Summary
Er is duidelijk een behoefte aan betere informatie over de moleculaire bestuurders van Barrett-slokdarm. Immunofluorescentie kleuring is een nuttige techniek voor het begrijpen van de effecten van celsignalen op celmorfologie. Wij presenteren een eenvoudig, efficiënt protocol voor het gebruik van immunofluorescentie kleuring therapeutische behandeling van Barrett-slokdarm cellen bepalen.
Abstract
Adenocarcinoom van de slokdarm (EAC) heeft een totale overleving van minder dan 17% en de incidentie van EAC is dramatisch gestegen in de afgelopen twee decennia. Een van de belangrijkste risicofactoren EAC Barrett-slokdarm (BE), een metaplastische wijziging van de normale squameuze slokdarm in reactie op chronische maagzuur. Ondanks de gevestigde verbinding tussen EAC en BE, ondervraging van de moleculaire gebeurtenissen, met name veranderde signaalwegen betroffen progressie van BE aan EAC, worden slecht begrepen. Veel van dit is te wijten aan het gebrek aan geschikte in vitro modellen voor deze ziekten te bestuderen. Recent zijn geïmmortaliseerde cellijnen BE commercieel beschikbaar waardoor in vitro studies BE. Hier presenteren we een methode voor immunofluorescente kleuring van geïmmortaliseerde cellijnen BE, waardoor in vitro karakterisering van celsignalen en structuur na blootstelling aan therapeutische verbindingen. Toepassing van deze technieken zal help ontwikkelen inzicht in de bij BE EAC progressie mechanismen en voorzien mogelijke wegen voor behandeling en preventie van EAC.
Introduction
Barrett-slokdarm (BE) is een metaplastische wijziging van het normale squameuze epitheel van de slokdarm als een gevolg van chronische blootstelling aan de maaginhoud gevolg van gastro-oesofageale refluxziekte (GERD) 1. BE wordt verondersteld om een beschermingsmechanisme in reactie op GERD, echter de aanwezigheid van BE brengt een verhoogd risico van esophageal adenocarcinoom (EAC), een ziekte die een significant slechte overleving 1 draagt. Huidige schattingen suggereren dat tot 5,6% van de Amerikaanse bevolking hebben, echter als BE vaak asymptomatisch, men denkt dat de meerderheid van BE blijft gediagnosticeerd 2. Zoals incidentiecijfers van zowel GERD en EAC aanhoudende groei 3 hebben gezien, is het belangrijk geworden om de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de progressie van BE om EAC te begrijpen, vooral omdat deze informatie zou kunnen verschaffen therapeutische benaderingen aan de preventie van progressie van BE aan EAC.
1. Chronische ontsteking, letsel, en genotoxische schade als gevolg van langdurige blootstelling aan de maaginhoud oefenen selectieve druk op de BE laesie bevorderen neoplastische progressie naar EAC. Een aantal genetische wijzigingen zijn vastgesteld tijdens BE EAC progressie. Echter, ondanks dit is er een duidelijk gebrek aan inzicht in de exacte wijzigingen in cel signalering en latere effecten op cel-structuur en functie.
Vereeuwigd in vitro cellijnen zijn nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van de effecten van cell signaling, met name in het onderzoek naar de effecten van gerichte therapeutische verbindingen. De recente commerciële beschikbaarheid van geïmmortaliseerde cellijnen BE mogelijkheid deze studies. Hoewel high-throughput assays, zoals de veelgebruikte levensvatbaarheid assays, waardevol zijn om de gevolgen van gerichte therapie bij celproliferatie en survival 4-6, deze tests zijn niet bruikbaar voor het ondervragen van de effecten van celsignalen op celmorfologie. Immunofluorescentiekleuring (IF) is een nuttige techniek voor het onderzoeken van de effecten van gerichte therapie op de morfologische, groei en overleving eigenschappen van cellen en eiwitten die betrokken zijn. Ons laboratorium heeft deze methoden aangepast naar onsterfelijk BE cellijnen, met behulp van IF om de effecten van een klinisch beschikbare medicijn op BE cellijnen te evalueren in de hoop van het afbakenen van een mogelijke chemopreventative behandeling en biomarker voor behandeling met geneesmiddelen 7. Evenzo toepassing van deze technieken in EAC, BE en vereeuwigd slokdarm cellijnen heeft afgebakend kritische bevindingen ten aanzien BE EAC progressie 8-10. We vinden als analyse van BE cellen behandeld met gerichte therapieën heeft waarde, waardoor voor de karakterisering van de veranderingen in de celstructuur en eiwit lokalisatie. Hier presenteren we onze methoden voor IF van onsterfelijk BE cellen characterize behandeling met geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Line Maintenance
- Vereeuwigd Human BE hoogwaardige dysplastische (CP-B, CP-C, CP-D) en metaplastische (CP-A) cellijnen door stabiele transfectie van de menselijke telomerase reverse transcriptase (tert) eiwit 11.
- Handhaaf BE cellijnen keratinocyt medium aangevuld met runderhypofyse-extract (BPE), epidermale groeifactor (EGF), 5% foetaal runderserum (FBS), niet-essentiële aminozuren (NEAA), penicilline-streptomycine-neomycine (PSN) en standaard weefselkweek omstandigheden (37 ° C, 5% CO2, 98% vochtigheid).
2. BE Cell Plating
- Voorbereiding van de 12-well plaat / dekglaasjes. Plaats 18 mm dekglaasjes in een glazen petrischaal en autoclaaf. Transfer geautoclaveerd 18 mm dekglaasjes in een 12-well weefselkweek schotel met een steriele glazen pipet bevestigd aan een vacuüm buis. Was het dekglaasje met steriele PBS en media.
- Trypsinize en tel vereeuwigd BE cellen. Count usi cellenng een geautomatiseerde cel teller of een hemocytometer. Verdun de cellen in kweekmedium tot een concentratie van 20.000-40.000 cellen / ml.
- Plaats 1 ml van de cellen in elk putje met een dekglaasje voor een totaal aantal cellen van 20.000-40.000 cellen / well.
- Gebruik een steriele pipet tip om duw het dekglaasje op de bodem van de put zodat de cellen hechten aan het dekglaasje.
3. Drug Treatment van BE Cells
- Verdun gekozen geneesmiddel in warm (37 ° C) media om de gewenste concentratie en meng goed door het buisje herhaaldelijk of met een vortex mixer. Bepaald geneesmiddel concentraties empirisch. Begin behandeling 24 uur na de eerste zaaien van de cellen zijn cellen beslag op het dekglaasje toe
- Ter vergelijking en controle, behandelen een extra dekglaasje van BE cellen met 0,1% voertuig (dimethylsulfoxide [DMSO] of middel dat wordt gebruikt om verbinding oplosbaar te maken) verdund in kweekmedium. Label plaat met een lab pen om drugs te identificeren en veOORZAKEN behandelde monsters. Plaats cellen in een celkweek incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2, 98% vochtigheid en incubeer gewenste tijdstippen.
4. Immunofluorescentiekleuring
- Bevestiging
- Na de gewenste incubatietijd van behandeling met geneesmiddelen, zuigen de media en snel was de dekglaasjes met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur (RT, 25 ° C).
- Zuig het PBS en voeg 1 ml PBS met 4% PFA [4% PFA / PBS] aan elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Zuig het 4% PFA / PBS en was de dekglaasjes 3x, 5 minuten elk met PBS bij kamertemperatuur. WINKEL dekglaasjes gedurende een week in PBS/0.1% PFA bij 4 ° C indien gewenst.
- Permeabilisatie / blokkeren
Permeabilize vaste PFA cellen zodat het antilichaam om de intracellulaire doelwitten. Voor extracellulaire opgedoken eiwitten, voeren alle volgende stappen zonder saponine toegevoegd aan de 1x PBS/0.5% BSA-oplossing.- Verminder achtergrond door incubatie met 50 mM NH4Cl verdund in PBS gedurende 10 min bij kamertemperatuur en wassen met PBS RT eenmaal voor 5 minuten.
- Incubeer BE cellen gedurende 30 min in 100-300 ul PBS dat 0,1% saponine en 0,5% runderserumalbumine (BSA). Verdunnen van saponine-filter gesteriliseerde 10% voorraad, bereid in water en bewaard bij 4 ° C.
- Voorbereiding van Human Kamer
- Bereid een vierkant bioassay schaal van gelaagdheid van de bodem van de kamer met vochtige papieren handdoeken en plaats een laagje Parafilm geplaatst.
- Voorzichtig overdracht van de dekglaasjes, cellen naar boven, op de Parafilm behulp van een tang en een injectienaald.
- Markeer de Parafilm met een lab pen om dekglaasjes identificeren.
- Primaire antilichaam incubatie
- Verdun het primaire antilichaam in PBS met zowel 0,5% BSA en 0,1% saponine.
- Dep voorzichtig uit de blokkerende oplossing met behulp van een laboratorium weefsel en voeg 100 ul van het primaire antilichaam oplossing. Incubeer het primaire antilichaam op de BE cellen overnacht bij 4 ° C.
- Secundair antilichaam incubatie
- Was de dia's 3x met PBS/0.5% BSA/0.1% saponine gedurende 5 minuten elk bij RT.
- Verdun secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorescerend label in PBS/0.5% BSA/0.1% saponine dat het secundaire antilichaam de soorten waarbij het primaire antilichaam werd verhoogd herkent.
- Voeg 100 ul van verdund antilichaam tegen elke dekglaasje. Incubeer het secundaire antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen en Montage van Coverslips
- Was de dekglaasjes 3x, 5 min elk in PBS/0.5% BSA/0.1% saponine. Verwijder de wasbuffer en voeg 100-300 ul van PBS om de dekglaasjes.
OPMERKING: Bij een dubbele antilichaam kleuring, herhaalt u de stappen 4,4-4,5 met de gewenste extra primaire en secundaire antilichaam volgens de informatie die in de discussie. - Met behulp van een tang, voorzichtig omhoog het dekglaasje en dep uit de PBS met behulp van een laboratorium tissue of papieren handdoek.
- Voeg 15 ul van een geschikte anti-fade montage media met 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) aan het dekglaasje en keer het dekglaasje, Cellen naar beneden, op een glazen objectglaasje.
- Plaats de dia's in een map glijbaan en incubeer de buurt van direct licht nacht bij kamertemperatuur, zodat de harde set anti-fade medium te genezen, volgens de instructies van de fabrikant. Wanneer de anti-fade medium is ingesteld, kan dia worden opgeslagen bij 4 ° C of -20 ° C tot microscopische visualisatie.
- Was de dekglaasjes 3x, 5 min elk in PBS/0.5% BSA/0.1% saponine. Verwijder de wasbuffer en voeg 100-300 ul van PBS om de dekglaasjes.
5. Microscopische Visualisatie van Coverslips
Gekleurde cellen kunnen worden afgebeeld via ofwel confocale microscopie of een IF staat rechtop microscoope. Hoewel confocale microscopie biedt een hoge-resolutie beelden op discrete diepten, een rechtopstaande microscopisch kan produceren bruikbare beelden sneller. Kortheidshalve Stained een methode van beeldvorming cellen met behulp van standaard microscopie wordt gepresenteerd. In het algemeen, het fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) of soortgelijke fluoroforen (bijv. groen fluorescent eiwit), Texas Red en DAPI, vereist een microscoop met filters kunnen onderscheiden deze fluoroforen. Controleer de microscoop voor het begin protocol om compatibele fluoroforen bepalen.
- Imaging op een standaard IF Microscoop
- Verwijder opgeslagen slides / dekglaasjes van -20 ° C en 4 ° C en laat ze op kamertemperatuur komen. Power on microscoop en kwik booglamp.
- Plaats microscoop dia met dekglaasje gericht naar doel op microscoop podium. Voor gebruik van een olie-immersie objectief, voeg een druppel immersie olie op dekglaasje.
- Selecteer de DAPI filter en open het klepje. Stel scherp op het doel terwijl u door de oculairs tot het beeld verschijnt. Aangezien alle cellen kleuren met DAPI, moet de kernen gemakkelijk waarneembaar zijn.
- Verzamel beelden met behulp van respectieve beeldbewerkingssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van de resultaten van toepassing van de procedures beschreven resultaten is weergegeven in figuren 1A-D. Dekglaasjes met CP-D en CP-C BE cellen werden behandeld gedurende 24 uur met 1 uM van de SRC-familie remmer, SKI-606, of voertuig (DMSO) en gekleurd met behulp van de bovenstaande procedures voor de Adherens Junction en Wnt signalering eiwit, β -catenine. Visualisatie van β-catenine werd bereikt door labeling met een anti-konijn IgG gekoppeld aan een groene fluorofoor, terwijl kenmerken van de celkern werd bewerkstelligd door labeling met DAPI (blauw). Dekglaasjes werden gemonteerd om dia microscoop met harde set monteren en cellen werden afgebeeld met behulp van laser scanning confocale microscoop met een 63X/1.4N Plan-Apochromat doelstelling. De gekozen groene fluorofoor werd geëxciteerd bij 488 nm en gevisualiseerd met behulp van een emissie filter bij 505-525 nm. Evenzo werd DAPI geëxciteerd bij 405 nm en emissie verzameld met behulp van een filter bij 410-460 nm. Activiteit van de tyrosine kinase, Src is toegenomen, met name in hooggradige dysplasie 12. In overeenstemming met waarnemingen bij colorectale en prostaatkanker cellen 13-15 remming van Src resulteert in herlokalisatie van β-catenine uit het cytoplasma / kern (pijlen, figuren 1A, 1C en 1E) aan het celmembraan (pijlpunten figuren 1B, 1D en 1F). Met deze technieken hebben wij en anderen eerder aangetoond dat remming van Src verandert ook de expressie en lokalisatie van de tumor onderdrukker p27 kip1 7,16 en deze werkwijzen worden momenteel gebruikt in ons laboratorium.
μ
Figuur 1. IF BE geïmmortaliseerde cellen na behandeling met een remmer van Src kinase. CP-C (AD) en CP-D (E, F) Werden behandeld met drager (DMSO, linker panelen) of 1 uM van de Src-remmer, SKI-606, gedurende 24 uur (rechter panelen). BE cellen werden gefixeerd en gekleurd volgens het beschreven protocol. β-catenine (groen) werd gevisualiseerd met behulp van een specifiek antilichaam en een secundair antilichaam gekoppeld aan Alexa Fluor 488, terwijl de kern werd gekleurd met DAPI (blauw). Let op de verandering in de lokalisatie voor β-catenine uit de kern (pijlen) aan de celmembraan (pijlpunten) na behandeling met SKI-606. C, D) Vergrote afbeeldingen van witte dozen in A en B, verder onder de aandacht van de veranderingen in de β- catenine lokalisatie. Deze beelden vertegenwoordigen ideale kleuring met minimale achtergrond en verschillende kleuring voor het gekozen doel. Bars, 7 urn (A, B, D, F), 0,5 urn (C, D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben een werkwijze voor het aanbrengen van IF BE cellen naar het ophelderen van de fysiologische effecten van gerichte therapie op deze cellen beschreven. Hoewel wij het gebruik van deze procedures naar BE cellen beschreven, hebben wij gevonden dat deze methoden ook toegepast op een verscheidenheid van verschillende celtypes 13,17,18. Verder kunnen deze procedures op verschillende manieren kleuring optimaliseren voor specifieke doelen worden gewijzigd.
We vinden een parameter die een direct effect op een correcte IF heeft, is de keuze van de fixatie. We hebben het gebruik van 4% PFA / PBS voor fixatie voorgeschreven in de procedures, maar alternatieve fixatieven zijn ook van toepassing. Bevestiging met koude methanol (-20 ° C) gedurende 20 minuten na wassen met PBS is voor bepaalde eiwitten / 13 antilichamen. Gebruik van koude methanol fixatie ontkent de noodzaak cellen permeabilize. De keuze van fixeermiddel (4% PFA / PBS of koude methanol) worden empirisch bepaald. De hierboven beschreven procedures beschrijven visualisatie van een enkel eiwit; Maar deze methode is gemakkelijk aan identificatie van een aanvullend doel 13. Voor een optimale IF van twee eiwitten, primaire antilichamen gerezen in twee verschillende soorten (bv., een verhoogde bij konijnen en een in de muis), en secundaire antilichamen specifiek herkent elke soort, gekoppeld aan verschillende fluoroforen, zijn noodzakelijk. Secundaire antilichamen gekoppeld met groene en rode fluoroforen, gecombineerd met DAPI een uitstekende contrast tussen doelen, naast algemeen interferentie te voorkomen van meerdere fluoroforen. Voor IF twee doelen in BE cellen, voeren sequentiële incubatie van twee primaire en hun respectieve secundaire antilichamen na fixatie. Stappen voor het wassen en montage van dia blijven hetzelfde.
Samengevat, bieden wij een eenvoudige en handige protocol voor IF van BE cellen. Toepassing van deze procedures kunnen informat opleverenion over de effecten van behandeling met geneesmiddelen, de invoering van een buitenbaarmoederlijke genen van belang, of RNAi downregulatie van genen van belang in BE cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de St, Stichting Joseph's (AJF, LJI) en American Lung Association, RG-224607-N (LJI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
- Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
- Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
- Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
- Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
- Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461 (2011).
- Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
- Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
- Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
- Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
- Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
- Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
- Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
- Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
- Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).
