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Artículo de método

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

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DOI:

10.3791/51964

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16 de febrero de 2015

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

En este artículo

Resumen

El término anástasis se refiere al fenómeno en el que las células moribundas revierten un proceso de suicidio celular en una etapa tardía, se reparan a sí mismas y, finalmente, sobreviven. Aquí demostramos protocolos para detectar y rastrear células que se someten a anastasis.

Resumen

Anastasis (del griego, "el aumento de la vida") se refiere a la recuperación de las células que mueren. Antes de que estas células se recuperan, que han pasado a través de los puntos de control importantes de la apoptosis, incluyendo la fragmentación mitocondrial, la liberación de citocromo c mitocondrial en el citosol, la activación de las caspasas, condensación de la cromatina, el daño del ADN, fragmentación nuclear, formación de ampollas en la membrana plasmática, el encogimiento celular, la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina, y la formación de cuerpos apoptóticos. Anastasis puede ocurrir cuando los estímulos apoptóticos se eliminan antes de la muerte, permitiendo así que las células que mueren para revertir la apoptosis y potencialmente otros mecanismos de muerte. Por lo tanto, anastasis parece implicar procesos de curación fisiológicos que también podrían sostener las células dañadas de manera inapropiada. Las funciones y mecanismos de anastasis aún no están claros, obstaculizada en parte por las limitadas herramientas para la detección de eventos pasados ​​después de la recuperación de las células aparentemente sanas. Estrategias para detectar anastasis permitirá a los estudios de los mecanismos fisiológicos, los peligros de las células no-muertos en patología de la enfermedad y posibles terapias para modular anastasis. A continuación, describimos las estrategias eficaces usando microscopia de células vivas y un biosensor caspasa mamífero para identificar y rastrear anastasis en células de mamíferos.

Introducción

La apoptosis (del griego, "caer a la muerte") en general se supone que ser un proceso unidireccional que termina en suicidio celular 1-7. Alteración genética de genes pro-muerte como resultado la supervivencia de las células adicionales que de otro modo morirían en animales enteros, incluyendo las células que ya han iniciado el 8,9 vía de la apoptosis. Del mismo modo, las manipulaciones genéticas permiten que las células de mamíferos sanos que artificialmente Display "Cómeme" señales o que pierden la adherencia a su matriz extracelular para escapar de la muerte por la fagocitosis de células enteras o entosis, respectivamente 10,11. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado que sin manipulación genética de células de mamíferos sanos normales y líneas celulares también pueden recuperarse de las primeras etapas de la apoptosis 12-15. El uso de herramientas para rastrear células individuales, hemos demostrado aún más la recuperación de las últimas etapas de la apoptosis 12,13, después de las células han pasado los puntos de control importantes que típicoly marcar el "punto de no retorno" 2-6. Estos puntos de control de la apoptosis etapa tardía incluyen liberación mitocondrial de citocromo c, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, y formación de cuerpos apoptóticos. Adoptamos una palabra compuesta griega "Anastasis", que significa "resurrección a la vida", para describir esta inversión de la apoptosis en el borde de la muerte celular 2-6.

A menos que todo el proceso de recuperación de morir es observado por imágenes de células vivas, es difícil distinguir las células que han sido objeto anastasis a partir de células que nunca experimentaron eventos apoptóticos. Décadas de trabajo han puesto de manifiesto que las características morfológicas de suicidio celular por apoptosis son impulsados ​​por eventos bioquímicos y moleculares conservadas evolutivamente 16-19. Estos eventos promueven la auto-destrucción de las células para regular los procesos de desarrollo y homeostáticos en organismos unicelulares y pluricelulares mediante la eliminación de daños o dcélulas angerous 16-19. Mientras que las células apoptóticas pueden distinguirse fácilmente por manifestaciones morfológicas, bioquímicas y moleculares estandarizados de apoptosis 1,5,6,16,20, actualmente no se conoce ningún marcador específico para anastasis 12,13. Es importante destacar que las células que han sido objeto anastasis parecen ser las células sanas normales y células que sólo empiezan revertir apoptosis aparecer células que mueren como apoptosis 12,13. Por lo tanto, se necesitan nuevas herramientas para concluir con certeza que una célula sobrevive dado había experimentado previamente procesos apoptóticos activos.

La apoptosis se asume generalmente como una cascada irreversible porque es un proceso de destrucción rápida y masiva. Si bien se podría tardar minutos en días de algunas células para iniciar la apoptosis, una vez que las mitocondrias han lanzado factores apoptogénicos como citocromo c al citosol 21,22, caspasas pueden ser activados en 5 minutos 23,24, seguidos por citoplasmática ycondensación nuclear dentro de 10 min 25-27, y la muerte celular poco después 25-27. Las caspasas activadas orquestan la apoptosis mediante la escisión e inactivación de componentes estructurales y funcionales clave para el propósito de demolición celular 2,28, tales como el inhibidor de la endonucleasa de DFF45 / ICAD 29,30. Las caspasas también activan factores pro-apoptóticos, tales como BID miembro de familia Bcl-2, que se transloca a la mitocondria para promover la liberación de citocromo C 31,32. Actividad caspasa también da lugar a la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina como "comerme" señal para la promoción de inmersión de las células que mueren por los macrófagos o células vecinas a través de la fagocitosis 33. Además, eventos apoptóticos hacen mitocondrias disfuncionales, lo que altera la bioenergética celular y el metabolismo 34,35,36. Por lo tanto, la recuperación de dicha destrucción parece intuitivamente improbable.

Contrariamente a la original esperarciones, las células pueden revertir el proceso de muerte celular apoptótica incluso en una etapa tardía. Al monitorear continuamente el destino de morir las células en cultivo, se observó la reversibilidad de la apoptosis etapa tardía en una gama de células primarias y líneas celulares 12,13. La eliminación del estímulo muerte permitió la recuperación de las características evidentes de la apoptosis, tales como la fragmentación mitocondrial, condensación de la cromatina, el daño del ADN, formación de ampollas en la membrana plasmática, la exposición de la superficie celular de la fosfatidilserina, la liberación de citocromo c mitocondrial, la activación de caspasas, la fragmentación nuclear, contracción celular, y formación de cuerpos apoptóticos. Estas observaciones plantean preguntas sin respuesta sobre las funciones, las consecuencias y los mecanismos de anastasis. Para abordar estas cuestiones, es un requisito previo para identificar de forma fiable las células que han sido objeto anastasis. A continuación, describimos los métodos de microscopía en vivo y un biosensor para la detección de caspasa células que han invertido previamente apoptosis etapa tardía y XXen sobrevivió.

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Protocolo

1. Preparación de células de imágenes de células vivas

  1. Para facilitar la detección de cambios morfológicos, elija células adherentes tales como las células que son planas sobre el sustrato para visualizar mejor la alteración de la membrana plasmática y orgánulos intracelulares HeLa (carcinoma cervical humano).
    Nota: Inversión de la apoptosis se ha observado en diversas células de mamíferos 12,13, incluyendo las células de hígado de ratón primario, macrófagos primarios de ratón, cardiomiocitos primarios de rata, y también líneas celulares tales como células HEK-293T de riñón humano embrionario, de mono verde africano COS epiteliales renales -7 células, las células del músculo cardiaco ratón HL-1, fibroblastos de ratón NIH 3T3, hurón (Mustela furo) putoris células CRL1656 cerebro, las células A375 de cáncer de piel, células del cáncer testicular CRL1973 humanos, pequeñas células H446 de carcinoma de pulmón de células humanas, el cáncer de hígado humano células HepG2, células MCF7 cáncer de mama humano, células PC3 de cáncer de próstata humanos, y células SH-SY5Y de neuroblastoma humano.
  2. Pre-lavado cubreobjetos de vidrio de cristal placas de cultivo celular de fondo con etanol absoluto para la limpieza y esterilización.
    Nota 1: El uso de platos con fondo de cristal se recomienda para el contraste de interferencia diferencial de alta calidad (DIC) de microscopía y alta magnificación confocal o microscopía de epifluorescencia (ver Discusión).
    Nota 2: Para los grandes aumentos (40X, 60 / 63X o 100X objetivos y altas aperturas numéricas 1.3 o 1.4), el uso de placas de cultivo celular con fondo de cristal más delgado (grosor de 0,085 a 0,16 mm) ofrece grandes distancias para obtener imágenes de Trabajo (véase el Protocolo nº 3 ).
  3. Dependiendo del tipo de células, placas de cultivo de vidrio de fondo pueden requerir recubrimiento con poli-D-lisina (0,1 mg / ml), colágeno (solución 0,01% en ácido acético 0,01 M) y / o fibronectina (5 g / ml) antes de la siembra las células.
    Nota: Se requiere Optimización del tipo y concentración de agente de revestimiento para diferentes líneas celulares. Células HeLa pueden adherirse directamente sobre el vidrio sin recubrimiento. Sin embargo, algunas células, SUch como células de ratón del músculo cardiaco HL-1, no puede adherirse directamente a las superficies de vidrio, pero requieren protocolos de cultivo y revestimiento específicos 37.
  4. Seed ~ 2-3 x 10 5 células en 35 mm de vidrio pre-recubierto celda inferior placas de cultivo y se incuba a 37 grados Celsius (° C) con 5% de CO 2 durante un día para alcanzar 80% de confluencia.
    Nota 1: Las condiciones óptimas de la densidad celular, tiempo de incubación, y condiciones de cultivo pueden variar, dependiendo del tipo de célula. Confluencia de la célula puede afectar la respuesta de apoptosis de las células (Ver Protocolo 2). A alta confluencia, las células podrían ser menos sensibles a las mismas concentraciones de los estímulos apoptóticos.
    Nota 2: Evitar el exceso de células confluentes, como una alta densidad celular puede oscurecer los cambios morfológicos de las células individuales y sus orgánulos.

2. Aplicación y eliminación de la célula apoptótica Estímulos

  1. Poco antes de su uso, pre-mezclar el agente inductor de apoptosis con 37 ° C medio de cultivo celular. El etanol (03/06 a 04/05% Vol / vol) sirvió como inductor de la apoptosis en el presente manifestación.
    Nota 1: Nuestros datos publicados y no publicados demuestran que las células también pueden revertir la apoptosis que se desencadena por otro apoptóticos estímulos 12,13, tal como dimetilsulfóxido (DMSO, 8% vol / vol durante 24 horas), estaurosporina (STS, 0,5 M durante 1 hr), y taxol (1 mM durante 12 horas). Se requiere Optimización de la dosis de la apoptosis de disparo para diferentes tipos de células para lograr la dosis mínima que puede desencadenar la mayoría de las células en la población a someterse a apoptosis.
    Nota 2: Pre-mezcla de agentes inductores de la apoptosis con medio de cultivo celular es importante para evitar la exposición desigual de las células a los estímulos de apoptosis.
  2. Image un grupo de células de salud en la placa de cultivo celular antes de aplicar el agente inductor de apoptosis para establecer morfologías de línea de base.
  3. Retire el medio original de la placa de cultivo celular, y luego aplicar 2 ml de agente inductor de apoptosis premezclada al plato aactivar las células para sufrir apoptosis. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO 2 (u otras condiciones de cultivo normales).
  4. Después de la incubación, observar las células por la luz, epi-fluorescencia o microscopía confocal para monitorizar la progresión de características apoptóticas.
    Nota 1: Las células que sufren apoptosis se mostrarán características morfológicas, bioquímicas y moleculares de la apoptosis que puede ser detectado por microscopía y biosensores basados ​​en fluorescencia (véase Protocolos 3 y 4).
    Nota 2: El tiempo de incubación de las células con diferentes inductores de apoptosis variará, dependiendo del tipo de célula, las condiciones celulares (tales como la confluencia y el estado de nutrientes), y la dosis de estímulo aplicado la muerte. Titulación cuidadosa puede ser requerida.
  5. Cuando las células exhiben características de apoptosis, eliminar el agente inductor de apoptosis por lavado de las células una vez con agua caliente (37 ° C, o de otro temperatura de cultivo normal) medio de cultivo celular fresco.
    Nota 1: Como las células apoptóticas están más vagamente unidos enla placa de cultivo, es importante aplicar y quitar medio con cuidado para que las células no serán arrastrados.
    Nota 2: suspendido en vivo las células se pueden recuperar del sobrenadante por centrifugación suave (160 xg durante 1 min) y se añadieron de nuevo a la placa de cultivo.
  6. Se incuban las células a 37 ° C con 2 ml / placa de 35 mm de medio de cultivo celular fresco en 5% de CO 2. Alternativamente, el uso de medio acondicionado (medio de cultivo libre de células obtenida de las células sanas) para mejorar aún más la supervivencia de las células apoptóticas.
    Nota: Lavado y incubando las células con medio fresco permiten la mayoría de las células para revertir la apoptosis inducida por etanol después de la exposición de etanol 12,13. Sin embargo, la repetición de este paso de lavado puede ser necesaria cuando las células se exponen a otros estímulos apoptóticos (véase la discusión).

3. microscopia de células vivas

  1. Le recomendamos que utilice un confocal o epi-fluorescencia microscopio invertido con el control ambiental (37 ° C,5% de CO 2) para microscopia células vivas.
    Nota: También es posible que la imagen de las células por medio de microscopios verticales con un objetivo de inmersión en agua. Sumergir el objetivo directamente en el medio de cultivo para células de imagen. Sin embargo, las células pueden ser aplastados por el objetivo de inmersión durante el enfoque.
  2. Pre-calentar el microscopio (como cámara ambiental de control, etapa incubadora, y el calentador objetivo) al menos 2 h antes de formación de imágenes.
    Nota: Esto permite que los componentes del microscopio para llegar a la termo-equilibrio, de modo que pueda evitar la deriva del enfoque y el desplazamiento del plano xy debido a la expansión y contracción térmica de los componentes.
  3. Coloque un plato de vidrio 35 mm parte inferior de las células cultivadas (Véase el Protocolo 1) en la etapa de un microscopio invertido y capturar imágenes de células usando un objetivo 40X o 63X plan de Apocromático con una apertura numérica (NA) 1.3 o 1.4 para obtener imágenes de células de la fondo de la placa a través de cubreobjetos de vidrio.
    Nota: Evite aplicar más de 2 ml de medioa 35 mm plato de fondo de vidrio, ya que el peso del medio podría causar curvatura de la parte inferior de vidrio, lo que hace difícil una imagen de campo de las células en el mismo plano focal.
  4. Mantener las células a 37 ° C o la temperatura normal correspondiente durante todo el proceso de formación de imágenes.
    Nota: El proceso de apoptosis, y es probable que la reversión de la apoptosis, depende de la temperatura actividades enzimáticas sensibles. Por lo tanto, el mantenimiento de las células a 37 ° C (por ejemplo, con una platina del microscopio superior incubadora) es importante en todo el experimento. Disminución de la temperatura podría ralentizar la respuesta apoptótica y la respuesta de recuperación después de la eliminación del estímulo apoptótico.
  5. Utilice un dispositivo de humedad o colocar una lámina transparente (ver Materiales) en la placa de cultivo para reducir la pérdida de agua por evaporación del medio.
    Nota: el papel de aluminio podría interrumpir la polaridad de la luz para la microscopía DIC. Restaurar la polaridad ajustando el polarizador en la trayectoria de la luz.
  6. Mantenga el pH en elmedio de cultivo celular (pH 6,8 -7,3) mediante la incubación en 5% de CO 2 con una cámara de control ambiental en el microscopio.
    NOTA: El mantenimiento del pH en el medio de cultivo se puede lograr también mediante la adición de tampón HEPES, o mediante el uso de CO 2 medio -independiente comercial (ver Materiales). Las condiciones óptimas pueden variar, dependiendo del tipo de célula.
  7. Minimizar fluorescencia / láser (intensidad de la luz de excitación) la exposición a las células durante el proceso de formación de imágenes para evitar fototoxicidad mediante la reducción de la intensidad de fluorescencia a la más baja necesaria para obtener imágenes de alta calidad de las células / estructuras subcelulares o biosensores expresadas (Detalles en el Protocolo nº 4).

4. Estrategias para detectar y rastrear Anastasis durante y después apoptóticas Eventos

  1. Plasma formación de ampollas en la membrana, la condensación citoplasmática, la contracción celular y formación de cuerpos apoptóticos (Véanse las Figuras 1A - C, E).
    1. Realizar time-lapse dife células vivascontraste dife- interferencia (DIC) o microscopía de contraste de fases para el seguimiento de un grupo de células de la salud y para observar su morfología celular (Véase el Protocolo 3 para microscopia de células vivas, y ver Discusión).
      Nota 1: Reducir la intensidad de la fuente de luz para imágenes contrato DIC / fase para evitar fototoxicidad a las células.
      Nota 2: Si DIC y microscopía de contraste de fases no están disponibles, CellTracker utilizar para teñir el citosol para delinear la morfología de células vivas para la microscopía confocal o epi-fluorescencia y controlar la morfología de las células.
    2. Aplicar estímulo muerte celular para activar las células para experimentar apoptosis (Véase el Protocolo 2 para la aplicación y retirada de los estímulos apoptóticos).
    3. Observe células tratadas durante características morfológicas de la apoptosis, tales como formación de ampollas en la membrana plasmática, la condensación citoplasmática, la contracción celular y formación de cuerpos apoptóticos (Figuras 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Lavar los estímulos de muerte, y las células de reabastecimiento con medio fresco cuando las células displacaracterísticas morfológicas Y de apoptosis.
      Nota 1: Aplicar estímulo muerte celular o cambiando el medio de cultivo celular en la platina del microscopio durante el lapso de tiempo imágenes de células vivas se puede lograr mediante el uso de una cámara de cultivo celular de perfusión, o se puede realizar directamente en la placa de cultivo celular pipeteando cuidadosamente sin tocar el plato, durante los intervalos entre imágenes.
      Nota 2: Los sistemas de compensación de deriva Utilice el enfoque para evitar fuera de foco de las células debido a la pérdida de termo-equilibrio del sistema de microscopio después de cambiar el medio de cultivo celular (véase la discusión).
    5. Time-lapse continua para seguir el destino de las células que muestran características de la apoptosis. Las células que revierten la apoptosis pueden reparar el daño y recuperar normal de la morfología plana (Figuras 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Fragmentación mitocondrial, ADN / condensación de la cromatina, y la fragmentación nuclear (Ver Figuras 1D, 1F, 1G).
    1. Para visualizar mitochondria, las células de la mancha con 50 nM MitoTracker profunda colorante rojo / rojo / verde fluorescente, y simultáneamente se tiñen el núcleo con 10 mg / ml de Hoechst 33342 tinte nuclear azul en medio de cultivo durante 20 min a 37 ° C con 5% de CO 2.
      Nota 1: Reducir la concentración de colorantes y duración de la incubación para evitar la citotoxicidad y reducir la fluorescencia de fondo cuando la necesidad. Optimizar las condiciones de tinción para obtener una buena relación señal a ruido con la cantidad mínima de colorante y el tiempo de incubación para la tinción.
      Nota 2: Utilice las manchas fluorescentes para las mitocondrias como MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, o MitoTracker Verde FM, que no se salga de la mitocondria durante la apoptosis. Esto permite la visualización de la morfología mitocondrial durante la apoptosis y anastasis. Ver los materiales y equipos de la tabla para obtener más detalles acerca de estas manchas.
    2. Mantenga las células teñidas en la oscuridad para evitar photobleaching.
    3. Retire el exceso de manchas por lavado de las células3 veces con 37 ° C de solución salina tamponada con fosfato (PBS) solución o medio de cultivo celular fresco, con 1 min de incubación en el medio fresco entre cada lavado, y luego se incuban adicionalmente en el medio fresco durante 20 min antes de que el lavado final para permitir excesiva manchas para salir de las células para reducir la señal de fondo no específico para formación de imágenes.
      Nota: Acortar los tiempos de incubación con medio de células después de la tinción puede resultar en alto fondo para la imagen.
    4. Realizar en tiempo real confocal de células vivas o microscopía de epifluorescencia a las células sanas de imagen antes de aplicar la inducción de apoptosis (Ver Protocolo 3 para microscopia de células vivas).
      Nota: Las células sanas muestran mitocondrias tubulares y núcleos redondos en la mayoría de tipos de células (Figuras 1D, 1F, 1G).
    5. Dispare células a sufrir apoptosis (Ver Protocolo 2 de aplicación y retirada de los estímulos de apoptosis en las células).
    6. Continuar time-lapse microscopía de células vivas para observar alteraciones en morpholog mitocondrial y nucleardel IES inmediatamente después del estímulo de muerte se aplica a las células. Observar las células para visualizar características de la apoptosis como la fragmentación mitocondrial y la hinchazón, condensación de la cromatina y fragmentación nuclear, en contraste con las células sanas que muestran las mitocondrias y núcleos tubulares redondos.
    7. Cuando las células muestran señas de identidad de la apoptosis, lavar y suministrar células con medio fresco, y continuar time-lapse de rastrear el destino de las células. Las células que revierten apoptosis mitocondrial normal y recuperar la morfología nuclear (Figuras 1D, 1F, 1G).
      Nota: Realice la microscopía DIC en paralelo cuando posible obtener información adicional para el acceso a las etapas de la apoptosis mediante la observación de las alteraciones de la morfología celular en el mismo grupo de células (Ver 4.1 Protocolo para la microscopía DIC).
  3. La detección de la liberación de citocromo C utilizando células que expresan establemente un GFP pr fusión citocromo cOtein (Ver Figura 2).
    1. Las células que expresan establemente Stain citocromo c-GFP 23,24 con MitoTracker Red para etiquetar las mitocondrias celulares polarizadas (Ver Pasos 4.2.1 a 4.2.3 para la tinción en vivo mitocondria de la célula).
    2. Realizar en tiempo real confocal de células vivas o epi-fluorescencia microscopía para rastrear las células sanas (Detalles en el Protocolo nº 3 de imágenes de células vivas).
      Nota: La señal de GFP citocromo c se localiza principalmente en la mitocondria de las células sanas (Figuras 2A i, 2B).
    3. Dispare células a sufrir apoptosis (Ver Protocolo 2 de aplicación y retirada de los estímulos de apoptosis en las células). Continuar microscopía de lapso de tiempo para observar la translocación de citocromo c-GFP de la mitocondria al citosol (Figuras 2AII-iii, 2B).
      Nota: liberación mitocondrial de citocromo c en el citosol es un marcador de permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOMP)4, un paso crítico en la mitocondria dependiente de la apoptosis 21,22
    4. Cuando las células muestran la señal GFP citocromo c en el citoplasma, eliminar el estímulo muerte celular, y las células de suministro con medio fresco (véase el Protocolo 2). Continuar time-lapse de rastrear el destino de las células con las buenas prácticas agrarias citosólica.
      Nota: las que revierten apoptosis recuperar la morfología normal de las células, y reducir su señal GFP citocromo c citosólico presumiblemente a través de la degradación o la translocación de nuevo a las mitocondrias (Figuras 2Aiv-vii, 2B).
    5. Captura de imágenes DIC en paralelo para obtener información adicional para el acceso a las etapas de la apoptosis mediante la observación de alteraciones en la morfología celular en las células individuales o grupos de células (Ver 4.1 Protocolo para la microscopía DIC).
  4. Detección de la actividad caspasa usando un biosensor caspasa (Ver Figura 3)
    1. Transfectar células con el biosensor caspasa NES-DEVD-YFP-NLS para16 a 24 horas antes de someterlas a un estímulo apoptótico 13.
    2. Teñir los cultivos transfectados con Hoechst 33342 para etiquetar los núcleos celulares (Ver Pasos 4.2.1 a 4.2.3 para la tinción nuclear de células vivas).
    3. Realizar en tiempo real confocal de células vivas o epi-fluorescencia microscopía para rastrear las células sanas (Detalles en el Protocolo nº 3 de imágenes de células vivas).
      Nota: La señal biosensor NES-DEVD-YFP-NLS localiza principalmente en el citosol de las células sanas debido a su señal de exportación nuclear (NES) (Figuras 3A, 3Bi y 3C, ver Discusión).
    4. Dispare células a sufrir apoptosis (Ver Protocolo 2 de aplicación y retirada de los estímulos de apoptosis en las células). Continuar microscopía de lapso de tiempo para observar la translocación nuclear de YFP.
      Nota: La activación de las caspasas escinde el motivo DEVD en el biosensor caspasa NES-DEVD-YFP-NLS, resultando en YFP-NLS translocación desde el citosol al núcleo (Figuras 3A, 3Bii-iv, véase la discusión).
    5. Cuando las células muestran YFP nuclear, quito el estímulo apoptótico, y las células de suministro con un nuevo medio (véase el Protocolo 2).
      Nota: Las células que revierten apoptosis recuperar la morfología celular normal, pero retienen la señal de YFP nuclear (Figuras 3Bv-x, las células 1 y 2, y 3D).
    6. Continuar time-lapse de rastrear el destino de las células que muestran YFP nuclear.
      Nota: La señal de YFP nuclear se convertirá degradadas varias horas después de que las células han revertido la apoptosis (Figuras 3B, vi-x, la Celda 1, Ver Resultados y Discusión) presumiblemente a través de los mecanismos normales de remoción de células, como la degradación del proteasoma.
    7. Captura de imágenes DIC en paralelo para obtener información adicional para el acceso a las etapas de la apoptosis mediante la observación de alteraciones en la morfología celular en las células individuales o un grupo de células. (Ver 4.1 Protocolo para la microscopía DIC).
  5. Exposición de la superficie de la célula de fosfatidilserina (Ver Figura 4)
    1. Sembrar las células en glculo cubreobjetos para lograr una confluencia celular del 80% (Véase el Protocolo 1).
    2. Co-mancha las células con MitoTracker-rojo fluorescente y azul Hoechst 33342 tinción de las mitocondrias y núcleos, respectivamente (Ver Pasos 4.2.1 a 4.2.3 para mitocondrial de células vivas y tinción nuclear).
    3. Dispare células a la apoptosis mediante el uso de un inductor de apoptosis (Ver Protocolo 2).
    4. Aplicar marcado fluorescente anexina V (ver Materiales) para teñir las células apoptóticas 10 min a 37 ° C antes de la extracción del inductor de la apoptosis para detectar la exposición de fosfatidilserina en la superficie de las células apoptóticas.
      Nota 1: Saludable células no están teñidas con anexina V porque fosfatidilserina es normalmente secuestrado en el centro de la hoja de la membrana plasmática de la célula 38. Las células apoptóticas se tiñeron con anexina V, que se une a la fosfatidilserina en la superficie celular (Figuras 4A y 4B).
      Nota 2: marcado fluorescente anexina V también se puede aplicar para teñir las células apoptóticas immediately después de la eliminación del inductor de la apoptosis, con 10 min de incubación.
    5. Retire estímulo muerte celular, se lavan las células teñidas con PBS caliente o medio fresco una vez, y luego suministrar células con medio fresco durante 2 horas a 37 ° C con 5% de CO 2 (Ver Protocolo 2).
      Nota 1: Las células que invierte apoptosis recuperar la morfología normal y conservar la señal V anexina marcada con fluorescencia después de recuperar la morfología normal (Figuras 4A y 4B).
      Nota 2: La señal de anexina V disminuye con el tiempo en las células recuperadas (véase el debate).
    6. Fijar las células en puntos de tiempo seleccionados con 4% de paraformaldehído que contiene 8% de sacarosa en PBS 1x durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente, y lavar las células fijadas con PBS durante 3 veces para eliminar el paraformaldehído antes de las células de montaje sobre portaobjetos de vidrio cubreobjetos con medio de montaje antifade (ver Materiales) para microscopia confocal o epi-fluorescencia y observar la anexina V en las células después de la eliminación del inductor de la apoptosis.
      Nota 1: Sacarosa en fijador conserva estructura de la membrana celular durante la fijación.
      Nota 2: Guarde la solución de paraformaldehído en oscuridad a 4 ° C para evitar la degradación.
      Nota 3: Calentar una solución de paraformaldehído a temperatura ambiente antes de aplicar a las células para la fijación para evitar el choque en frío a las células.

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Resultados

Para estudiar la reversión de la apoptosis, las células de cultivo de tejidos se expusieron primero a un estímulo muerte para activar la apoptosis. Cuando las células exhiben características de apoptosis, medio de cultivo fresco se aplica entonces para lavar el estímulo y luego se incuban las células que mueren para permitir la recuperación (Figura 1A). Aquí, la cuestión clave está abordando es hasta qué punto las células cultivadas que mueren individuales pueden progresar hacia la apoptosis y todavía s...

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Discusión

Anastasis se refiere al fenómeno por el cual las células que han de células activadas por vía de la muerte posteriormente revertir el proceso de muerte y sobrevivir. Aquí, hemos demostrado que imágenes de células vivas se puede utilizar para confirmar que las mismas células individuales, de hecho, pueden revertir proceso de muerte celular apoptótica en una etapa tardía, y luego continuar sobrevivir y reproducirse. Nuestros protocolos describen varias condiciones de tratamiento específicas del tipo de células optimizado ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann y el Rev. Dr. James Voelz por sugerir la palabra "Anastasis" para describir la reversión de la apoptosis; Douglas R. Green para las células HeLa que expresan de forma estable el citocromo c-GFP; Charles M. Rudin y Eric E. Gardner para H446 células; Heather Cordero para la asistencia en el dibujo de la historieta en el video; Yee Hui Yeo valioso para el debate de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la Beca Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), beca Fulbright 007-2009 (HLT), Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida de becas (HLT), NIH subvenciones NS037402 (JMH) y NS083373 (JMH), y el Comité de Becas de la Universidad de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang es una Fundación Shurl y Kay Curci Fellow de la Fundación de Investigación de Ciencias de la Vida.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopía confocal LSM780Carl Zeiss Placa de
vidrioMatTek CorporationP35G-0-14-C
CultFoi transparenteCarl Zeiss000000-1116-084
CO2 medio independienteLife Technologies18045-088
CellTrackerLife TechnologiesC34552
Mitotracker Red CMXRosLife TechnologiesM-7512
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399
Anexina V marcada con fluorescenciaBiovisionK201
cultivo con fondo de

Referencias

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