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Artículo de método

Transferencia génica vascular de Stent metálico superficies utilizando Adenoviral Vectores anclada a través hidrolizables reticulantes

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DOI:

10.3791/51653

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12 de agosto de 2014

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1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

Estos estudios informan sobre la unión reversible de vectores de genes adenovirales a superficies metálicas sin recubrimiento de stents y discos de malla modelo. La liberación sostenida de partículas virales competentes para la transducción, supeditada a la hidrólisis de los reticulantes utilizados para la inmovilización de vectores, da como resultado una expresión duradera del transgén específico del sitio en las células vasculares y en las arterias con stents.

Resumen

En reestenosis intra-stent presenta una importante complicación de procedimientos de revascularización base del stent ampliamente utilizados para restablecer el flujo sanguíneo a través de los segmentos estrechados críticamente de las arterias coronarias y periféricas. Stents endovasculares capaces de liberación sintonizable de genes con actividad anti-reestenosis puede presentar una estrategia alternativa para utilizan actualmente los stents liberadores de fármacos. A fin de alcanzar traducción clínica, los stents de elución de genes deben presentar una cinética predecible de liberación de genes vector stent-inmovilizada y la transducción específica de sitio de la vasculatura, evitando al mismo tiempo una respuesta inflamatoria excesiva típicamente asociados con los recubrimientos de polímeros utilizados para atrapamiento físico del vector. Este artículo describe una metodología detallada para la inmovilización sin abrigo de vectores de genes adenovirales a los stents basados ​​en una unión reversible de las partículas adenovirales a polialilamina bifosfonato (PABT) modificada con superficie de acero inoxidable a través de reticulantes hidrolizables (HC). Una familia debifuncional HC (con amina y reactivo con tiol) con una media t medio de la hidrólisis del éster en la cadena que oscila entre los 5 y 50 días se utiliza para vincular el vector con el stent. El procedimiento vector inmovilización se lleva a cabo típicamente en 9 horas y consta de varios pasos: 1) la incubación de las muestras de metal en una solución acuosa de PABT (4 horas); 2) desprotección de grupos tiol instalados en PABT con tris (2-carboxietil) fosfina (20 min); 3) la expansión de la capacidad de reactivo con tiol de la superficie metálica por reacción de las muestras con polietilenimina derivatizados con grupos (PDT) piridilditio (2 hr); 4) la conversión de los grupos PDT a tioles con ditiotreitol (10 min); 5) la modificación de los adenovirus con HC (1 hr); 6) la purificación de partículas adenovirales modificados por cromatografía de exclusión por tamaño en columna (15 min) y 7) la inmovilización de partículas adenovirales reactivos con tiol sobre la superficie de acero tiolada (1 hr). Esta técnica tiene una aplicabilidad potencial amplia más allá de stents,facilitando la ingeniería de superficie de dispositivos bioprotésicas para mejorar su biocompatibilidad a través de la entrega de genes mediada por sustrato a las células de interfaz el material extraño implantado.

Introducción

La eficacia de la terapia génica como una modalidad terapéutica se ve obstaculizada por la escasa capacidad de focalización de los vectores de terapia génica 1,2. La falta de resultados de focalización adecuados en los niveles sub-terapéuticos de la expresión del transgen en la ubicación de destino y conduce a una amplia difusión de los vectores a los órganos ajenos al objetivo 3, incluidos los responsables de montar la respuesta inmune contra tanto el vector como producto terapéutico codificado 4, 5. Un medio potencial para compensar la promiscuidad de transducción y para promover la focalización es introducir vectores de genes en el lugar deseado en una forma que impide su libre difusión a través de la sangre y la linfa. Típicamente, dichos esfuerzos se basan en sistemas de administración local inyectable que comprende ya sea de vectores virales o no virales mezcladas con fibrina, colágeno o ácido hialurónico matrices de hidrogel 6-10 que son capaces de vectores de genes transitoriamente sostienen en el sitio de inyección atrapando físicamente ªem en una red polimérica.

Otro paradigma generalmente aceptado para la terapia génica localizada utiliza inmovilización de vectores génicos en la superficie de los dispositivos prostéticos implantados 11,12. Implantes médicos permanentes (endovasculares, bronquiales, stents urológicos y digestivos, marcapasos, articulaciones artificiales, mallas quirúrgicas y ginecológicas, etc.) Se utilizan cada año en decenas de millones de pacientes 13. Aunque, en general eficaz, estos dispositivos son propensos a complicaciones que no están adecuadamente controlados por las prácticas médicas actuales 14-17. Prótesis implantables presentan una oportunidad única para servir como plataformas de proxy para el tratamiento de la terapia génica localizada. Desde el punto de vista farmacocinético, la derivación de superficie de implantes médicos con dosis relativamente bajas de entrada de vectores de genes resultados en la consecución de los dos altas concentraciones locales de vectores de genes en la interfaz implante / tejido y la desaceleración de la cinética de their eliminación de esta ubicación. Como consecuencia de la residencia prolongada y una mayor captación por la población de células objetivo, vector inmovilización minimiza la propagación del vector de genes. De este modo se reduce la inoculación accidental de los tejidos no diana.

Tethering Superficie de vectores de genes en biomateriales implantables (también denominado como la entrega de genes sustrato o mediada por la entrega de genes en fase sólida) se ha implementado en cultivo de células animales y experimentos utilizando tanto específica (antígeno-anticuerpo 18-20, avidina-biotina 21,22) y no específicos 23-26 (con cargo, de van der Waals) interacciones. La unión covalente de vectores a la superficie del dispositivo implantado se ha considerado previamente como no funcional, ya excesivamente fuertes lazos con la superficie impiden vector de internalización por las células diana. Recientemente se demostró que esta limitación se puede superar mediante el uso de espontáneamente hidrolizable reticulante utilizado como el tetde ella entre la superficie metálica modificada de las proteínas de la cápside de stent y el vector adenoviral 27,28. Por otra parte, la velocidad de liberación del vector y curso temporal de la expresión del transgen in vitro e in vivo pueden ser moduladas con el uso de hidrolizables reticulantes que exhiben diferentes cinéticas de hidrólisis 28.

El presente documento proporciona un protocolo detallado para la unión covalente reversible de vectores adenovirales a la superficie de metal activo y presenta una configuración experimental útil para el estudio subsiguientes eventos de transducción in vitro en el músculo liso cultivadas y las células endoteliales e in vivo en el modelo de carótida de rata de angioplastia stent .

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Protocolo

1 Preparación del marcado con Cy3 Adenovirus para los experimentos de liberación

  1. Suspender 2 x 10 12 partículas de Ad vacío (aproximadamente 2 x 10 11 unidades infectivas) en 650 l de tampón carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9.3).
  2. Disolver el contenido de 1 vial (0,2 mg) de colorante fluorescente-amina reactiva (Cy3 (NHS) 2) en 1 ml CBB a una concentración final de 0,2 mg / ml.
  3. Añadir 100 l de la solución de colorante a la suspensión de virus, vórtice durante 5 segundos y se incuba durante 1 hora a 28 ° C con agitación (100-200 rpm).
  4. Equilibrar una columna de 20 ml de Sepharose 6B con PBS. Añadir 750 l de marcado con Cy3 gota a gota a la suspensión Ad centro del lecho de gel.
  5. Después de la suspensión viral impregna la resina, añadir 5 ml de PBS. Descartar el eluido.
  6. Añadir 0,5 ml de PBS y recoger el eluido en un recipiente de vidrio etiquetados. Repita este paso 10x recogiendo un total de diez fracciones de 0,5 ml.
  7. º Ensayoe recogieron las fracciones por espectrofotometría (260 y 280 nm) para el contenido de ADN viral.
  8. Reunir las fracciones que contienen más de 10% del total (suma de F1 a F10) la densidad óptica (DO) a 260 nm. Nota: Típicamente las fracciones F3, F4, F5, F6 y se reúnen y se mezclan.
  9. Re-ensayo de las fracciones reunidas mixtas por espectrofotometría (260 y 280 nm) y el ensayo de fluorometría (550 EX / 570 em nm) para el contenido de ADN viral y Cy3 etiquetados proteína de la cápside, respectivamente. Nota: Una curva de calibración Cy3 (NHS) 2 que cubre la gama de 10 -9 -10 -13 mol / L se prepara y fluorimétricamente ensayada en la misma placa como las fracciones reunidas.
  10. Calcular el rendimiento de virus marcado y la densidad de etiquetado. Suponga que las partículas 1.19 x 10 12 virus / ml corresponde a 1 unidad de DO para una longitud de recorrido de 1 cm 29. Utilice la fórmula: Rendimiento = [(OD 260nm /1.19)*10 12 * cantidad V / Ad entrada] * 100, donde, OD 260 nm es el de ópticansity de la formulación combinada a 260 nm y V es el volumen de la formulación combinada (ml) para calcular el rendimiento de recuperación de Ad (%). Usa la fórmula: Densidad = C * Etiquetado de 6,02 * 10 23 / ​​(OD 260 nm /1.19)*10 12, donde C es la concentración de Cy3 de la formulación combinada (moles / ml) y OD 260 nm es la densidad óptica de la formulación combinada en 260 nm para calcular la densidad media de etiquetado Cy3. NOTA: Una recuperación típica del virus de marcado es> 70% de la dosis de entrada. La densidad de etiquetado es 600-800 moléculas de fluoróforo por partícula de virus solo.
  11. Ad vacío en porciones más pequeñas (típicamente 5 x 10 11 partículas) adecuados para los experimentos de liberación individuales Alícuota Cy3-etiquetados. NOTA: El protocolo actual se especifica el uso de Ad marcado con Cy3 únicamente en el experimento de liberación. Todos los estudios se llevan a cabo de transducción con vectores no etiquetados.

2. La activación de Metal Samples

  1. Lávese las s inoxidableteel malla discos o stents de acero inoxidable de forma consecutiva en isopropanol (5 x 2 min) y cloroformo (5 min x 2) a 55 ° C con agitación (100 rpm). Eliminar el disolvente.
  2. Calentar las muestras durante 30 min a 200 ° C.
  3. Disolver bisfosfonato polialilamina con instaladas grupos tiol latentes (PABT 27,28,30) en agua (1-2% w / v) a 72 ° C con agitación (100 rpm). Ajustar el pH a 4,5-5 con KHCO3.
  4. Incubar las muestras de metal en la solución PABT de 2-4 horas a 72 ° C con agitación (100-200 rpm). NOTA: El procedimiento puede ser una pausa en este punto. Las muestras son estables durante 3 días a 4 ° C.
  5. Enjuague las muestras tres veces con agua destilada doble (DDW).
  6. Exponer las muestras a tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP; 15 mg / ml en tampón acético 0,1 M) durante 15 min a 28 ° C con agitación (100-200 rpm).
  7. Enjuague 5x en desgasificado DDW.
  8. Exponga las muestras a 2% de polietilenimina con grupos piridilditio instaladas (PEI PDT 27,28,30) en DDW desgasificado en una atmósfera de argón durante 2 horas a 28 ° C con agitación (100-200 rpm). NOTA: El procedimiento puede ser una pausa en este punto. Las muestras son estables durante 2 semanas a 4 ° C.
  9. Enjuague las muestras tres veces con DDW.
  10. Exponer las muestras a 10 mg / ml de ditiotreitol / DDW para convertir grupos piridilditio a tioles.
  11. Enjuague 5x nuevo en desgasificado DDW.

3. Adenovirus Activación y Metal La inmovilización de superficie

  1. Suspender 5 x 10 11 partículas de cualquiera Ad eGFP o Ad Luc (aproximadamente 5 x 10 10 unidades infectivas) en 487,5 hasta 495 l de tampón carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9.3). Nota: Para los estudios de liberación, utilice 5 x 10 11 de Cy3 etiquetados partículas vacías del Anuncio (ajustar el volumen de 487,5 a 495 l con CBB).
  2. Disolver HC con diferentes velocidades de hidrólisis de 28 [(rápidamente (t 1/2 = 5 d), intermedia (t 1 /2 = 12 d) y lentamente (t 1/2 = 50 d) HC, es decir, RHC, IHC o SHC; Figura 1] o no hidrolizable reticulante (NHC), sulfo-LC-SPDP en CBB a 20 mM.
  3. Inmediatamente después, añadir 5-12,5 l de solución de reticulante a la suspensión de virus para un volumen total de 500 l (concentración final 200-500 M de agente de reticulación), vórtice y se incuba durante 1 hora a 28 ° C con agitación (de 100 200 rpm).
  4. Equilibrar una columna de 20 ml de Sepharose 6B con 5 mM EDTA desgasificado / PBS (EPB). Añadir gota a gota 500 l de reticulante modificado suspensión Ad al centro del lecho de resina.
  5. Añadir 5 ml de desgasificado EPBs. Descartar el eluido.
  6. Añadir 0,5 ml de desgasificado EPBs y recoger el eluido en un recipiente de vidrio etiquetados. Repita este paso 10 veces recogiendo un total de diez fracciones de 0,5 ml.
  7. Determinar la DO de las fracciones recogidas mediante espectrofotometría a 260 y 280 nm y convertir OD a los títulos de virus (1,19 x 10 12 / ml Correponde a 1 OD) 29.
  8. Reunir las fracciones que contienen> 10% de los virus eluido (Nota: Típicamente, las fracciones F3-F6). Repita el ensayo de valoración espectrofotométrica para la suspensión combinada.
  9. Transferir la suspensión viral para el vial con las muestras de metal activadas (como por 2.11). Incubar en una atmósfera de argón durante 1 hora a 28 ° C con agitación (100-200 rpm). Nota: Las muestras de metal de Ad-atado obtenido en esta etapa se utilizan además en los experimentos de liberación y de transducción de posteriores descritos en las secciones de protocolo 5-7.

4. Cuantificación de Ad asociado a superficies del vector por PCR

  1. Preparar mallas formulados con superficie inmovilizada Ad eGFP atado a través de NHC, SHC, IHC y RHC (n = 3 para cada tipo) como se describe en las secciones 2 y 3.
  2. Utilice un kit QIAamp DNA Micro para aislar el ADN viral. Colocar las mallas individualmente en tubos de plástico de 1,5 ml que contienen 200 l de mezcla compuesta de 180 l de ATL bUffer y 20 l de proteinasa K (tanto desde el kit). Añadir cantidad conocida de partículas de Ad eGFP (como estándares para la curva de calibración) en los tubos separados que contienen la misma mezcla. Se incuba a 56 ° C durante la noche sin agitación.
  3. Añadir 200 l de tampón AL (del kit), mezclar mediante agitación, añadir 200 l de etanol al 100%, y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Transferir la mezcla de cada tubo sobre una columna individual MinElite (del kit) y centrifugado a 8.000 rpm durante 1 min. Enjuague los tubos que contienen malla con 180 l de tampón ALT fresco, añadir sobre las respectivas columnas y centrifugado a 8.000 rpm durante 1 min. Desechar los eluatos.
  5. Añadir 500 l de tampón AW1 (del kit) en las columnas y centrifugado a 8.000 rpm durante 1 min. Desechar los eluatos.
  6. Añadir 500 l de tampón AW2 (del kit) en las columnas y centrifugado a 8.000 rpm durante 1 min.
  7. Desechar los eluatos.
  8. Centrifugado a 14.000 rpm durante 3 min adicionales un until las columnas estén completamente secas. Desechar los eluatos.
  9. Añadir 50 l de agua MilliQ grado en las columnas. Haz girar a 14.000 rpm durante 5 min. Recoger 50 l de eluato de la columna en cada tubo individual colección (del kit).
  10. Preparar la solución de PCR Master Mix se multiplica mediante la combinación de de los siguientes (12,5 l de SYBR Green Potencia PCR Master Mix, 0,63 l de 10 mM eGFP cebador sentido [5'-TAA ACG ACG GCC AGT ACA TC -3 '], 0,63 l de 10 M eGFP anti-sentido cartilla [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG 3 '], 6,3 l de agua Milli-Q-grado). Multiplicar estos volúmenes por el número de reacciones previstas incluidos los controles "no" de ADN.
  11. Carga 5 l de eGFP ADN Ad (desde el paso 4.8) y 20 l de PCR Master Mix en los pocillos por triplicado de un óptico Placa de reacción de 96 pocillos MicroAmp. Sellar la placa con MicroAmp óptico Película adhesiva. Haga girar la placa a 1.000 rpm durante 1 min para eliminar las burbujas de aire.
  12. Colocar la placa en el receptáculo de un 7500 Real-Time PCR motor. En el menú principal del 7500 Sistema SDS Software (v1.4 o superior), seleccione "Crear nuevo experimento". Haga clic en "Siguiente". En la pantalla "Asistente para nuevo experimento" elegir Sybr verde de un menú de desplazamiento hacia abajo y haga clic en "agregar". Haga clic en "siguiente" para conseguir un diseño de la placa. Resalte todos los pocillos a analizar, seleccione Sybr Verde. Resalta de forma consecutiva sin control de los pozos de ADN, normas y incógnitas ADN Ad eGFP, y marcarlos mediante respectivas designaciones en el menú de desplazamiento hacia abajo.
  13. Cambie a la ficha instrumento. Seleccione "añadir fase de disociación", cambiar el volumen así de forma predeterminada 50 l 25 l. Haga clic en iniciar.
  14. Analizar los resultados de PCR utilizando después de comprobar el resumen QC para los valores atípicos y otras irregularidades.

5. Cinética de liberación de hidrolizables reticulante-atado partículas de vector de la malla de acero Modelo

  1. Lavar las muestras de malla derivatizados con Ad marcado con Cy3 a través de RHC, IHC, SHC y NHC (según 3.9) en 1% de BSA / PBS (1 hr x 3) con agitación (100-200 rpm).
  2. Usando unas pinzas finas estériles, colocar las mallas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos rellenados con 200 l de tampón de elución (0,1% de BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
  3. Tomar imágenes fluorescentes de una parte central de cada malla. Grabar los ajustes del microscopio y la cámara CCD utilizada para la adquisición de imágenes.
  4. Analice la placa fluorimétricamente (550 EX / 570 em) en modo bien-scan con la máxima reducción. Utilice los pocillos con mallas no derivatizado como un control de fondo.
  5. Incubar la placa a 37 ° C con agitación (50 rpm).
  6. En momentos predeterminados (1-30 días) Rango de aspirar el tampón de elución sin molestar a las mallas y añadir 200 l de tampón de elución fresca. Repita los pasos 4.3 a 4.5 después de sustituir la memoria intermedia.

6. Transducción de Cultivadas Cells por inmovilizadas-Mesh Ad Vectores

  1. Lavar el eGFP Ad - Luc o Ad -derivatized mallas tres veces con PBS estéril durante 5 min con agitación (100 rpm).
  2. El uso de pinzas estériles finas eliminar los discos de malla de uno en uno y los coloca individualmente en los pocillos de una placa de 96 pocillos con el tipo de célula de interés en la fase logarítmica de crecimiento.
  3. Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C, en 5% de CO 2.
  4. Utilice el ensayo respectivo no terminal de punto final (microscopía fluorescente, fluorometría para EGFP o imágenes de bioluminiscencia para la luciferasa) para determinar la extensión y la distribución espacial de la expresión génica en los pocillos.
  5. Opcionalmente, el medio sustituto de PBS para aumentar la sensibilidad del ensayo de fluorometría (485/535 nm) si se espera una baja expresión eGFP. Nota: Si un fluorómetro está equipado con capacidad de exploración bien, lee la placa en un modo bien-scan para evaluar la distribución espacial de las células en los pocillos que expresan eGFP. Tipo PBS para el medio después de completar fluorometría.
  6. Imagen de las células transducidas en los pozos con mallas Ad eGFP -eluting (tanto subyacentes y periféricas de la malla) utilizando el filtro para FITC. Tome imágenes representativas en 40-200X ampliación. Registre la configuración exacta del microscopio fluorescente y la cámara CCD utilizada para la adquisición de imágenes.
  7. Añadir 5 l de luciferina en PBS (10 mg / ml) directamente a los pozos con Ad Luc -eluting engrana a una concentración final de 500 mg / ml y se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 10 minutos antes de la bioluminiscencia de imágenes . Aspirar los medios de comunicación y reemplazar con los medios de comunicación-luciferina libre después de la impresión.
  8. Ensayos de punto final de repetición en momentos predeterminados (hasta 2 semanas) para el estudio de la cinética de la expresión del gen indicador después de la transferencia génica mediada por sustrato.

7. Validación de Conservado Capacidad Transducción en Puntos de tiempo de retardo

  1. Preparar el anuncio de eGFPmallas rivatized utilizando RHC, IHC, SHC y NHC por vector tethering (como por 02.01 a 02.11 y de 03.01 hasta 03.09) y colocar de forma individual las mallas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 60-80% de células endoteliales aórticas bovinas confluentes (BAEC ).
  2. Analizar la transducción de BAEC cultivadas con inmovilizada malla Ad-eGFP en 1 y 2 días después de la colocación de malla usando microscopía de fluorescencia y fluorometría (según 6.4 a 6.5).
  3. 48 horas después del comienzo de la transducción de lavar los pozos que contienen malla con PBS dos veces.
  4. Añadir 200 l de 0,25% de tripsina / EDTA a cada pocillo e incubar durante 15 min a 37 ° C con agitación (100 rpm). Lave 3 veces con PBS.
  5. Utilice la microscopía fluorescente y fluorometría para determinar la eliminación completa de todas las células EGFP-positivos asociados con las mallas.
  6. Semilla pase reciente BAEC en los pocillos con mallas parcialmente liberadas a una densidad inicial de siembra de 60-80% (2-2,7 x 10 4 células / pocillo).
  7. Incubar la placa a 37 ° C CO y el 5% 2 por periodos de tiempo predeterminados (1-10 días) antes de la evaluación de los "nuevos" eventos de transducción por microscopía fluorescente y fluorometría.

8. Ad-stent liberador de despliegue en la carótida Modelo de Stent La angioplastia Rata

  1. Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se ajustan a las reglamentaciones federales sobre el uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el IACUC del Hospital de Niños de Filadelfia. Para cumplir con las condiciones quirúrgicas asépticas todos los instrumentos se esterilizan en autoclave. Para asegurar la esterilidad continua un esterilizador de cuentas se emplea entre el uso de los instrumentos en un máximo de cinco animales consecutivos.
  2. Prepare Ad Luc -eluting stents según 02.01 a 02.11 y de 03.01 a 03.09. Guarde los stents virus derivado en PBS estéril a 4 ° C durante no más de 24 horas antes de su uso.
  3. Anestesiar ratas macho Sprague-Dawley (400-450 g) con inyección IP de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg). DeTermine la profundidad de la anestesia por la pata respuesta pellizco y el tono muscular. Aplique un ungüento oftálmico veterinario para evitar la sequedad de la córnea y la esclerótica. Nota: La anestesia por inhalación con un 4% y 2% de isoflurano (1 L / min) para inducir y mantener la anestesia, respectivamente, es posible, pero impide el acceso gratuito a la zona del cuello del animal y por lo tanto no se recomienda para un usuario inexperto.
  4. Vuelva a evaluar la profundidad de la anestesia por pizca dedo del pie. Afeitado y cuello preparación aséptica y la región superior del pecho. Administrar antibiótico (cefazolina; 20 mg / kg; IM), analgésicos (meloxicam; 0,5 mg / kg; SC) y solución salina (10 ml / kg; SC). Cateterizar la vena de la cola con una G catéter 24 y administrar heparina (200 UI / kg; IV). Nota: Una dosis de / kg (IM) 10 mg de enrofloxacino (Baytril) se puede utilizar en lugar de cefazolina. Evitar el uso de antibióticos que carecen de actividad significativa frente a bacterias Gram-positivas. 10-15 mg / kg de carprofeno (Rimadyl) puede utilizarse en lugar de meloxicam como un analgésico preventivo. Los analgésicos narcóticos (e.g., morfina, buprenorfina) debe evitarse debido a sus propiedades de respiración-deprimente.
  5. Realizar una incisión de línea media a través de la fascia de la piel y el cuello. Utilizar técnicas de disección roma para aislar la arteria carótida externa izquierda. Tie-off de la arteria carótida externa en el lugar accesible más distal. Aplique una ligadura temporal deslizante para el origen de la arteria carótida interna.
  6. Haga una incisión de 2 mm arteriotomía en la arteria carótida externa izquierda.
  7. Insertar un catéter Fogarty 2-francesa en la arteria carótida común a través de la incisión en la arteria carótida externa. Inflar la punta del catéter con solución salina y pasar 3x desde el arco aórtico hasta la bifurcación de la carótida con el fin de desnudar el endotelio.
  8. Deslizar un trozo de tubo (1,04 mm OD, 0,99 mm ID) sobre el catéter Fogarty y en la arteria carótida común. Retirar el catéter de Fogarty.
  9. Monte y engarce un anuncio Luc -derivatized stent sobre el balón de un 1,5catéter de angioplastia mm de diámetro. Inserte el stent a través del tubo de teflón y avanzar en la sección media de la arteria carótida común. Evite frotar el stent contra la pared del tubo o vaso.
  10. Implementar el stent a las 12 atm durante 30 segundos y retirar el catéter de angioplastia.
  11. Tie-off el proximal de la arteria carótida externa al sitio arteriotomía y suelte la ligadura temporal en la arteria carótida interna.
  12. Reparar la herida operatoria en capas con el funcionamiento de 4,0 Vicryl y grapar la piel.
  13. Recuperar el animal sobre una almohadilla de calentamiento hasta ambulatoria y volver a su jaula aislada. Mientras que no hay signos de dolor o malestar son típicamente exhibidos por los animales después de la operación más allá de la primera 12 horas después del procedimiento, considere la extensión de la terapia de meloxicam (0,5 mg / kg, SC al día) durante 72 hr.

9. bioluminiscencia Imaging arterial de la Expresión Génica

  1. En los puntos de tiempo predeterminados (1 día - 3semana rango) después del despliegue del stent gen de rapamicina en la arteria carótida común, anestesiar la rata con anestesia de inhalación de isoflurano (2-4% de isoflurano en oxígeno).
  2. Retire las grapas quirúrgicas, asépticamente preparar el sitio y volver a abrir la herida operatoria. Usando el acceso disección, re-ganancia contundente en la arteria carótida común izquierda y separarlo del nervio vago y el tejido conectivo adyacente.
  3. Preparar una mezcla de 50 mg / ml en PBS luciferina y 25% de Pluronic F-127 en PBS (1: 4 v / v) y almacenar en hielo. Nota: Esta formulación se presenta como una solución viscosa a 4 ° C e inmediatamente la convierte en gel al entrar en contacto con el tejido a 37 ° C.
  4. Aplicar 200 l de una mezcla enfriada luciferina / Pluronic directamente al segmento expuesta de la arteria carótida común y verificar la solidez de gel.
  5. Colocar el animal en posición supina en la cámara de imágenes del aparato IVIS Spectrum-y mantener la anestesia isoflurano con una máscara facial.
  6. En la acquisitien la ventana del panel de control (imagen vida, versión 4.2 o superior) elegir la posición "B" (6.6 cm de la cámara a la distancia del objeto) y se va a agrupar el factor "medio" en los menús desplegables titulado "campo de visión" y "binning", respectivamente. El tipo de "2,5 cm" en el cuadro de altura tema. Elija "min", como una unidad de tiempo en el cuadro de "tiempo de exposición", y seleccione un valor numérico de "2".
  7. Tres minutos después de la aplicación de la / gel Pluronic luciferina, iniciar la adquisición de imágenes haciendo clic en el botón "Adquirir" en la pantalla. NOTA: el tiempo de adquisición de imágenes se puede variar de 1 a 6 min dependiendo de la intensidad de la señal esperada.
  8. Después de la adquisición de la imagen, lavar el gel con solución salina y aplique el espacio periarterial con gasa y algodón aplicadores estériles.
  9. Cierre la herida con sutura Vicryl y grapar la piel.
  10. Recuperar el animal y volver a su jaula. Repetir imágenes en adelante tpuntos iempo para estudiar la evolución temporal de la expresión arterial provocada por los vectores de Ad-stent inmovilizado.
  11. Alternativamente, realizar las imágenes después de una administración sistémica de luciferina. Anestesiar y preparar el animal como por 9.1-9.2. Cateterizar la vena de la cola con una G catéter 24 y el catéter segura con cinta quirúrgica.
  12. Preparar una solución de luciferina en PBS (50 mg / ml) y se inyecta 1 ml de la solución a través del catéter en un intervalo de 10 seg. Uno min después de la inyección se inicia la adquisición de imágenes como por 9.7 a 9.8. Nota: Una tasa de inyección más rápida (<10 seg) puede provocar actividad convulsiva y paro respiratorio. El animal debe ser sacrificado si se presentan convulsiones o paro respiratorio durante la exploración.
  13. Siga el paso 9.10.

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Resultados

Experimentos vector de liberación

Tethering de vectores adenovirales a la superficie de los implantes, incluyendo dispositivos de intervención, tales como stents endovasculares, se aproxima el vector al sitio de la enfermedad, obviando parcialmente la falta de orientación física vectores. Sin embargo, para ser capaz de lograr efectos terapéuticos a través de la transducción de tejido diana, el vector debe ser liberado de la superficie (Figura 2). El uso de h...

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Discusión

El protocolo presentado describe un método operativo para la entrega de genes mediada sustrato logrado a través de unión reversible de vectores adenovirales sin abrigo para superficies de acero inoxidable. Si bien desarrollado para el propósito específico de la terapia génica basada en stent de la reestenosis vascular, esta técnica tiene aplicaciones mucho más amplias en las áreas de biomateriales, implantes biomédicos y la terapia génica.

Aunque los estudios presentados únicamente han...

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Divulgaciones

El desarrollo del protocolo y los estudios presentados en este documento fueron apoyados en parte por las subvenciones de Desarrollo Científico de la Asociación Estadounidense del Corazón (IF 0735110N y MC 10SDG4020003), la subvención HL 72108 (R.J.L.) del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de EE. UU. y el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de EE. UU. T32 007915 (SPF). Los catéteres de angioplastia fueron amablemente donados por NuMED (Hopkinton, NY). Los autores desean agradecer la asistencia secretarial de la Sra. Susan Kerns.

Agradecimientos

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que revelar.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Discos de malla de acero inoxidable 316Electon Microscopy SciencesE200-SS
Stents genéricos de acero inoxidable de grado 304Laserage pedido
AdeGFPNúcleo vectorial de la Universidad de PensilvaniaAD-5-PV0504
AdLucNúcleo vectorial de la Universidad de PensilvaniaAD-5-PV1028
AnuncioVACÍOUniversidad de Pensilvania Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
UV Placas de 96 pocillosCostar3635
Fluorometría Placas de 96 pocillosCostar3915
Placas de cultivo celular de 96 pocillosFalcon353072
Tris(2-carboxietil)clorhidrato de fosfina (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Dithiothreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
EspectrofotómetroMolecular Devices SpectraMax 190
EspectrofluorómetroMolecular DevicesSpectraMax Gemini EM
Incubadora agitadora orbitalVWR1575R
Horno de flujo de aire horizontalShel Lab1350 FM
Centra-CL2 centrífuga International Equipment Company426
Mezclador de vórtice digitalFisher Thermo Scientific02-215-370
Microscopio de fluorescencia Eclipse TE300Nikon Cámara CCD TE300
DC 500LeicaDC-500
7500 Sistema de PCR en tiempo realApplied Biosystemsno disponible
Estación de bioluminiscencia IVIS SpectrumPerkins-Elmerno disponible
Sal dipotásica EDTASigma-AldrichED2P
Fracción de albúmina sérica bovina V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Pinzas DumontFine Science Tools11255-20
A10 línea celular ATCCCRL-1476
Células endoteliales aórticas bovinasLonzaBW-6002
Luciferina, sal de potasioGold BiotechnologyLUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS sin calcio y magnesioGibco14190-136
Suero fetal bovinoGemini Bio-Productos100-106
Solución de penicilina/estreptomicinaGibco11540-122
DMEM, alta glucosaCorning cellgro10-013-CV
0.25% Tripsina/EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA micro kitQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master Mix AppliedBiosystems4367659
Placa de reacción óptica MicroAmp de 96 pocillosApplied BiosystemsN8010560
película adhesiva óptica MicroAmpApplied Biosystems 4360954
Cephazolin Apotexno disponible
Loxicom (Meloxicam)Norbrookno disponible
Heparina sódicaAPP Productos farmacéuticosno disponibles
Ketavet (Ketamina)VEDCOno disponible
Anased (xilacina) Lloideno disponible
Forano (Isoflurano) Baxterno disponible
Pinza de iris Moria curvadaHerramientas de ciencia fina11370-31
Pinza de Graefe extrafina curvadaHerramientas de ciencia fina11152-10
Pinza Dumont #5Herramientas de ciencia fina11252-20
Tijeras de resorte VannasHerramientas de ciencia fina15018-10
Tijeras finas - ToughCutFine Science Tools14058-09
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools14101-14
Sutura de vicryl (5-0)EthiconJ385
Hilo de sutura (seda 4/0) Fine Science Tools18020-40
Pinzas de sutura MichelFine Science Tools12040-02
Dilatador de heridas (espéculos oculares de Lancaster)KLS Martin34-149-07
Esterilizador de perlas en calienteFine Science Tools18000-45
Michel aplicador de pinza de suturaFine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV catéterBeckton-Dickinson381412
2F Catéter FogartyEdwards Lifesciences120602F
Tubo de teflónVention041100BST
Catéter PTANuMedpedido
Almohadillas de gasaKendall Healthcare9024
Aplicadores de algodónSolon ManufacturingWOD1003
Solución salinaBaxter281321
jeringa de 10 ml (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
jeringa de 1 ml (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
Clippers con cuchilla #40Oster 78005-314
Cinta quirúrgica Transpore3MMM 15271
Puralube pomada veterinariaPharmadermno disponible
personalizadopersonalizado

Referencias

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