La resección ileocólica se realiza comúnmente en varias enfermedades humanas; sin embargo, se sabe poco sobre el impacto de la resección intestinal en las enfermedades quirúrgicas. Este artículo proporciona instrucciones sobre la ejecución del procedimiento en ratones con alto éxito, proporcionando un medio para estudiar los efectos de la resección ileocólica en modelos de enfermedad.
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Artículo de método
Murino ileocólica Resección intestinal con anastomosis primaria
En este artículo
Resumen
Resumen
Las resecciones intestinales son frecuentemente necesarias para el tratamiento de enfermedades que involucran el tracto gastrointestinal, siendo la enfermedad de Crohn y el cáncer de colon dos ejemplos comunes. A pesar de la frecuencia de estos procedimientos, sigue existiendo una importante laguna de conocimiento en la descripción de los efectos inherentes de la resección intestinal sobre la fisiología del huésped y la fisiopatología de la enfermedad. Este artículo proporciona instrucciones detalladas para una resección ileocólica con anastomosis primaria de extremo a extremo en ratones, así como aspectos esenciales de la atención perioperatoria para maximizar el éxito postoperatorio. Cuando se sigue de cerca, este procedimiento produce una tasa de supervivencia a largo plazo del 95%, sin retraso en el crecimiento y minimiza las complicaciones postoperatorias de obstrucción intestinal y fuga anastomótica. Los desafíos técnicos de realizar el procedimiento en ratones son una barrera para su uso generalizado en la investigación. Las habilidades descritas en este artículo se pueden adquirir sin experiencia quirúrgica previa. Una vez dominado, el procedimiento de resección ileocólica murina proporcionará una herramienta reproducible para estudiar los efectos de la resección intestinal en modelos de enfermedad humana.
Introducción
La resección ileocólica (ICR) es un procedimiento común que se realiza tanto en situaciones emergentes como electivas para una variedad de enfermedades. La enfermedad de Crohn y el cáncer de colon son las dos indicaciones más comunes para la ICR. En ambas enfermedades, la recidiva en el intestino en el sitio de la cirugía representa un problema clínico importante. Las tasas de recurrencia local del cáncer de colon siguen siendo un problema, incluso con las resecciones más agresivas1. Después de la RCI en la enfermedad de Crohn, la enfermedad más frecuente (hasta en el 80%) recurre en el íleon neoterminal 1 año después de la cirugía2. Dado el impacto de estas dos enfermedades y su recurrencia después de la cirugía, es importante comprender los factores intestinales locales después de la RCI, que pueden tener influencias intrínsecas en la historia natural de estas enfermedades. Además, también es importante tener en cuenta la cicatrización anastomótica después de la RCI. En el postoperatorio temprano, las fugas anastomóticas pueden tener consecuencias devastadoras para los pacientes, lo que resulta en cirugías repetidas, creación de estomas, morbilidad significativa e incluso mortalidad3. A pesar de la importancia de este tema, nuestra comprensión actual de la curación anastomótica permanece en pañales como tema de investigación. Los modelos animales de ICR, en particular los ratones, son una excelente plataforma para estudiar la cicatrización intestinal y anastomótica después de la cirugía.
Helmrath et al. desarrollaron inicialmente un modelo de ratón de ICR para ser utilizado como modelo del síndrome del intestino corto4. Los autores experimentaron con varios regímenes de dieta y tamaños de sutura para optimizar la supervivencia de los animales después de la RCI. Concluyeron que la alimentación con dieta líquida en el período perioperatorio y el uso de suturas monofilamento 9-0 resultó en una supervivencia postoperatoria óptima del 88%. Desde esta publicación inicial, la RCI en ratones que extrae el 50% del intestino delgado se ha utilizado en varios estudios para explorar la dinámica de la resección masiva del intestino delgado y la respuesta de crecimiento adaptativa en un intento de desarrollar nuevas terapias para el síndrome del intestino corto5,6.
La primera aplicación del modelo de ratón ICR a la enfermedad de Crohn utilizó el modelo de ratón IL-10-/-, que desarrolla colitis de forma espontánea7. Los autores encontraron que después de la ICR, estos animales desarrollaron una inflamación en el íleon neoterminal similar a la observada en los pacientes con enfermedad de Crohn postoperatoria, y que esta inflamación dependía de la presencia de bacterias7. Más recientemente, este modelo se utilizó para explorar los cambios bacterianos inducidos por la ICR. En la enfermedad de Crohn existe una disbiosis asociada con disminuciones relativas de bacterias conocidas por sus propiedades antiinflamatorias y aumentos de especies invasoras de bacterias8,9. La asociación se mantiene en los casos de recidiva postoperatoria10. Dos estudios trataron de identificar los cambios microbianos resultantes de la RCI. El primero utilizó ratones IL-10 nulos y realizó electroforesis en gel desnaturalizante para comparar la similitud bacteriana entre el intestino delgado y el colon después de la ICR11. Este estudio demostró que las poblaciones bacterianas se volvieron similares en el intestino delgado y el colon después de la ICR. Un estudio posterior utilizó ratones de tipo salvaje y pirosecuenciación 16s para la clasificación filogenética de las especies bacterianas después de la operación. Este estudio demostró un marcado cambio en las especies bacterianas como resultado de la cirugía sola, con las especies de Clostridium convirtiéndose en dominantes, así como un aumento en las Υ-proteobacterias. Los resultados también confirmaron los hallazgos del estudio previo con poblaciones similares encontradas en el intestino delgado y el colon después de la ICR12.
ICR es un procedimiento común para pacientes con cáncer de colon que involucra el ciego y el colon ascendente, y cada vez se reconoce más que la respuesta del huésped a la cirugía probablemente contribuya a la recurrencia tumoral tanto local como a distancia13. A pesar de esta observación, los modelos de RCI no se han utilizado para el estudio del cáncer colorrectal y la recurrencia postoperatoria. La comprensión de los cambios inmunológicos sistémicos y locales resultantes de la ICR será importante para investigar futuras terapias. Las posibles vías implicadas en la recurrencia del cáncer después de la ICR incluyen la regulación positiva de los factores de crecimiento, que pueden rescatar a las células de la apoptosis y estimular la proliferación, la disrupción mecánica del tumor con desprendimiento celular y la pérdida de la vigilancia inmunitaria a través de la inmunosupresión postoperatoria13,14.
Los modelos de ratón de ICR tienen el potencial de ser una poderosa herramienta para la investigación del síndrome del intestino corto, la enfermedad de Crohn y el cáncer de colon. También pueden proporcionar lecciones sobre cómo prevenir las complicaciones anastomóticas postoperatorias tempranas mediante una definición más detallada de las vías celulares y bioquímicas involucradas en la curación de la anastomosis recién construida. Un obstáculo importante en la utilización del modelo murino de ICR es la dificultad técnica. La anastomosis intestinal requiere el uso de 8-0 o sutura 9-0, un microscopio quirúrgico y capacitación en técnicas microquirúrgicas. El objetivo de este artículo es proporcionar instrucciones claras sobre cómo realizar la ICR en ratones con el objetivo de utilizar este procedimiento en modelos de enfermedad.
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Protocolo
Protocolos de uso de los animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Ciencias de la Salud de la Universidad de Alberta.
1. Preparación de Instrumentos, Animales y Configuración Operativo
- Transferencia de los animales a una nueva, ausente jaula limpia de todos los alimentos sólidos 24 h antes del procedimiento. Ellos pueden tener libre acceso al agua, y el líquido dieta ad libitum hasta el momento del procedimiento.
- Autoclave todos los instrumentos necesarios para el procedimiento. Superficie de operación Limpie y cono de la nariz anestesia con etanol al 70%.
- Configurar la superficie de funcionamiento con el microscopio operativo, máquina de anestesia y materiales de construcción de una manera que sea cómoda para el cirujano. Los codos del cirujano se debe permitir que descansar cómodamente en la mesa de operaciones, con las manos y los brazos sin obstáculos por equipos. Instrumentos, suturas, hisopos de algodón, y una jeringa de 10 ml se deben colocar en un lugar que permite un fácil acceso durante el procedimiento.
- Prepararlámparas de calor de arriba para proporcionar tanto calor para el animal durante el procedimiento y de la luz para la superficie de funcionamiento.
- Llenar un tubo cónico de 50 ml con 0.9% de solución salina, y un tubo de 1,5 ml con vaselina y el lugar cerca de la superficie de funcionamiento.
NOTA: Esterilizar todos los instrumentos y suministros quirúrgicos. Debido a que el intestino se secciona, el procedimiento en sí no es estéril. Se considera limpia-contaminada. Tome medidas para evitar la introducción de fuentes exógenas de la infección.
2. La resección ileocólica con anastomosis
- Inducir la anestesia mediante la administración de 4% de isoflurano con una tasa de flujo de oxígeno de 2 L / min a través de cono de la nariz desde el vaporizador de isoflurano hasta que la tasa respiratoria animales se desacelera a aproximadamente 30-40 respiraciones / min. Aplique una presión moderada a la pata trasera del ratón para asegurar que no haya respuesta de dolor antes de iniciar el procedimiento. En este punto, baje isoflurano al 2% y el flujo de oxígeno a 0,5 L / min. De forma intermitentecomprobar la respuesta al dolor durante el procedimiento y ajustar la velocidad de flujo de isoflurano en consecuencia.
- Aplique vaselina en los ojos para evitar que se seque durante la cirugía, e inmovilizar el ratón en la posición supina con las extremidades garantizados utilizando cinta adhesiva transparente.
- Limpie el abdomen con solución povodine / yodo, y el cambio en los nuevos guantes estériles.
- Hacer una incisión en la piel de 1,5 cm en la línea media superior del abdomen utilizando punta afilada disección tijeras para exponer la fascia y el peritoneo. Abra la capa fascial / peritoneal de una manera similar a través de la línea alba para exponer los contenidos peritoneales.
- En contraste con los seres humanos, el ciego ratón se encuentra típicamente en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Una vez identificado, agarre suavemente el ciego con fórceps y entregarlo a través de la incisión. Use hisopos de algodón humedecidos en abanico de aproximadamente 3 cm de íleon terminal que se extiende desde el ciego sobre una gasa estéril cubierto en la superficie abdominal (Figura 1A).Asegúrese de que el intestino expuesto se mantiene húmedo con 0,9% de solución salina durante la totalidad del procedimiento.
- Identificar la arteria ileocecal ramificación de la arteria mesentérica superior lo largo del colon (Figura 1A) usando el microscopio operativo. Diseccionar los tejidos avasculares adyacentes a la arteria ileocecal, rodear y se liga la arteria con un lazo de seda 5-0. A continuación, localice el suministro de sangre regional para el íleon terminal y elegir un punto transección 1,5-2 cm proximal a la unión ileocecal. Ligar las ramas a esta sección de íleon como anteriormente. Divida las arterias con micro tijeras de disección.
- Divida las porciones isquémicas del íleon y colon asegurándose de que hay suficiente suministro de sangre a los extremos seccionados (Figura 1B). A menudo es útil para espatuladas el íleon dividiéndolo en un ángulo de 30 grados para aumentar el diámetro de la luz por lo que es más compatible con el colon. Una vez que la porción ileocecal del intestino se ha eliminado, alinee elestán alineados extremos seccionados del íleon y colon en la gasa, asegurando las fronteras mesentéricas de cada uno.
- Construir la anastomosis mediante la aproximación final seccionado de íleon hasta el final seccionado de colon usando interrumpido 8-0 suturas de polipropileno (Figura 1C). El primer punto se coloca en el borde mesentérico, con suturas posteriores colocan cada 0.5 mm hasta que la anastomosis ileocólica es hermético. Al pasar la aguja de sutura a través del íleon y colon, asegúrese de que el borde de corte no se enrolla, y picaduras de agujas son de 0,5 mm de los bordes cortados del intestino. Una anastomosis típica requerirá de 14 a 16 suturas interrumpidas. Prueba de la integridad y la permeabilidad de la anastomosis al finalizar haciendo rodar una proximal a distal hisopo de algodón sobre el íleon para forzar los contenidos a través de la anastomosis. El contenido del intestino pequeños deben pasar libremente hacia el colon sin dehiscencia de la anastomosis.
- Enjuague el intestino expuesto con 3.4 ml de solución salina al 0,9% de la jeringa de 10 mlpara lavar las heces de la superficie del intestino, del intestino y entregar de nuevo en la cavidad peritoneal. El uso de 2 ml de solución salina al 0,9% a enjuagar la cavidad peritoneal, y luego drenar este líquido mediante la aplicación de presión suave en la pared abdominal lateral.
- Cierre la incisión con una sutura continua de seda 3-0, y suspender el flujo de isoflurano. Administrar 0,1 mg / kg del opiáceo de acción prolongada -buprenorphine- por vía subcutánea para el control del dolor post-operatorio.
- Observe los animales bajo la lámpara de calor hasta que son móviles a continuación, transferirlos a una jaula continuamente calentado.
3. Cuidado post-operatorio y Monitoreo
- Observar a los animales en una jaula continuamente calentado para signos de sufrimiento para el resto del día. Transfiera los animales de vuelta al centro de cuidado de los animales en una nueva jaula estéril con el acceso a la dieta líquida y agua ad lib. Los animales pueden ser alojados en grupos de 3-4.
- Lleve a cabo un control de los animales después de la operación a la mañana siguiente,aseguran que los animales no aparecen en la angustia. Alimente sólo dieta líquida. Si aparecen incómodo (es decir, postura encorvada o actividad mínima) administrar una dosis adicional de buprenorfina subcutánea. Compruebe en los animales una vez más por la tarde en el día después de la operación 1.
- En la mañana del día después de la operación 2 los animales deben aparecer totalmente recuperado. Evidencia de consumo de alimentos y las deposiciones son signos positivos de recuperación. Ahora, reanudar una dieta de pienso sólido para los animales.
NOTA: Los signos de angustia incluyen postura encorvada, la mala preparación, y la actividad mínima. Si los signos de angustia son prominentes los animales deben ser sacrificados. - La eutanasia a los animales mediante la inducción de la anestesia profunda con 4% de isoflurano a una tasa de flujo de O 2 de 2 L / min hasta que los animales no responden a la presión del pie. Realizar dislocación cervical, y observar si hay signos de eutanasia adecuado.
- Directrices varían, por lo que se refiere a las recomendaciones de las instituciones con respecto a las indicacionesy de métodos apropiados de eutanasia en ratones.
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Resultados
Las tasas de mortalidad y el cambio de peso después de la operación.
Las tasas de mortalidad siguientes ICR en 129S1 ratones de tipo salvaje son generalmente ~ 5%. La causa más común de la moral es la obstrucción intestinal en la anastomosis. Otras causas de la mortalidad incluyen fuga anastomótica y hernia interna que conduce a la obstrucción intestinal.
La pérdida de peso se puede ver hasta 14 días después de la operación, pero generalmente no es significativa. Los ratones ti...
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Discusión
El ICR murino es un modelo de gran alcance que se puede utilizar para estudiar los efectos de la cirugía en enfermedades intestinales. En este artículo se describe un método para realizar ICR en ratones con una tasa de éxito del 95% y no hay problemas con la falta de crecimiento que se refleja en los pesos estables hasta 28 días después del procedimiento. Los desafíos más importantes para el éxito de ICR incluyen evitar obstrucciones intestinales en la anastomosis y fugas anastomóticas.
Elem...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer las contribuciones financieras del Fondo Canadiense de Investigación Quirúrgica, el Fondo de Asistencia a la Investigación de los Empleados Cívicos de Edmonton y el Consorcio de EII de Alberta a través de una subvención de Alberta Innovates.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| LD101 dieta líquida para roedores | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 Inyección de solución salina de calidad | |
| Microscopio | Ziess | ||
| Isoflurano Vaporizador anestésico | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurano | Abbott | 05260-05 | |
| Placa | Para superficie de trabajo | ||
| Bastoncillos de algodón | |||
| , curvo | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo tijeras rectas | World Precision Instruments | 555530S | |
| Tijeras de disección | World Precision Instruments | 15922 | |
| Pinza de vendaje x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 suturas precortadas de seda | Ethicon | A182H | Para ligadura |
| de vasos 8-0 Prolene en aguja BV130-5 | Ethicon | 8732H | Para anastomosis |
| 3-0 Seda en punzones FS-2 | Ethicon | 8665G | Para el cierre de la pared abdominal |
| Vaselina | de vaselina | ||
| Jeringa de 10 ml | BD biosciences | ||
| Povidona yodada 7,5% Exfoliante quirúrgico | betadine.com | ||
| Lámparas de calor | |||
| 0,3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
Referencias
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
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Reimpresiones y permisos
