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Artículo de método

Modulaciones Ambientales del Número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos

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DOI:

10.3791/52329

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20 de enero de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe dos manipulaciones ambientales diferentes y un protocolo de infusión cerebral concurrente para estudiar los cambios cerebrales inducidos por el medio ambiente que subyacen al comportamiento adaptativo y la reparación cerebral en ratones adultos.

Resumen

Cambios duraderos en el cerebro o la "plasticidad cerebral" subyacen a la conducta adaptativa y la reparación cerebral después de una enfermedad o lesión. Por otra parte, las interacciones con el medio ambiente pueden inducir plasticidad cerebral. Cada vez más, la investigación está tratando de identificar qué entornos estimular la plasticidad del cerebro beneficioso para el tratamiento de trastornos del cerebro y del comportamiento. Dos manipulaciones ambientales que se describen aumentar o disminuir el número de immunopositive tirosina hidroxilasa (TH +, la enzima limitante de la velocidad en la dopamina (DA) de síntesis) neuronas en el cerebro medio del ratón adulto. El primero comprende macho emparejamiento y ratones hembra juntos de forma continua durante 1 semana, lo que aumenta TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente 12% en los hombres, pero disminuye TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente un 12% en las mujeres. El segundo comprende los ratones de vivienda de forma continua durante 2 semanas en 'ambientes enriquecidos "(EE) que contienen ruedas corriendo, juguetes, cuerdas, material de nidificación, etc., que increases TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente un 14% en los hombres. Además, un protocolo se describe para infundir simultáneamente fármacos directamente en el cerebro medio durante estas manipulaciones ambientales para ayudar a identificar los mecanismos subyacentes plasticidad cerebral inducida por el medio ambiente. Por ejemplo, EE-inducción de más TH + neuronas del cerebro medio es abolida por el bloqueo simultáneo de entrada sináptica en las neuronas del cerebro medio. En conjunto, estos datos indican que la información sobre el medio ambiente se transmite a través de la entrada sináptica de las neuronas del cerebro medio para activar o desactivar la expresión de los genes 'da'. Por lo tanto, la estimulación ambiental apropiada, o fármaco que se dirige de los mecanismos subyacentes, podría ser útil para el tratamiento de trastornos cerebrales y conductuales asociados con desequilibrios en el cerebro medio DA (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson, el déficit de atención e hiperactividad, esquizofrenia y drogadicción).

Introducción

DArgic de señalización por las neuronas en el área ventral tegmental (VTA) y substantia nigra pars compacta (SNc) del mesencéfalo se piensa que es importante para los comportamientos cognitivos, emotivos y de motor de recompensa-motivados. Sin embargo, la señalización DA mesencéfalo demasiado o demasiado poco causa muchos síntomas incapacitantes en una variedad de trastornos neurológicos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, déficit de atención e hiperactividad, esquizofrenia y drogadicción). Las drogas que aumentan o disminuyen DA señalización aliviar estos síntomas, sin embargo, también producen efectos secundarios atribuibles a la señalización desregulada y fuera de objetivo efectos. La eficacia del fármaco también disminuye con el tiempo debido a las respuestas compensatorias del cerebro. Por tanto, el reto es restaurar la señalización de DA del cerebro medio normal de manera más específica y fisiológica, y un enfoque preferido es aumentando o disminuyendo el número de neuronas DA del cerebro medio.

La evidencia ha ido acumulando para sevdécadas va- que la expresión de genes y proteínas implicados en el metabolismo y DA trata y otras catecolaminas en células adultas madura es modificable (revisado en 1). En el mesencéfalo, el número de immunopositive tirosina hidroxilasa (TH +, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de las neuronas DA) disminuye luego aumenta después de la administración de neurotoxina 2,3, mientras que el número de TH immunonegative (TH) neuronas muestra el patrón opuesto (es decir, aumenta luego disminuye 3). Esto es consistente con la pérdida de entonces ganancia de la 'DA fenotipo' por algunas células. El número de neuronas TH + y TH SNc También se ha demostrado que cambiar en direcciones iguales pero opuestas después de diversos tratamientos que alteran la actividad eléctrica de estas células a 4,5. Por ejemplo, la infusión de la pequeña conductancia, potasio activado por calcio (SK) canal apamina antagonista en cerebro medio durante 2 semanas disminuye el número de TH + y aumenta (en la misma cantidad) la numbre de TH SNc neuronas 4,5. En contraste, la infusión de la SK agonista de canal de 1 EBIO aumenta el número de TH + y disminuye (en la misma cantidad) el número de neuronas TH SNc 4,5. Se observaron cambios similares después de una gran variedad de tratamientos dirigidos actividad neuronal SNc, incluyendo algunos que dirige impulsos aferentes 4. Esta aparente regulación del número de neuronas SNc DArgic por la actividad neuronal aferente de entrada y plantea la posibilidad de que el medio ambiente o el comportamiento pueden influir en el número de neuronas del SNC. De hecho ratones adultos expuestos a diferentes ambientes tienen más o menos cerebro medio (SNc y VTA) TH + neuronas, y al menos algunos de estos cambios inducidos por el medio ambiente se abolido por el bloqueo simultáneo de entrada sináptica en el cerebro medio 6. Los objetivos de esta comunicación son: (1) proporcionar más detalles sobre la forma de aplicar nuestras manipulaciones ambientales e infusiones de drogas; y (2) proporcionar más datos que apoyan nuestra afirmación de que el embiente regula el número de neuronas DA del cerebro medio, a través de los impulsos aferentes.

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Instituto Florey del Comité de Ética de Salud Animal Neurociencia y Salud Mental y se ajustan a Nacional de Salud de Australia y el Consejo de Investigación Médica publica código de prácticas para el cuidado y uso de animales para fines científicos (7ª edición, 2004).

1. Las manipulaciones ambientales

  1. El emparejamiento de Género
    1. Use la madurez sexual (> 8 semanas de edad), hombres de la misma edad y ratones hembras.
      NOTA: normalmente utilizamos ratones C57BL / 6, pero hemos tenido los mismos resultados utilizando ratones Swiss en este protocolo. Utilizamos típicamente n = 8 hombres y n = 8 hembras para cada experimento, dividida en n = 2 pares entre varones (n = 4 machos), n = 2 pares hembra-hembra (n = 4 mujeres), y n = 4 parejas hombre-mujer (n = 4 machos y 4 hembras = n).
    2. A su llegada a las instalaciones de confinamiento de los animales, el grupo de la casa los ratones por género para> 3 días para aclimatarse. Aquí y througHout el emparejamiento de género, a mantener los estímulos ambientales extraños (por ejemplo, la temperatura ambiente, la luz: oscuridad ciclo, alimentos, agua, manejo y limpieza) constante o distribuir por igual a todos los ratones.
    3. Aleatoriamente asignar cada ratón a un par macho-macho, un par hembra-hembra, o un par masculino-femenino. Coloque cada par en una jaula limpia en el aislamiento (2 ratones / jaula) con acceso ad libitum a comida y agua, y simplemente alojarlos en esta manera de forma continua durante 7 días.
      NOTA: la cría de animales de rutina está bien durante este periodo, pero se debe distribuir por igual a todos los ratones. Tenga cuidado de evitar el emparejamiento de camada masculinos y femeninos.
  2. Enriquecimiento Ambiental
    1. Utilice (> 8 semanas de edad), hombres o mujeres ratones de la misma edad sexualmente maduros.
      NOTA: Por lo general utilizamos n = 18 ratones para cada experimento, divididos en grupo n = 6 / tratamiento.
    2. A su llegada a las instalaciones de confinamiento de los animales ellos mantener encuentra alojada en grupo en la norma idéntica (SH) (por ejemplo, Ver más abajo) las condiciones en esta etapa durante> 3 días para aclimatarse. Aquí y en todo el experimento, mantener los estímulos ambientales extraños (por ejemplo, la temperatura ambiente, la luz: oscuridad ciclo, alimentos, agua, manejo y limpieza) constante o distribuir por igual a todos los ratones.
    3. Para comenzar con el enriquecimiento ambiental, asignar aleatoriamente cada ratón a uno de los 3 grupos: SH; rueda de correr (RW), o el medio ambiente enriquecido (EE) y coloque cada grupo de ratones juntos en una jaula limpia idéntica con acceso ad libitum a comida y agua.
      NOTA: Aquí, jaulas más grandes de ratas celebración para todos los grupos, que miden 27 cm de ancho, 42 cm de largo y 16 cm de profundidad se utilizaron.
      1. Además, proporcionará las siguientes condiciones ambientales para cada grupo: SH comprende sólo la basura (pellets de papel o serrín) en el suelo; RW comprende SH más 2 ruedas de funcionamiento; EE comprende RW además de juguetes (cuerdas, escaleras, túneles, y objetos como rollos y trozos de papel de seda de toallas de papel vacío) con el que a explore, jugar, trepar, esconderse, y el nido.
      2. Casa ellos de esta manera de forma continua durante 14 días.
        NOTA: la cría de animales de rutina está bien durante este periodo, pero se debe distribuir por igual a todos los ratones.
    4. Ratones EE Sujeto a 'super-enriquecimiento' adicional (SE) colocándolos juntos en una jaula más grande que contiene nuevos juguetes para 1 hora / día (la misma hora cada día), 5 días / semana.
      NOTA: Aquí, se utilizó una tina de plástico 46 cm de ancho, 69 cm de largo y 40 cm de profundidad.
      1. Mantener la novedad al presentar un conjunto diferente de juguetes cada sesión. Limpie los juguetes que se van a volver a ser presentados a los ratones con agua jabonosa y etanol al 80% para eliminar los olores.
      2. Después de cada sesión de SE, devolver los ratones a su jaula EE. SH Mango y ratones RW igual que los ratones SE (a excepción de SE en sí) a lo largo de este período (por ejemplo, eliminar y volver cada SH y el ratón RW desde y hacia su jaula).

2. Bomba osmótica y Cerebro cánula de infusión Implantes de Medicamentos de infusión

  1. Preparación
    1. Utilice bombas osmóticas estériles y kits de infusión de cerebro, que están disponibles comercialmente. El día antes de la implantación, utilizando una técnica aséptica, primos los implantes llenando cada bomba, tubo y la cánula de conectar con una solución de fármaco o vehículo estéril (como se describe en las instrucciones suministradas con las bombas). Conectarlos entre sí y se incuba en solución salina estéril durante la noche a 37 ° C. Incubar implantes drogas y vehículos llenos por separado para evitar la contaminación cruzada.
  2. Cirugía.
    NOTA: En función del país del experimentador, se requieren permisos o autorizaciones de experimentación de animales especiales para perseguir ese tipo de cirugía y experimentos postoperatorias.
    1. Esterilizar todo el equipo quirúrgico y emplear una técnica aséptica en todo. Anestesiar el ratón (por ejemplo, utilizando 2.1% isofluorano en el aire) y colocarlo en un estéreocastillete otaxic. Compruebe la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento y administrar más anestésico si es necesario (por ejemplo, ausencia de retirada extremidad para pizca pata nociva es indicativo de una anestesia adecuada). Asegurar los ojos están protegidos de la desecación por pomada ocular lubricante, y que la temperatura corporal del ratón sigue siendo normal durante todo el procedimiento.
    2. Hacer una incisión en la línea media a través de la piel a partir de entre los ojos y acabado de 2 cm por detrás del borde posterior del cráneo. Blunt diseccionar la piel lejos de la fascia subyacente en la parte posterior del ratón para crear un subcutánea 'bolsillo' lo suficientemente grande como para caber cómodamente la bomba y el tubo de conexión una vez se implanta la cánula (el tubo de conexión no debe estar doblada sobre la terminación). Raspe borrar la fascia de más de la cara dorsal del cráneo.
    3. El uso de una fresa dental de aproximadamente 1,5 mm de diámetro, profundizar en el cráneo en el estereotáxica apropiado coordina uasta una capa delgada, flexible de restos óseos. Peel esta capa de distancia utilizando unas pinzas finas (esto evita dañar la duramadre subyacente y el cerebro con la fresa dental). Asegúrese de que el cráneo se limpió de cualquier fragmento de sangre y hueso, y no que hay más sangrando.
    4. Con la cánula en manos de un portador de cánula, coloque la bomba y el tubo de conexión en el 'bolsillo' subcutánea que recubre la parte posterior del ratón. A continuación, la posición de la punta de la cánula en las coordenadas estereotáxicas apropiadas y en la superficie del cerebro. Baje con cuidado la cánula en el cerebro, pero dejar de aproximadamente 1 mm de cortos de la profundidad requerida.
      NOTA: La profundidad restante se negoció después de la aplicación de la primera capa de acrílico dental.
    5. Asegúrese de nuevo la superficie del cráneo esté limpia y seca, y luego preparar un pequeño volumen de acrílico dental y usar un palillo de dientes para alisarlo sobre toda el área expuesta de cráneo, incluidos en la rebaba-agujero a través del cráneo alrededor ªe cánula. Antes de que el acrílico se endurece, baje la cánula de punta la profundidad restante en el objetivo.
    6. Se prepara otro pequeño volumen de acrílico dental y la capa de esto sobre el primero, así como sobre el soporte plástico blanco para la cánula, para fijar la cánula en su lugar. Repita con capas adicionales de acrílico como necesario.
    7. Una vez que el acrílico ha endurecido, retirar con cuidado el soporte de cánula y cortar el plástico pestaña cánula extraíble blanco con una hoja de bisturí calentado con una llama de butano. Por último, suturar la piel cerrado sobre todo el implante.
  3. Tratamiento post-quirúrgico de los Animales
    1. Aplicar ungüento antiséptico a los márgenes de la piel, y administrar un anti-inflamatorio para el ratón (por ejemplo, Meloxicam, 3 mg / kg sc). Retire el ratón desde el marco, colocarla bajo una lámpara de calor, y observar hasta que se recupera la conciencia. No devuelva un ratón que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.
      NOTA: Expmanipulaciones erimental como el emparejamiento entre los géneros y el enriquecimiento medio ambiente se pueden iniciar o reanudar el día después de la cirugía a la mayor brevedad.
    2. Controlar su peso corporal, el comportamiento y el aspecto general diaria. Tratar signos de infección (por ejemplo, hinchazón, enrojecimiento, pus) alrededor de las incisiones quirúrgicas con ungüento antiséptico tópico. Tratar cualquier signos de enfermedad, el dolor, el estrés o malestar (por ejemplo, pérdida de> 10% del peso corporal, el aislamiento social, la falta de preparación, "esponjar", disfunción del movimiento, convulsiones) con analgésicos y / o antibióticos sistémicos como necesario.
    3. La eutanasia a los ratones si la pérdida de peso> 15% o síntomas de la enfermedad, el dolor, el estrés o malestar no son recuperables dentro de 1 semana de tratamiento curativo.

3. Tejido Cerebral Preparación, producción inmunohistoquímica, y Estereología

  1. Perfusión
    1. Inmediatamente después de manipulaciones / drogas ambientales, preparar el cerebro para el estudio.
      NOTA: En los experimentos publicados aquí se mide y se compara en cada uno de los diferentes grupos de tratamiento el número de TH + SNc neuronas.
    2. Primera administrar una sobredosis de anestesia para matar los ratones (por ejemplo, 100 mg / kg ip de sodio pentobarbital). Una vez anestesiado, pero antes de que el corazón deja de latir, poner el ratón sobre su espalda y corbata o precisar ambas extremidades anteriores.
    3. Usando un escalpelo cortó la piel que recubre el tórax entonces incise a través del músculo justo debajo de la caja torácica en la cavidad abdominal. Coloque una abrazadera en el proceso xifoides de la caja torácica y levantar la caja torácica hacia arriba y lejos del hígado exponer el diafragma.
    4. Corte a través del diafragma y por medio de las costillas lateralmente en ambos lados con grandes tijeras hasta que la caja torácica se puede plegar hacia atrás la cabeza para exponer los pulmones y el corazón. Con unas tijeras finas hacen una pequeña incisión en la aurícula derecha como un punto de salida para la sangre y soluciones perfundidos, luego se corta a través de la base de la Ventri izquierdaCLE y colocar una cánula a través del ventrículo izquierdo, la aurícula izquierda, y en la aorta.
    5. Sujetar la cánula en su lugar a continuación, la bomba caliente (37 ° C) heparinización y 0,1 M tampón fosfato salino fisiológico (PBS) a través de la vasculatura hasta que la solución que sale de la aurícula derecha es totalmente libre de sangre. A continuación, la bomba de frío (4 ° C) solución de fijación (tales como 4% de paraformaldehído en PBS) a través de la vasculatura hasta que todo el ratón está bien fijado. Retire el cerebro y el lugar en PBS con 30% de sacarosa durante 2-3 días hasta que los sumideros cerebrales.
      NOTA: Otros tipos de preparación de tejidos podrían aplicarse en función de la experiencia en el laboratorio correspondiente.
  2. Preparación de criosecciones de flotación libre
    1. Cortar secciones de serie a través de las regiones cerebrales de interés y recoger estos en PBS.
      NOTA: Cortamos 40 micras de espesor secciones usando un criostato. Otros tipos de seccionar los tejidos podrían aplicarse en función de la experiencia en el corresponding de laboratorio.
  3. La inmunohistoquímica
    1. Realizar inmunohistoquímica estándar para proteínas de interés. Incubar las secciones en 5% de suero normal de cabra y 0.3% de Triton X-100 en PBS a temperatura ambiente durante 30 min, a continuación, inmunorreaccionan con policlonal de conejo anti-TH (1: 400) a 4 ° C durante 48 horas, a continuación, policlonal de cabra anti biotinilado -rabbit (1: 1000) a temperatura ambiente durante 2 hr.
    2. A continuación, se incuban en avidina-peroxidasa (1: 500) a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, en cobalto y diamino-bencidina níquel-intensificado (0,5 mg / ml) a temperatura ambiente durante 18-20 min; para el último 3-5 min de la incubación diamino-bencidina añadir peróxido de hidrógeno (0,01%) para catalizar la precipitación cromógeno. Lavar las secciones tres veces durante 10 minutos cada uno en PBS antes de, después de, y entre cada uno de los pasos anteriores.
    3. Montar las secciones en portaobjetos gelatinizados, aire los seque, luego mancha Nissl (rojo neutro), deshidratar en alcohol, claro (X-3B), y tapar.
  4. Estereología
    1. Estimar el número total de neuronas TH + y TH SNc (LC y VTA) y usando métodos estereológicos imparciales. Asegúrese de que el stereologist es ciega al tratamiento recibido. Excluir glia sobre la base de diámetro soma <5 micras y contar sólo aquellas células con un núcleo visible.
    2. Identificar la SNC (y VTA y LC) por las localizaciones espaciales de células TH + y referencias anatómicas / límites de acuerdo con el atlas del cerebro de Paxinos y Watson 7. Contar + células TH dentro de un marco de cuenta (55 x 55 micras = 3,025 micras 2) a intervalos predeterminados regulares (x = 140 m, y = 140 m para SNc; x = 100 m, y = 100 m para VTA y LC) a través de cada núcleo en cada cuarta sección.

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Resultados

Los ratones adultos sometidos a estas manipulaciones ambientales han alterado los números de cerebro medio (SNC y VTA), pero no LC, neuronas TH +, y EE más infusión cerebro medio concurrente de ambos picrotoxina o bicuculina (GABA antagonistas del receptor) suprime EE-inducción de más SNc TH + neuronas. Estos datos fueron publicados previamente en 6. Los datos actuales se compilaron en replicar experimentos realizados como parte de ese estudio previo, pero no se han publicado en otros lugares.

...

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Discusión

Manipulaciones ambientales

La motivación detrás del diseño de estas manipulaciones ambientales (emparejamiento de género y de enriquecimiento ambiental) fue determinar si el medio ambiente y / o la conducta motivada por el medio ambiente, se asocia con cambios en el número de neuronas DA mesencéfalo. La atención se centró por tanto en proporcionar entornos y estimular comportamientos que son propensos a participar señalización DA mesencéfalo. Estos maridaje incluido con el sexo opue...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el 1022839 de subvenciones del Proyecto del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (NHMRC). AJH es un FT3 Future Fellow (FT100100835) del Consejo Australiano de Investigación (ARC). El Instituto Florey de Neurociencia y Salud Mental agradece el apoyo de la Subvención de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno de Victoria.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IsofluoranoBaxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, AustraliaAHN3640
Bomba osmótica ALZET 1002DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-05300004317
ALZET Kit de infusión cerebral 1DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-05300004760
Soporte para cánula ALZET 1DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-05300008860
Vertex Monomer Autopolimerizable (disolvente acrílico dental)Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Países Bajosn/a
Vertex Self Curing (polvo acrílico dental)Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Países Bajosn/a
METACAM (Meloxicam)Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 AustraliaL10100
Pentobarbitona sódicaLethabarb, Virbac, Milperra, Nueva Gales del Sur, Australia571177
Suero de cabra normalchemicon-temecula, CAS26 litros
Triton X-100Sede de Merck Millipore , 290 Concord road, Billerica, MA 018211.08603.1000
Conejo policlonal anti-tirosina hidroxilasaSede de Merck Millipore , 290 Concord road, Billerica, MA 01821AB152
Cabra biotinilada policlonal anti-conejoDako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060EO432
Avidin peroxidasaSigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AUA3151-1mg
Diamino-bencidinaSigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AUD-5637
Investigador estereoscópicoMicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495n/a

Referencias

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