imponerende mangfold av avkom celletyper, inkludert bein / brusk, den kraniofaciale skjelett, sensoriske nerver, Schwann celler, melanocytter, glatte muskelceller, enteriske nerveceller, autonome nevroner, kromaffinceller , hjerte septum celler, tenner og binyrer / skjoldbruskkjertelceller seks. Således, NC-celler er en attraktiv celletype for stamcellefeltet og viktig formodellering av en rekke sykdommer, for eksempel Hirschsprungs sykdom 7, Familial Dysautonomia 8 samt kreftformer som neuroblastom 9.. Videre tilbyr de muligheten til å studere aspekter ved humane embryonale utvikling in vitro.
Den tiden tilgjengelig og mye brukt in vitro differensiering protokoll for avledning av NC celler fra hESCs 10,11 krever opp til 35 dager av differensiering og det innebærer neural induksjon på stromal mater celler som MS5 celler og er dermed utført under uklare forhold. Selv om det kan være opp-skalert for å generere store mengder av NC-celler, for eksempel som kreves for high-throughput screening medikament 4, er denne arbeids-og kostnadskrevende. Videre innebærer det manuell aging av nevrale rosetter, som kan være vanskelig å reprodusere og dermed er underlagt generelle variasjonen, særlig når den brukes til et stort utvalg av hESC eller hiPSClinjer. Her blir trinnvis avledning av NC-celler i en 18-dagers protokoll som er fri for mateceller vist. Denne metoden er kortere og mer definert enn i dag brukes protokollen. Videre er det svært robust i å generere NC celler mellom ulike hiPSC linjer. Viktigere er det vist at NC cellene overgitt av begge protokollene dukke opp på grensen av nevrale rosetter (heretter kalt rosett-NC eller R-NC). Cellene avledet ved hjelp av en av de to protokollene ser morfologisk identiske, de uttrykker de samme NC markører og klynge sammen i mikromatriseanalyse. NC-celler avledet ved hjelp av den nye protokoll (R-NC) er funksjonelle, i likhet med NC-celler avledet ved hjelp av den gamle protokoll (MS5-R-NC), slik at de kan migrere og videre differensiere til neuroner. Derfor kan cellene bli brukt samtidig med MS5-R-NC-celler. Den R-NC celle protokollen for avledning av NC celler fra hESC / iPSC vil være nyttig for alle anvendelser av hESC / iPSC teknologi som involverer NC avstamning. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Kultur Media, Belagt Retter og vedlikehold av hPSCs
1,1 Media forberedelse
Merk: Filter alle medier for sterilisering og oppbevar ved 4 ° C i mørke i opptil to uker. Reagensnavn, selskaps-og katalognummer er oppført i Materials tabell.
- DMEM/10% FBS: Kombiner 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep og 5 ml L-Glutamin.
- HMS-medium: Kombiner 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamin, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essensielle aminosyrer løsning, 1 ml β-mercaptoethanol. Tilsett 10 ng / ml FGF-2 etter filtrering av mediet.
FORSIKTIG: β-Mercaptoethanol er giftig, unngå innånding, svelging og hudkontakt. - KSR-differensiering medium: Kombiner 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-Glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essensielle aminosyrer løsning og en ml β-mercaptoethanol.
- N2-differentiatipå middels: Løs opp 12 g DMEM/F12 pulver i 980 ml dH 2 O, tilsett 1,55 g glukose, 2 g natriumbikarbonat og 100 mg APO human transferrin. Bland 2 ml dH 2 O til 25 mg humant insulin og 40 pl 1 N NaOH, tilsett oppløst løsningen til mediet. Tilsett 100 mL putrescine dihydrokloridet, 60 mL selenitt, 100 mL progesteron og bringe volumet opp til en L med dH 2 O.
1.2 Overflatebehandling av kultur retter
- Matrigel belegg: Thaw 1 ml frosset matrigel delmengde ved å pipettere 19 ml DMEM/F12 over delmengde til den er oppløst. Fjern klumper ved å føre det gjennom en 40 mikrometer celle sil og plate 8 ml/10 cm parabolen. Inkuber retter i 1 time ved RT. Aspirer matrigel umiddelbart før plettering i cellene.
Merk: Arbeid raskt med matrigel fordi det kan klumpe seg ved temperaturer over 4 ° C. - PO / Lam / FN belegg: Tilsett 10 ml 1x PBS som inneholder 15 mikrogram / ml Poly-L Ornithin hydrobromid til en 10 cm tallerken. Inkuber fatet over natten ved 37 ° C. Vask platene med 1x PBS gang og legge 10 ml/10 cm fat med 1x PBS som inneholder 2 mg / ml mus Laminin-I og 2 mg / ml fibronek. Inkuber retter over natten ved 37 ° C. Før plating av cellene, fjerne løsningen og la platene tørke grundig ved RT i 15-20 min ved å stå dem opp på vevskultur-hetten veggen uten på lokket.
Merk: Rettene er helt tørr og klar for celle plating når man kan se krystallstrukturer på overflaten (synlig ved øyet). Platene kan oppbevares ved romtemperatur i noen timer i dette tørket tilstand. PO / Lam / FN retter må være forberedt på to dager før tiden. I nødstilfeller Lam / FN kan inkuberes i 2-4 timer bare. Dette kan imidlertid risikere suboptimale differensiering / overlevelse resultater.
1.3 Vedlikehold av hPSCs
Merk: hPSCs opprettholdes på 0,1% gelatin og mitotisk inaktivert mus embryonale fibroblaster (MEFs) i HES-medium supplert med 10 ng / ml FGF-2 som beskrevet tidligere 10,12. Cellene skal deles hver 6-8 dager.
- Coat en 10 cm skål med 8 ml 0,1% gelatin (i 1 x PBS uten magnesium eller kalsium) ved RT i 5 min.
- Tine frosne MEFs raskt i en 37 ° C vannbad. Legge til 1 million MEFs til 10 ml DMEM/10% FBS.
- Aspirer gelatin og plate cellene. Inkuber ved 37 ° C i minst 6 timer.
- Aspirer DMEM/10% FBS fra forberedt MEF plate, vaske plate med 1x PBS gang og legge til 10 ml HMS-medium supplert med 10 mikrometer Y-27632 dihydrokloridet. Tillat medium varmes opp ved 37 ° C i 20 min.
Merk: For manuell splitting av hPSCs en laminær hette med en innebygd mikroskop brukes. Imidlertid kan cellene bli passaged ved hjelp av egnede alternative metoder. - Under en laminær hette med en innebygd mikroskop, løsne separate kolonier ved hjelp av en celle løfteren og la dem flyte.
- Bruk en1 ml sprøyte til å suge de flytende kolonier og sende dem på fersk, varm MEF plate. Overfør omtrent en fjerdedel av cellene til den nye form. Inkuber ved 37 ° C.
- Strøm celler daglig med ferske HMS-medium.
2. Plating av hPSCs for Differensiering
Merk: hPSCs bør deles eller belagt for differensiering når koloniene er store, men fortsatt ha skarpe kanter med så lite som mulig differensierende celler ved sine grenser (se Figur 1B). Når cellene blir opprettholdt ved hjelp av manuell aging kolonier bør være stor nok til å bli sett av øyet. For å få den rette følelsen for dette tidspunkt kan man opprettholde en egen hPSC parabolen for to uker uten passering og se på cellene nå og passere ideelt tidspunkt for aging / skille dem.
- Forbered 10 cm retter med matrigel en time før du starter differensiering. Vellykket matrigel belegg kan væreverifisert ved 4x forstørrelse.
- Når hPSCs er klar til å deles, aspirer medium og tilsett 4 ml av 0,05% trypsin-EDTA til cellene.
- Rist fatet horisontalt for 2 min kraftig til man kan se MEFs som enkeltceller løfte av platen under mikroskopet. De hPSC koloniene forblir vedlagt som kolonier.
- Umiddelbart og grundig, aspirer trypsin og la platen stå ved RT i 2-4 min.
- Tilsett 2 ml av HES-medium til platen og ved hjelp av en pipette P1000, løsne cellene.
Merk: Dersom cellene ikke kan løftes fra overflaten lett kan platen inkuberes tomt ved RT i ytterligere 2-3 min. - Overfør cellene til 8 ml HMS-medium supplert med 10 mikrometer Y-27632 dihydrokloridet.
- Aspirer matrigel fra en tidligere utarbeidet 10 cm fatet. Plate cellene på en 1:01 eller 1:02 ratio (for eksempel: Cellene fra en 10 cm parabol er delt inn i to 10 cm retter) på matrigel plate. Inkuber ved 37 °C over natten.
Merk: Denne plating bør resultere i ca 100 000 celler / cm 2.
Tre. Induksjon av Neural Differensiering
Merk: differensiering kan initieres (dag 0) når cellene er 90-100% sammenflytende (se figur 1C), vanligvis den følgende dag. Dersom den nøyaktige konfluens ikke oppnås ennå kan cellene bli matet hver dag med HES-medium inntil de er klare for differensiering. Alternativt kan den innledende antall celler belagt økes.
- På dag 0-3, mate cellene daglig med 10 ml/10 cm parabolen KSR-differensiering medium som inneholder 0,1 mikrometer LDN193189 og 10 mikrometer SB431542.
- På dag fire og fem fôr cellene med 75% KSR-differensiering medium og 25% N2-differensiering medium både inneholder LDN193189 og SB431542.
- På dag 6 og 7 fôr cellene med 50% KSR-differensiering medium og 50% N2-differensiering medium både inneholder LDN193189 og SB431542.
- På dag 8 og 9 fôr cellene med 25% KSR-differensiering medium og 75% N2-differensiering medium både inneholder LDN193189 og SB431542.
- På dag 9 og 10 forberede PO / Lam / FN retter som angitt i 1.2.2 for replating av cellene på dag 11.
- På dag 10 fôr celler med N2-differensiering medium som inneholder LDN193189 og SB431542.
4. Replating i Dråper for NC Spesifikasjon
- På dag 11 aspirer Lam / FN fra de tidligere utarbeidet platene og la dem tørke helt ved RT i 20-30 min, som forklart i 1.2.2.
- Fjern medium fra de unike celler, vaske cellene gang med 1x PBS og tilsett 8 ml accutase/10 cm parabolen. Inkuber i 20 min ved 37 ° C.
- Ved hjelp av en celle løfter, løsner cellene og resuspender dem i accutase med en 5 ml pipette. Overfør suspensjonen til et 15 ml rør.
- Tilsett 5 ml 1x PBS og spinne celler for 5 min ved 114 x g.
- Suspender cellene i 10 ml 1x PBS. For å sikre en enkel cellesuspensjon, å filtrere dem gjennom et 40 mikrometer celle sil og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer eller tilsvarende teknikk.
- Spinn cellene ned og resuspender dem i N2-differensieringsmedium inneholdende 200 mM askorbinsyre (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632 dihydroklorid ved at konsentrasjonen av 100000 -150000 cells/10 mL.
- Ved hjelp av en repeat-pipette, plate 10 mL dråper nær hverandre uten at de berører på tørket PO / Lam / FN 15 cm retter.
Merk: En 10 cm rett av differensierte celler vanligvis resulterer i ca 2-3 ganger 15 cm retter eller ca 100 x 10 mL droplets/15 cm parabolen. - La dråpene stå ved RT i 20-30 min, og deretter meget forsiktig (for ikke å forstyrre de dråper) tilsett 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y og inkuber ved 37 ° C.
- På dag 12, nøye mate cellene med 20 ml/15 cm fatet N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
- Fra day 14-17 mate cellene hver andre eller tredje dag med N2/AA/BDNF/FGF8.
- På dag 16 og 17 forberede po / Lam / FN platene til replate NC celler etter FACS sortering.
5. Fluorescens Aktivert Cell Sorting (FACS) av NC celler
Merk: Utarbeidelse av celler for FACS krever omtrent to timer.
- På dag 18 remove medium, vaske cellene gang med 1x PBS i fatet og legg 12 ml accutase. Inkuber cellene i 20 min ved 37 ° C.
- Ved hjelp av en celle lifter, løsne cellene fra overflaten og la dem flyte. Pipetter cellene i suspensjonen med en 5 ml pipette, overføre dem til en 50 ml tube og tilsett 30 ml 1x PBS. Spinn cellene for 5 min ved 114 x g.
- Ved hjelp av en pipette P1000, resuspender cellene i 1 ml av 2% FBS / HBSS (i HBSS inneholder 15 mM HEPES). Til 19 ml 2% FBS / HBSS og filtrere cellene gjennom et 40 pm celle sil for å sikre en enkel cellesuspensjon. Inkuber cellene på isen for 15 mi for antistoff blokkering og deretter telle dem ved hjelp av en hemocytometer.
- Spinn celler ned og resuspender dem på konsentrasjonen av 10 millioner celler / ml i 2% FBS / HBSS.
- Sett til side 1 million celler hver for unstained, single-farget (HNK-en bare og p75 bare) og sekundært antistoff farget bare (APC bare og 488 only) FACS styrer.
- Tilsett 5 ul av HNK-en, og 5 pl av p75 primære antistoff per 10 millioner celler i 1 ml suspensjon til riktig prøvene og inkuberes i 20 min på is.
- Vask cellene i 10 ml 1 x PBS (sentrifuge 5 min ved 114 x g), og resuspender cellene i 1 ml 2% FBS / HBSS. Tilsett 2 mL av APC og 1 pl av 488 sekundært antistoff per 10 millioner celler i 1 ml suspensjon til riktig prøvene og inkuberes i 20 min på is i mørket.
Merk: APC og 488 er de sekundære antistoffer som brukes her for HNK-en og p75 farging, henholdsvis. - Vask cellene i 10 ml 1 x PBS to ganger, resuspender 10 millioner celler i 500 ul2% FBS / HBSS innehold DAPI (0.5 ng / mL), eller alternativt passende levende celle beis for å ekskludere døde celler fra FACS-analyse.
- Overfør prøvene til passende FACS rør.
- Forbered FACS rør med 0,5 ml 2% FBS / HBSS for celle samling.
Merk: De celler og prøverør er holdt på is i mørket i løpet av sortering av tiden. - Ved hjelp av en celle sortering maskin med lasere som kan oppdage DAPI, APC og 488 sorter DAPI-/HNK-1 + / P75 + doble positive celler.
Merk: Forberedelse tid og håndtering av cellene fører til en liten prosentandel av celledød, tillater bare og dermed DAPI flekker døde celler for disse cellene for å bli ekskludert fra den sorterte befolkningen. Noe alternativ levende / død flekken fungerer like godt til dette formålet. DAPI seg selv ikke forårsaker cytotoksisitet i live cellepopulasjon.
6. Replating av Sorterte Cells, NC vedlikehold og utvidelse
Merk: FACS sortert celler bør håndledet med spesiell omsorg for å sikre optimal overlevelse. Hold dem på is inntil replating dem. Ikke vortex eller pipetter dem hardt. Cellene kan slemmet opp igjen ved å dra røret.
- Etter FACS sortering, telle NC celler, deretter spinne dem ned og resuspender i N2-differensiering medium supplert med 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF og 10 mikrometer Y-27632 dihvdroklorid i volumet hensiktsmessig å replate dem på 30 000 celler / 10 mL dråper.
- Grundig tørt tidligere utarbeidet po / Lam / FN plater og plate ca 50-70 dråper per 10 cm parabolen. La de retter stå ved RT i 20-30 min.
- Veldig nøye legge 20 ml/10 cm rett av N2/FGF2/EGF/Y-27632 uten å forstyrre dråpene. Inkuber cellene ved 37 ° C.
- Strøm cellene hver 2-3 dager med N2/FGF2/EGF.
Merk: NC celler er utvidet eller passaged ca hver 4-5 dager, eller når de begynner å hope seg opp i løpet av dråpene. - Til passasje NC cellene, fjerner mediet, wash cellene gang med 1x PBS og tilsett 8 ml accutase/10 cm parabolen. Inkuber i 20 min ved 37 ° C.
- Pipetter cellene av platen ved hjelp av en 5 ml pipette og overføre dem til et 15 ml rør. Legg 6 ml 1x PBS.
- Spinn cellene for 5 min ved 114 x g.
- Resuspender cellene i N2-differensiering medium supplert med 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF og 10 uM Y-27632-dihydroklorid for å få 20000 cells/10 ul dråpe.
- Replate cellene i 10 pl droplets på tørkede PO / Lam / FN-platene. La de retter stå ved RT i 20-30 min.
- Legge nøye 20 ml/10 cm rett av N2/FGF2/EGF/Y-27632. Inkuber ved 37 ° C.
Merk: NC-celler kan opprettholdes eller utvides i opptil 2 uker som en forholdsvis homogen progenitor populasjon. Lengre kultur kan føre dem til å differensiere i ulike avkom celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De to viktigste forbedringene i R-NC-protokollen over MS5-R-NC protokoll 11 er de mater-fri, definert differensierings forhold og den generelle avkorting av tidskravet. MS5 mater celler 13 er murine benmarg avledet stromale celler som har blitt vist å støtte nevrale differensiering fra hESCs 14. HESCs dyrket på MS5 mater celler ved lav tetthet skjema epitel-strukturer og nevrale rosetter 15, ved periferien av hvilke NC celler dukke 10, og dermed etterligne tidlig human neural utvikling. Det er imidlertid ikke klart hva som signalmolekyler og vekstfaktorer blir frigitt fra MS5 mater celler. Derfor er differensierings betingelser dårlig definert, noe som gjør det vanskelig å reprodusere dem i stadig tilbakevendende eksperimenter og på tvers hPSC linjer. For tilstrekkelig neural induksjon, hESCs må utsådd ved lav tetthet i små kolonier på MS5 mater celler, komplikasjonerting opp-skalering og nådde høy avkastning av differensierte celler. I 2009 ble det utviklet en metode som tar sikte på neuralizing hPSCs svært effektivt 12. I denne metoden hPSCs sås med høy tetthet, i monolag i fravær av MS5 mater celler, å oppnå høye utbytter av neural induksjon i 10 dager. Vi fulgte ordningen av denne metoden i å tilpasse MS5-R-NC differensiering protokollen (figur 1A). HPSCs dyrket i kolonier på MEFs (Figur 1B) er spredt og sådd på matrigel som enkeltceller i en monolayer kultur med høy tetthet (figur 1C). På dag 11 av differensiering, har de fleste av cellene med hell nøytralisert (Pax6-positive, ikke vist 12). Replating cellene til høy tetthet i dråper tillater dannelsen av kondenserte nevrale rosetter i dråpen (fig. 1D og figur 2). NC celler dukke opp ved grensen til nevrale rosetter (Figur 1D </ Strong>) og migrere ut av dråpen (figur 1E). Etter 7 dager med ytterligere kultur NC-celler kan bli isolert ved FACS-sortering. HNK-1/p75 doble positive NC-celler kan bli isolert ved virkningsgrad på 20-40% (fig. 1F). Denne protokoll krever 18 dager, mens den MS5-R-NC-protokollen krever opp til 35 dager, slik at R-NC celleprotokoll mer nyttig for en rekke nedstrøms applikasjoner.
Hensikten med dette arbeidet er å generere NC-celler i en kortere og mer reproduserbar og billigere protokoll, hvilket gav de samme cellene som den gamle NC-protokollen. Vi har brukt denne nye protokollen til å lykkes skille minst 10 hESC og hiPSC linjer stammer fra pasienter og friske kontroller (data ikke er vist), som viser solid reproduserbarhet av protokollen på tvers av forskjellige hPSC linjer. Den nye protokollen sparer kostnader på grunn av bruk av LDN mot noggin, mindre bruk av ssh og mangel på MS5 produksjonskostnader. Den nye protokollen varer i 18 dager i forhold til 35 dagerss i den gamle protokollen, noe som sparer ca 5 feedings og dermed tilhørende mediekostnader. For å undersøke hvorvidt celler fremstilt med de to protokollene har lignende identitet, viser vi at NC celleutvikling i begge protokoller følger samme differensieringsmønster (figur 2). Cellene passere gjennom en neural rosett scenen og gi NC celler med identisk morfologi etter FACS sortering. Jo mindre størrelsen av de neurale rosetter i den nye protokoll i forhold til den gamle protokoll skyldes den høye celletetthet etter replating ved dag 11.. I kontrast i de gamle protokoll rosetter danner innenfor hPSC kolonier, som ikke er så kondenseres. NC-celler avledet med de to protokollene uttrykker de samme biologiske NC-markører, slik som HNK-1, AP2 og nestin. Vi analyserte NC-celler dannet med de to protokoller på et globalt genekspresjon nivå (figur 3A) og fant at NC-celler generert med de to protokollene klynge tett sammen. NC celler som var slekterted ved aktivering av Wnt signalveien (Wnt-NC) og ble vist å ha potensial til å generere melanocytter 16, klynge separat når analysert av global genekspresjon, noe som indikerer at dette kan være en annen NC befolkning. Faktisk har vi vært i stand til å generere melanocyte stamceller in vitro fra R-NC eller MS5-R-NC celler (data ikke vist). Tilsvarende neuroepithelial celler (LSB), differensiert for 10 dager i LDN193189 og SB431542 bare vise et klart atskilt genuttrykk mønster. Neuroepithelial celler er tidlige stamceller i nervesystemet, og dermed er mindre differensiert forhold til NC-celler, og er tatt med her som en negativ kontroll populasjon. For å vurdere om R-NC-celler som genereres her er lik de celler fremstilt med den gamle protokoll, viser vi deres spredningsevne i en in vitro assay bunnen (figur 3B). 48 timer etter å skrape en konfluent godt av sorterte R-NC celler, celler vandrer inn i scratch hell. Til slutt viser vi at R-NC celler har potensial til å differensiere i celler fra det autonome nervesystemet. Cellene ble spontant differensiert for fire dager etter HNK1 + / p75 + FACS og farget for Mash1 og Tuj1, gener som er uttrykt i autonome nevroner (Figur 3C).
Figur 1. Kritiske trinn i R-NC differensiering protokollen. A. MS5-R-NC 10,11 og R-NC differensiering protokollen ordningen. De spesifikke differensierings trinnene i de to protokollene er vist. MS5: mater stromale celler, KSR: KSR-differensiering medium, N2: N2-differensiering medium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic hedgehog, 8: FGF8, A: askorbinsyre, B:. BDNF B. Viser udifferensierte hPSC kolonier beiset med oktober-4 og DAPI før induksjon av differensiering. C. Viser celletettheten (90-100% konfluens) på dag 0 av differensiering, vanligvis en dag etter plating hPSCs. D. Viser nevrale rosetter farget med Pax6 og nye NC celler farget med HNK-en inne i dråpene. E. Viser dag 13 celler, replated på dag 11 i dråper og NC celler dukker opp fra kanten av dråpene. F. Representative FACS sortering tomten, som viser HNK-1/p75 doble positive NC celler på dag 18 av differensiering. Portene ble valgt basert på de ufargede og enkelt farget kontroller (ikke vist). FACS sortering tomter kan variere mellom eksperimenter, hPSC linjer og bruk av den gamle eller nye protokollen i forhold til andelen av doble positive og enkeltstående positive celler. Således er det viktig å isolere det dobbelte positive populasjon for å sikre at de riktige NC cellene er ekstrahert. Bilder C til F ble generert ved hjelp av den nye R-NC-protokollen.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sammenlignbar neural crest celleidentiteten av celler avledet med MS5-R-NC-eller R-NC-protokollen. På begge protokollene cellene passerer gjennom en neural rosett stadium. Sortert NC cellene ser identisk med morfologi og etter uttrykk for NC markører som HNK-en og AP2. NC-celler er nestin-positive, som viser at de er stamceller. Målestokk: 200 mikrometer. Alle fluorescens bildene er kontra for DAPI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. NC celler genereres med den gamle og den nye protokollen har lignende identitet. A. Unsupervised clustering av Illumina microarray genuttrykk data som sammenligner NC celler avledet med MS5-R-NC og R-NC-protokollen. NC-celler avledet med MS5-R-NC-eller R-NC-protokollen ved dag 35 eller dag 18 henholdsvis ble analysert i triplicates ved hybridisering til en Illumina human 12. Oligonukleotid array. Dataanalyse ble utført ved hjelp av Partek Genomisk Suite-programvaren. Signifikante forskjeller ble definert som de som har en fold endring som er større enn 2 og FDR mindre enn 0,05. 1421 gener ble analysert. Standardinnstillinger, for eksempel Euklidsk sample ulikhet, gjennomsnittlig kobling klynge metode og 25 for dendrogram lengde ble brukt. NC celler indusert ved å aktivere Wnt signalering (Wnt-NC) ble inkludert (cellene var differentiated i LDN193189 dag 0-3, SB431542 dag 0-4, CHIR99021 dag 0-11 og FACS sortert på dag 11 for sox10) 16. Disse cellene cluster separat fra R-NC-celler, noe som indikerer at wnt-NC-celler og R-NC-celler er distinkte populasjoner. Celler differensiert for 11 dager i LDN193189 og SB431542 ble inkludert som en neuroepithelial kontroll (LSB). R-NC og MS5-R-NC-celler klynge tett sammen i forhold til kontrollceller. Rå genekspresjon data er tilgjengelig på GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) tiltredelse #:. GSE50643 B. Migrasjon analysen. HNK1 + / p75 + FACS sortert R-NC celler ble sådd ut på PO / Lam / FN i 96-brønner og ripete manuelt 24 timer senere. Den 0 hr bildet ble tatt umiddelbart etter riper og etter farging med Hoechst. De gjenværende brønner ble tillatt å migrere i 48 timer før det andre bildet ble tatt. Målestokk: 200 mikrometer C. Sortert R-NC celler fikk lov til å spontant skille for fire dager og ble farget for MaSH1, Tuj1 og DAPI. Målestokk:. 500 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For den vellykkede differensiering av R-NC celler fra hESC / hiPSCs følgende hensyn bør gjøres. Det er viktig å arbeide under sterile kultur forhold til alle tider. Spesielt er det viktig å teste hPSC kulturer for mycoplasma forurensning regelmessig, siden dette vil hindre forurensning vellykket differensiering, men kan ikke lett kan oppdages visuelt i hPSC kulturer. Den R-NC differensiering bør startes med 90-100% celle tetthet; lavere celletetthet påvirker cellers overlevelse og effektiviteten av R-NC differensiering. Det er kritisk for empirisk å validere optimale konsentrasjoner og partinummer for noen av de anvendte reagenser, spesielt KSR for understøttelse effektiv NC differensiering. Når cellene er replated ved dag 11 i dråper, bør celletettheten i den 10 ul dråpe være høy og kan best bestemmes empirisk. Riktig rosett-og NC-dannelse er avhengig av den aktuelle celletettheten i dråpen. Vi empirisk observasjonerVed økt celleoverlevelse når cellene blir vasket minst to ganger etter behandling med accutase. For den vellykkede isolering av R-NC-celler ved FACS de riktige eksperimentelle kontroller, for eksempel unstained, enkelt antistoff farget og sekundære antistoff kun fargede celler er avgjørende. Døde celler kan utelukkes ved DAPI, 7-AAD eller Propidium Jodid farging. Videre bør antistoff fortynninger bestemmes empirisk for hver spesifikk antistoff masse. Det er viktig å rense FACS R-NC-celler ved dobbeltfarging med HNK-1 og p75, siden enkelt farging kan føre til forurensning av NC populasjon med uønsket celletyper, slik som p75-positive celler, CNS tidlig mesoderm eller placode. Vår erfaring er prosenter av dobbel kontra enkelt farget populasjoner kan variere mellom hPSC linjer og differensiering eksperimenter. R-NC-celle overlevelse legg FACS kan økes ved å unngå harde pipettering av cellene, i stedet bla av røret for å resuspendere cellene er tilrådelig. Også, plating R-NC FACSisolerte celler i betinget medium (filtrerte medium cellene vokste i før FACS) har vist seg å forbedre overlevelse 11.. Det er tilrådelig å utføre en mindre skala differensiering i parallell som kan farges med neural epithelial markør Pax6 ved dag 11 og dag 14 for å sikre effektiv nøytralisering og rosettdannelse. NC markører, for eksempel HNK-en eller AP2 på rosetten scenen for riktig NC differensiering bør vurderes også. Videre bør isolerte R-NC-celler bli validert ved morfologi og farging for NC-markører, slik som AP2, HNK-1 og nestin (figur 2).
Denne avledning av MS5-R-NC-celler fra hPSC har blitt beskrevet i 2007 av Lee et al. 10.. Det ble vist at denne forløper populasjonen kan formeres og videre differensiert in vitro i derivatene av NC avstamning. MS5-R-NC-celler kan spontant differensiert ved hjelp av det nevrale sfære metoden 10,17eller ved rettet in vitro differensiering. Det ble fastslått at MS5-R-NC-celler kan gi opphav til celler i det perifere nervesystemet (autonome og sensoriske nevroner), perifer gliaceller (Schwann-celler), myofibroblasts, mesenchymale stamceller og deres etterkommere og glatt muskulatur 10.. Transplantasjon til dama og mus viste at MS5-R-NC celler migrere og differensiere in vivo 10. MS5-R-NC-celler har videre vært implisert i modellering av menneskelige sykdommer. Den karakteristiske fenotype av den genetiske sykdommen familiær Disautonomia (FD) ble modellert in vitro ved hjelp av pasientspesifikke hiPSC-avledet MS5-R-NC celler to. NC karakteristiske fenotyper, slik som dysfunksjonelle NC celleutvikling og migrering ble vist i celler avledet fra FD pasientene, men ikke i friske kontrollceller. MS5-R-NC-celler er også blitt anvendt for å etablere toksikologisk testing av forbindelser som påvirker neural crest migrering under humane embryonaleutvikling, med potensial til å unngå utgivelsen av fremtidige legemidler som kan negativt påvirke neurodevelopment fem. En spennende anvendelse av hPSC teknologi er high-throughput screening og testing av farmasøytiske behandlingstilbud for menneskelige sykdommer. MS5-R-NC-celler ble brukt for å oppnå den første slik skjerm i en iPSC basert sykdomsmodell, dvs. Familial Dysautonomia 4.. Denne skjermen har ført til identifisering av nye forbindelser som kan bli ytterligere evaluert i kliniske forsøk.
For alle anvendelser av hPSC feltet er det avgjørende å ha nøyaktig, reproduserbar, definert og spesifikk in vitro differensiering protokoller tilgjengelig. I denne rapporten viser vi tilpasningen av en etablert in vitro differensiering protokoll for avledning av R-NC celler fra hPSCs. Den rapporterte protokollen gir de samme cellene som tidligere rapportert 10 i mer definerte kulturforhold og en shorter tidsramme. Denne protokollen kan brukes til å generere R-NC celler for menneskelige sykdommer som påvirker celler fra NC avstamning, for sammensatte screening, toksikologi testing og videreutvikling av rettet differensiering protokoller til celletyper som stammer fra NC avstamning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et fellesskap for avanserte forskere fra den sveitsiske National Science Foundation og gjennom tilskudd fra NYSTEM (C026446; C026447) og Tri-institusjonelle stamcelle initiativ (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
